鐵原毓，文軍琴，田 潔,2 *

（1.青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院/青海省蔬菜遺傳與生理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810016；2.省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810016）

0 引言

【研究意義】果聚糖（Fructan）為水溶性非還原性多糖，是由蔗糖與1個(gè)或多個(gè)果糖基連接而成的聚合物[1]。果聚糖作為15%被子植物中主要的貯藏性碳水化合物，其代謝與滲透調(diào)節(jié)、源庫(kù)關(guān)系調(diào)節(jié)、抗逆性等生理活動(dòng)密切相關(guān)。目前已發(fā)現(xiàn)植物中的果聚糖主要有5種類(lèi)型，其中大蒜果聚糖屬于菊糖型果聚糖新生系列。果聚糖：果聚糖6G-果糖基轉(zhuǎn)移酶（6G-FFT）是其合成過(guò)程所必需的酶，能夠發(fā)生特異性反應(yīng)，催化1-蔗果三糖生成新蔗果三糖[2]。植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)已廣泛應(yīng)用于基因工程育種，以改善作物品質(zhì)、提高作物產(chǎn)量、培育植物新品種等。目前轉(zhuǎn)基因技術(shù)最為廣泛和成熟的方法主要是農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，但農(nóng)桿菌所攜帶含有目的基因的T-DNA區(qū)域是隨機(jī)插入受體植物基因組中，因而得到的轉(zhuǎn)基因植株通常含有一個(gè)或多個(gè)拷貝的外源基因[3]。而轉(zhuǎn)基因植物中外源基因的拷貝數(shù)是影響其表達(dá)水平及穩(wěn)定遺傳的關(guān)鍵因素，多拷貝的外源基因會(huì)直接導(dǎo)致基因沉默或不能穩(wěn)定表達(dá)[4]，因此，篩選單拷貝外源基因的轉(zhuǎn)基因植株對(duì)后續(xù)遺傳穩(wěn)定性起關(guān)鍵性作用。【前人研究進(jìn)展】近年來(lái)，對(duì)果聚糖代謝調(diào)控基因的功能研究已成為熱點(diǎn)。在菊苣中轉(zhuǎn)化洋蔥6G-FFT基因后，發(fā)現(xiàn)菊苣中含有菊糖型果聚糖新生系列[5]。Gadegaard等[6]將洋蔥中的6G-FFT轉(zhuǎn)入黑麥草中，發(fā)現(xiàn)果聚糖積累量比對(duì)照高3倍。何娜等[7]克隆蘆筍Ao6G-FFT基因，對(duì)其序列特征進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其啟動(dòng)子區(qū)域存在響應(yīng)非生物脅迫的元件。此外，前人研究檢測(cè)外源基因拷貝數(shù)常采用Southern blot技術(shù)，但其價(jià)格昂貴、耗時(shí)較長(zhǎng)、靈敏度較低[8]。近年來(lái)，研究人員開(kāi)始利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)外源基因拷貝數(shù)，如王育花等[9]通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)了轉(zhuǎn)基因水稻中外源基因拷貝數(shù)，在8株檢測(cè)植株中，得到1株單拷貝的植株。裘劼人等[10]利用SYBR Green實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因擬南芥中外源基因拷貝數(shù)，發(fā)現(xiàn)該法計(jì)算所得拷貝數(shù)與傳統(tǒng)高準(zhǔn)確性的Southern blot法結(jié)果相符。蘇慧慧等[11]利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因櫻桃番茄中外源基因拷貝數(shù)，發(fā)現(xiàn)12株轉(zhuǎn)基因植株內(nèi)整合的拷貝數(shù)為0～20不等，且其中4株在普通PCR中存在假陽(yáng)性?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，方便快捷、靈敏性強(qiáng)、成本低的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)外源基因拷貝數(shù)的技術(shù)逐漸被廣泛應(yīng)用。但鮮見(jiàn)有關(guān)大蒜As6G-FFT基因轉(zhuǎn)入煙草的研究報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究將從大蒜中克隆的As6G-FFT基因轉(zhuǎn)入煙草中，獲得轉(zhuǎn)As6G-FFT基因煙草，然后分別提取測(cè)定14株轉(zhuǎn)基因煙草葉片的DNA、RNA及果聚糖含量，以從DNA、RNA及生理水平鑒定陽(yáng)性單拷貝As6G-FFT轉(zhuǎn)基因煙草，以期為篩選單拷貝的轉(zhuǎn)As6G-FFT基因煙草提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

以組培苗移栽后生長(zhǎng)30 d的野生型煙草K326和轉(zhuǎn)As6G-FFT基因煙草為試驗(yàn)材料，取二者的幼嫩葉片速凍于液氮中，置于?80 ℃超低溫冰箱中保存，用于基因組DNA和RNA的提取以及果聚糖含量測(cè)定。轉(zhuǎn)As6G-FFT基因煙草和野生型煙草 K326均為青海省蔬菜遺傳與生理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

利用新型植物基因組DNA提取試劑盒和TRNzol Universal試劑（北京天根生化科技有限公司）進(jìn)行總 DNA 和 RNA 的提取，采用 Honor? Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix 和 Unique Aptamer? qPCR SYBR?Green Master Mix（北京諾禾致源科技股份有限公司）進(jìn)行qRT-PCR分析。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因煙草鑒定和熒光定量分析所用引物均使用Primer 5軟件設(shè)計(jì)，引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。

1.3 轉(zhuǎn) As6G-FFT 基因煙草 PCR 檢測(cè)

采用新型植物基因組DNA提取試劑盒提取1株野生型煙草K326和14株轉(zhuǎn)As6G-FFT基因煙草葉片的基因組DNA，以其為模板，以As6G-FFT-clone為引物（表1），通過(guò)PCR擴(kuò)增鑒定As6G-FFT基因是否導(dǎo)入煙草基因組。擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度約為1 839 bp，PCR 反應(yīng)體系為 2×TaqPCR Mix 12.5 μL，cDNA 模板 1 μL，上下游引物各 1 μL，ddH2O 9.5 μL；反應(yīng)程序?yàn)?94 ℃ 預(yù)變性 5 min；94 ℃ 變性 30 s，56 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸 2 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸 10 min，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.4 轉(zhuǎn) As6G-FFT 基因煙草表達(dá)量分析

為了分析As6G-FFT基因在RNA水平的表達(dá)情況，對(duì)經(jīng)PCR鑒定呈陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行As6G-FFT轉(zhuǎn)錄水平分析。利用TRNzol Universal提取總RNA，檢測(cè)RNA的質(zhì)量和濃度后，檢測(cè)合格的RNA 樣 品 利用 Honor? Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR 反轉(zhuǎn)錄為 cDNA。以測(cè)試煙草的cDNA為模板，以煙草Actin基因特異引物NtACT和大蒜6G-FFT基因特異引物As6G-FFT對(duì)各樣本一起進(jìn)行擴(kuò)增，引物序列詳見(jiàn)表1。反應(yīng)體系為Unique Aptamer Green Matser Mix 10 μL，cDNA 模板 1 μL，上下游引物各 0.6 μL，ddH2O 7.8 μL；反應(yīng)程序?yàn)?94 ℃預(yù)變性 5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸 10 min，重復(fù) 3 次。

1.5 轉(zhuǎn) As6G-FFT 基因煙草果聚糖含量測(cè)定

果聚糖的提取及含量測(cè)定參考田潔等[12]的方法進(jìn)行。利用高效液相色譜儀（日本島津RID-10A）進(jìn)行測(cè)定，采用 Shodex SUGAR KS-801 串 KS-802 色譜柱，示差檢測(cè)器，以超純水作為流動(dòng)相，流速為1 mL·min?1，柱溫箱溫度為 80 ℃，進(jìn)樣量為 5 μL。通過(guò)碳水化合物組分的標(biāo)準(zhǔn)品及外標(biāo)法進(jìn)行定量分析，各組分含量單位以 mg·g?1DW 表示。

1.6 As6G-FFT 和 NtACT 基因標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

選擇煙草Actin基因[13]作為內(nèi)源參照基因進(jìn)行拷貝數(shù)估算，參照王盛等[14]的方法，利用SYBR Green實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因煙草植株中外源As6G-FFT基因的拷貝數(shù)。以野生型煙草K326的基因組DNA為內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)品，紫外分光光度計(jì)測(cè)得質(zhì)量濃度為 0.040 6 μg·μL?1，將其進(jìn)行 5 倍梯度稀釋?zhuān)♂尡稊?shù)分別為50、51、52、53和54，使用NtACT引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。同時(shí)以含有As6G-FFT基因的質(zhì)粒為外源基因標(biāo)準(zhǔn)品，紫外分光光度計(jì)測(cè)得質(zhì)量濃度為 0.035 6 μg·μL?1，將其進(jìn)行 5 倍梯度稀釋?zhuān)♂尡稊?shù)同上，后使用As6G-FFT引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系與程序同1.4，最后制作內(nèi)參基因和外源基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.7 轉(zhuǎn)基因煙草中內(nèi)參基因和外源基因的定量分析

以1株野生型煙草和14株P(guān)CR檢測(cè)為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)As6G-FFT基因煙草植株基因組DNA為模板，對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草中As6G-FFT基因表達(dá)進(jìn)行定量分析。使用As6G-FFT引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，設(shè)1個(gè)空白對(duì)照，每個(gè)樣品3次技術(shù)重復(fù)，同時(shí)，分別以14株轉(zhuǎn)As6GFFT基因煙草植株和1株WT煙草植株的基因組DNA為模板，對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草中內(nèi)參基因表達(dá)進(jìn)行定量分析。使用NtACT引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，設(shè)1個(gè)空白對(duì)照，每個(gè)樣品3次技術(shù)重復(fù)。反應(yīng)體系與程序同1.4。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn) As6G-FFT 基因煙草 PCR 檢測(cè)

選取轉(zhuǎn)基因煙草幼嫩葉片進(jìn)行基因組DNA的提取，經(jīng)質(zhì)檢合格后，使用As6G-FFT基因克隆引物（表1）對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示14個(gè)轉(zhuǎn)基因煙草葉片均能擴(kuò)增出目的片段，而野生型煙草中未檢測(cè)到目的條帶（圖1），說(shuō)明14個(gè)轉(zhuǎn)基因煙草株系中已成功轉(zhuǎn)入目的基因As6G-FFT。

圖1 轉(zhuǎn)As6G-FFT基因煙草PCR檢測(cè)Fig.1 PCR detection of As6G-FFT in transgenic tobacco plants

2.2 轉(zhuǎn) As6G-FFT 基因煙草表達(dá)量分析

為了分析轉(zhuǎn)基因煙草中As6G-FFT基因的表達(dá)水平，以組培苗移栽后30 d煙草葉片為材料，提取14個(gè)轉(zhuǎn)基因煙草株系和野生型煙草葉片的RNA并反轉(zhuǎn)為cDNA，然后利用qRT-PCR技術(shù)分析As6GFFT基因的表達(dá)量（圖2）。結(jié)果顯示，與WT相比，14個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中有7個(gè)株系（N3、N4、N5、N9、N10、N11、N14）表達(dá)量極其顯著上升（P＜0.001），其余7個(gè)株系均達(dá)到極顯著上升水平（P＜0.01）?？傮w而言，轉(zhuǎn)基因株系中的As6G-FFT基因表達(dá)量比野生型高1.17～215.13倍。表明將大蒜As6G-FFT基因過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)入煙草后轉(zhuǎn)基因煙草株系中As6G-FFT基因表達(dá)量呈極顯著水平上升。

圖2 轉(zhuǎn)As6G-FFT基因煙草的基因表達(dá)量Fig.2 As6G-FFT expressions in transgenic and wild-type tobacco plants

2.3 轉(zhuǎn) As6G-FFT 基因煙草果聚糖含量測(cè)定

進(jìn)一步測(cè)定14個(gè)轉(zhuǎn)As6G-FFT基因煙草株系的果聚糖含量（圖3）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，14個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的果聚糖含量都高于野生型煙草，其中有13個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的果聚糖含量呈極其顯著升高（P＜0.001），1個(gè)轉(zhuǎn)基因株系（N7）的果聚糖含量顯著升高（P＜0.01），而野生型煙草中幾乎沒(méi)有果聚糖。轉(zhuǎn)基因株系的果聚糖含量比野生型顯著提高了1.51～10.47倍。以上結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因煙草中As6G-FFT催化了果聚糖的合成。

圖3 轉(zhuǎn)As6G-FFT基因煙草的果聚糖含量Fig.3 Fructan contents in transgenic and wild-type tobacco plants

2.4 轉(zhuǎn)基因煙草中 As6G-FFT 基因拷貝數(shù)測(cè)定

2.4.1As6G-FFT和NtACT基因?qū)崟r(shí)熒光定量 PCR 的標(biāo)準(zhǔn)曲線 轉(zhuǎn)基因植物中外源基因的拷貝數(shù)是影響其表達(dá)水平及穩(wěn)定遺傳的關(guān)鍵。因此，本研究利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，以煙草Actin基因?yàn)閮?nèi)參，建立As6G-FFT基因拷貝數(shù)鑒定方程。根據(jù)Ct值與對(duì)應(yīng)模板拷貝數(shù)對(duì)數(shù)值間的線性關(guān)系，以Ct值為橫坐標(biāo)、起始模板拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，分別獲得內(nèi)參基因和外源基因標(biāo)準(zhǔn)品實(shí)時(shí)熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖4）。As6G-FFT基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=?0.290 7x+3.014 5（R2=1），NtACT基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=?0.281 3x+8.014 1（R2=1）。兩個(gè)基因標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)均接近于1，表明檢測(cè)樣品所得的結(jié)果準(zhǔn)確可信。

圖4 As6G-FFT和NtACT基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Real-time fluorescent quantitative PCR standard curves of As6G-FFT and NtACT

2.4.2As6G-FFT和NtACT基因?qū)崟r(shí)熒光定量 PCR 熔解曲線As6G-FFT和NtACT基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR熔解曲線如圖5所示，As6G-FFT和NtACT基因熔點(diǎn)分別為83.70和80.17，熔解曲線均為單峰，說(shuō)明引物特異性強(qiáng)，在反應(yīng)中無(wú)引物二聚體等非特異性擴(kuò)增，即測(cè)得的試驗(yàn)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可信。

圖5 As6G-FFT和NtACT基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR的熔解曲線Fig.5 Real-time fluorescent quantitative PCR melting curves of As6G-FFT and NtACT

2.4.3As6G-FFT和NtACT基因?qū)崟r(shí)熒光定量 PCR 擴(kuò)增曲線 外源基因As6G-FFT的擴(kuò)增結(jié)果如圖6-A所示，除空白對(duì)照未擴(kuò)增出熒光曲線外，其余被測(cè)的煙草植株樣品均擴(kuò)增出熒光曲線，表明樣品未被污染，檢測(cè)結(jié)果可信。內(nèi)參基因NtACT的擴(kuò)增結(jié)果如圖6-B所示，轉(zhuǎn)基因煙草植株樣品均擴(kuò)增出熒光曲線，而野生型煙草植株和空白對(duì)照均未擴(kuò)增出熒光曲線。

圖6 As6G-FFT和NtACT基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR的擴(kuò)增曲線Fig.6 Real-time fluorescent quantitative PCR amplification curves of As6G-FFT and NtACTs

2.4.4 轉(zhuǎn)基因煙草中As6G-FFT基因拷貝數(shù)計(jì)算 對(duì)14株P(guān)CR檢測(cè)為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)As6G-FFT基因煙草植株和1株野生型煙草植株的As6G-FFT和NtACT基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析，所得Ct值和Tm值如表2所示。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算Ct值對(duì)應(yīng)模板濃度的對(duì)數(shù)值，再根據(jù)外源基因和內(nèi)參基因模板濃度對(duì)數(shù)值的比值絕對(duì)值估算出外源基因的拷貝數(shù)，計(jì)算結(jié)果如表2所示，檢測(cè)的14株轉(zhuǎn)As6G-FFT基因煙草植株的最低拷貝數(shù)為1，最高拷貝數(shù)達(dá)到3個(gè)，其中1拷貝單株數(shù)5株，占總轉(zhuǎn)基因株數(shù)的35.7%；2拷貝單株數(shù)7株，占總轉(zhuǎn)基因株數(shù)的50%；3拷貝單株數(shù)2株，占總轉(zhuǎn)基因株數(shù)的14.3%；而野生型煙草植株的As6G-FFT基因拷貝數(shù)為0。

表2 轉(zhuǎn)基因煙草中As6G-FFT基因拷貝數(shù)Table 2 Copy number of As6G-FFT in transgenic tobacco plants

3 討論與結(jié)論

植物遺傳轉(zhuǎn)化是農(nóng)作物改良和基因功能研究的常用試驗(yàn)方法。本研究在課題組前期工作基礎(chǔ)上，對(duì)轉(zhuǎn)As6G-FFT基因煙草T0代進(jìn)行了篩選與陽(yáng)性鑒定，共獲得14個(gè)陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因煙草株系。研究表明過(guò)表達(dá)植株后代中外源基因拷貝數(shù)是影響目的基因表達(dá)水平和遺傳穩(wěn)定性的主要因素，拷貝數(shù)越低，遺傳穩(wěn)定性越高。因此，獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株后，對(duì)其外源基因拷貝數(shù)進(jìn)行檢測(cè)分析具有重要意義。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)外源基因拷貝數(shù)是近幾年迅速發(fā)展起來(lái)的外源基因拷貝數(shù)檢測(cè)新方法，目前已在柑橘、煙草、玉米、水稻等多種作物中應(yīng)用[15?18]，其中 SYBR Green熒光染料由于成本低、簡(jiǎn)單易用、靈敏度高，而被廣泛采用[10,19?20]。本研究利用SYBR Green法成功對(duì)14個(gè)轉(zhuǎn)As6G-FFT基因煙草株系的As6G-FFT拷貝數(shù)進(jìn)行了實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，得出了As6G-FFT基因的整合特點(diǎn)，其中具有1、2和3個(gè)拷貝的單株數(shù)分別占植株總數(shù)的35.7%、50.0%和14.3%，且1～2個(gè)拷貝的單株數(shù)占整個(gè)轉(zhuǎn)基因植株的85.7%，這與文獻(xiàn)報(bào)道中提到的，農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化，一般外源基因以低拷貝（1～2）整合為主（占70%以上）的結(jié)果一致。Tan等[21]檢測(cè)15份轉(zhuǎn)基因植株拷貝數(shù)，其中1～2拷貝的單株數(shù)占總數(shù)的86.6%；Wen等[22]對(duì)26株轉(zhuǎn)基因柑橘進(jìn)行拷貝數(shù)分析，結(jié)果表明1～2拷貝整合數(shù)量占整個(gè)轉(zhuǎn)基因植株的73%；魏毅東等[23]對(duì)9個(gè)OsPIMT1轉(zhuǎn)基因水稻T0代植株進(jìn)行拷貝數(shù)檢測(cè)，其中6個(gè)為單拷貝，3個(gè)為雙拷貝；杜京堯等[24]采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)OsRhoGDI2轉(zhuǎn)基因水稻中的外源基因拷貝數(shù)，結(jié)果顯示OsRhoGDI2在過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因水稻中均為單拷貝。由此說(shuō)明采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)具有簡(jiǎn)單、高效、方便、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。此外，煙草是植物基因功能研究的模式植物，應(yīng)用該方法檢測(cè)并篩選單拷貝數(shù)的轉(zhuǎn)基因煙草，可為今后轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)研究提供一種新的檢測(cè)技術(shù)。

本研究首先采用基因組DNA擴(kuò)增的方法，檢測(cè)As6G-FFT基因是否均已穩(wěn)定整合到煙草基因組中，進(jìn)而采用定量PCR技術(shù)在轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)As6G-FFT在轉(zhuǎn)基因煙草中的表達(dá)水平。結(jié)果顯示As6G-FFT基因表達(dá)量水平顯著高于野生型；此外，分別提取了野生型和轉(zhuǎn)基因煙草中的果聚糖含量，發(fā)現(xiàn)果聚糖含量在轉(zhuǎn)基因煙草中的積累要顯著高于野生型。以上對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草在基因水平、轉(zhuǎn)錄水平及生理水平的分析結(jié)果均一致表明，As6G-FFT過(guò)表達(dá)載體已整合到煙草基因組。最后通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因煙草中As6G-FFT的拷貝數(shù)，發(fā)現(xiàn)外源As6G-FFT基因整合到煙草中的低拷貝（1～2）單株數(shù)占整個(gè)轉(zhuǎn)基因植株的85.7%。本研究分析鑒定了14個(gè)轉(zhuǎn)As6G-FFT基因煙草株系，獲得了低拷貝（1～2）的陽(yáng)性轉(zhuǎn)As6G-FFT基因煙草株系，為后續(xù)As6GFFT基因功能分析提供穩(wěn)定遺傳材料，同時(shí)也為植物外源基因拷貝數(shù)分析提供技術(shù)支撐。