邢 凱，翟麗維，侍玉梅，沈 奧，曹永春，王楚端*，白立景

（1.北京農學院動物科學技術學院，北京 102206；2.中國農業(yè)大學動物科學技術學院，北京 100193；3.中國農業(yè)科學院農業(yè)基因組研究所，廣東深圳 518120）

肝臟是動物機體最大的腺體器官，也是體內最重要的代謝器官，功能廣泛。在哺乳動物體內，肝臟在膽固醇代謝、氨基酸代謝、脂質代謝和體內能量的穩(wěn)態(tài)等方面發(fā)揮著重要功能。在豬上，肝臟則是極低密度脂蛋白的合成分泌、膽固醇的從頭合成、脂肪酸氧化的主要部位。還有研究發(fā)現，豬肝臟中也能進行少量的脂肪酸從頭合成?？梢?，肝臟在脂肪、膽固醇、脂蛋白等多種脂質的合成和代謝中發(fā)揮著主要作用。

轉錄組測序技術是一種基于高通量測序技術分析轉錄組表達的技術，具有靈敏度高、成本低、檢測范圍廣等特點。比較不同脂肪沉積能力豬肝臟的轉錄組測序結果是鑒定影響豬脂肪沉積關鍵基因的主要方法之一。吳正明等比較了肉質兼用型品種撒壩豬和瘦肉型豬杜洛克豬的肝臟轉錄組，發(fā)現等基因和PPAR 信號通路等通路在脂肪沉積過程中發(fā)揮了重要作用。Huang 等比較了金華豬和長白豬肝臟轉錄組，發(fā)現部分差異表達基因參與了氧化還原、脂質合成和代謝的過程。Sodhi 等比較了韓國本地豬和巴克夏豬肝臟的轉錄組，結果表明差異表達基因顯著富集在物質代謝、免疫應答和蛋白質綁定等過程。同時，轉錄組測序技術也應用于不同脂肪沉積能力豬肝臟組織轉錄組研究。Li比較了不同背膘厚度沂蒙黑豬的肝臟轉錄組，鑒定出CYP1A1/2、HMGCS2、ACSS2 和 UBE2L6 等基因為影響脂肪沉積的關鍵基因。Xing 等通過分別比較不同背膘厚度的長白豬和松遼黑豬肝臟轉錄組發(fā)現，差異表達基因主要參與了脂質代謝的過程。但是，不同研究間的結果并不盡相同。

本研究以不同背膘厚度長白豬和松遼黑豬肝臟轉錄組為研究對象，系統(tǒng)分析品種和背膘厚度對肝臟中基因表達的影響，以期鑒定豬肝臟中影響豬脂肪沉積的關鍵基因。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 本研究選擇了具有顯著差異背膘厚度的6 頭長白豬和松遼黑豬（每個品種內背膘厚高低個體各3 頭）為實驗動物。品種內背膘厚度高低個體間脂肪沉積能力差異極顯著。實驗動物屠宰后，采集肝臟組織樣品，立即保存于液氮用于后續(xù)實驗。

1.2 文庫的構建和測序 采用Trizol 法提取肝臟組織的總RNA。1% 瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop 檢測RNA的質量、濃度和純度。質量合格的RNA 用于反轉錄為cDNA，并構建測序文庫。文庫質檢合格后，在Illumina Hiseq 2000 平臺上進行雙端轉錄組測序。

1.3 測序數據的處理 使用軟件Trimmomatic刪除raw data 中接頭序列和低質量reads 后，獲得高質量clean reads 進一步用于后續(xù)分析。使用軟件Bowtie2建立豬基因組（Sscrofa 11.1,ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-99/fasta/sus_scrofa/dna/）索引。使用TopHat v2.0.1軟件將clean reads 比對到豬參考基因組上。使用HT-seq 軟件鑒定基因在不同樣本中的表達量。

1.4 差異表達基因分析 為分析品種和背膘厚度對肝臟中基因表達水平的影響，R 包DEseq2 被用于鑒定差異表達基因（Differentially Expression Genes,DEGs）。采用一般線性模型為y=breeding+backfat+breeding*backfat，其中breeding 為品種的效應；backfat 為背膘厚度的效應；breeding*backfat 為二者的交互作用。篩選條件為FDR<0.05 及|logFC|>1。

1.5 差異表達基因分析 為進一步分析DEGs 的生物學功能，在線分析平臺Omicshare Tools（https://www.omicshare.com/tools/）用 于DEGs 的GO 和KEGG 功能富集分析及可視化。value<0.05 通路和GO 條目為DEGs 顯著富集的通路。

2 結果

2.1 基因整體表達水平 測序數據經質控、比對到基因組上后，每個樣本平均獲得2.19×10條reads。這些reads 在12 個樣本中共被注釋到24 796 個基因上。通過相關性分析后發(fā)現，不同樣本間基因表達水平的相關性都在0.8 以上（圖1A），且其中的78.89%在4 個分組中都有表達（圖1B）。

圖1 基因的整體表達水平

2.2 差異表達分析 使用DESeq2 系統(tǒng)分組分析不同表型和品種對肝臟組織中基因表達的影響。以FDR<0.05及|logFC|>1 為篩選條件，在不同表型豬肝臟中共鑒定出差異表達基因395 個，其中厚背膘組豬肝臟中高表達基因177 個，薄背膘組豬肝臟中高表達基因218 個（圖2A）。以同樣的篩選條件，在不同品種豬肝臟中共鑒定出差異表達基因458 個，其中松遼黑豬肝臟中高表達基因134 個，長白豬肝臟中高表達基因324 個（圖2B）。

圖2 差異表達基因火山圖

2.3 差異表達基因功能富集分析 對不同表型豬肝臟中差異表達基因KEGG 通路功能富集分析，共鑒定出顯著富集的通路18 條（<0.05）。其中花生四烯酸代謝、谷胱甘肽代謝、P450 細胞色素代謝過程、脂肪酸代謝、胰島素抵抗、皮質醇的合成和分泌等通路影響脂質在體內的積累和代謝。

對不同豬種間差異表達基因進行KEGG 通路分析，發(fā)現26 條顯著富集的通路。其中PPAR 信號通路、新陳代謝通路、細胞色素P450 代謝通路、鞘糖脂生物合成通路、脂肪細胞內脂質分解調控通路、甘油三酯代謝通路、主要膽汁酸合成、MAPK 信號通路等在脂肪合成和代謝過程中發(fā)揮著重要作用。

通過GO 分析結果發(fā)現，不同表型間的差異表達基因顯著富集GO 條目94 條；不同品種間差異表達基因顯著富集GO 條目84 條。這些GO 條目主要參與了氧化還原酶的激活、脂肪酸鏈延長酶激活、脂肪酸生物合成、各種小分子的綁定、多種物質代謝的激活、免疫激活等過程。

3 討 論

肝臟是調控豬體內物質代謝最重要的器官之一，同時也調控著其體重和采食量。近年來，通過轉錄組測序技術挖掘肝臟中與豬重要經濟性狀相關基因的研究也越來越多。但是，多數研究只針對一對比較，影響因素較多，導致各研究之間的結果差異很大。本研究系統(tǒng)分析了不同背膘厚度的長白豬和松遼黑豬的肝臟轉錄組，采用DEseq2 中雙因素的方法鑒定差異表達基因，更好地剖分了不同分組之間的影響因素，減少了結果的假陽性。

在本研究中，395 個差異表達基因在不同表型豬肝臟組織中被檢測到。先前研究報道，肝臟主要參與脂肪降解的過程，并未參加脂肪酸從頭合成的過程。但是，本研究發(fā)現，3 個脂肪酸合成關鍵基因乙酰輔酶A 羧化 酶（Acetyl-CoA Carboxylase Alpha，）、ELOVL 脂肪酸延長酶 6（ELOVL Fatty Acid Elongase 6，）和酮戊二酸脫氫酶L（Oxoglutarate Dehydrogenase L，）在厚背膘組顯著高表達。ACACA 編碼乙酰輔酶A 羧化酶，催化乙酰輔酶A 轉化為丙二酰輔酶A，是脂肪酸從頭合成的限速步驟?；蚴浅L鏈脂肪酸延長和去飽和的關鍵基因。參與了三羧酸循環(huán)的過程，其為脂肪酸的從頭合成提供。這表明，豬肝臟中也可能發(fā)生了脂肪酸從頭合成的過程，進而影響了脂肪沉積的能力。肝臟中差異表達基因涉及了多種物質的代謝，如藥物、長鏈脂肪酸、外源物質、氨基酸等。這與肝臟在機體內解毒的生物學功能相一致。肉堿棕櫚酰轉移酶1A（Carnitine Palmitoyltransferase 1A，）、谷胱甘肽 S-轉移酶 omega 2（Glutathione S-transferase Omega 2，）、-谷氨酰轉移酶5（Gammaglutamyltransferase 5，）等基因，在多種物質的代謝中發(fā)揮著重要的作用?？梢源呋€粒體攝入長鏈脂肪酸，是長鏈脂肪酸氧化的限速步驟。當肝臟中表達水平較高時，可以增加脂肪酸的降解和減少機體脂肪的含量。和在谷胱甘肽代謝中發(fā)揮著重要作用。谷胱甘肽是種氧化還原緩沖劑，具有清除自由基、解毒、修復蛋白、合成DNA等多種免疫和抗氧化應激的功能。這些基因在薄背膘組豬肝臟中表達水平更高，表明其氧化脂肪酸的能力更強。是一個調控細胞營養(yǎng)內穩(wěn)態(tài)的轉錄因子，可以通過影響采食量來調控哺乳動物的脂質代謝。與本研究結果一致，肥胖組個體肝臟中基因的表達水平較高。這些表明，豬肝臟中脂肪的生成和分解過程都影響了脂肪沉積的多少。

圖3 不同表型豬肝臟中差異表達基因富集的通路

圖4 不同品種豬肝臟中差異表達基因富集的通路

圖5 差異表達基因顯著富集的GO 條目

松遼黑豬是一個培育品種，在生長性能和免疫性狀上與瘦肉型豬都有顯著的差異。在本研究中，松遼黑豬和長白豬肝臟間共檢測到458 個差異表達基因。差異表達基因等顯著富集到PPAR 信號通路。PPAR 信號通路是維持體內調控能量平衡、脂質代謝、細胞分化和增殖的關鍵通路。其中，編碼的蛋白是最豐富的脂滴蛋白，可以促進脂肪細胞內脂滴的生成。酶在線粒體中催化中鏈脂肪酸的氧化，并間接影響了甘油三酯的代謝。是甘油三酯的運輸蛋白。敲除基因的小鼠，增加了其甘油激酶的活性，促進了甘油三酯的生成，導致小鼠的肥胖和代謝障礙。是一個脂肪細胞因子，其紊亂可提高脂肪生成和抑制脂肪酸氧化引起脂肪肝、肥胖和胰島素抵抗。是核受體蛋白PPAR 家族中的一員，可調節(jié)細胞的脂肪酸氧化、線粒體功能、胰島素抵抗等。可見，PPAR 信號通路中關鍵基因的差異表達引起了不同品種豬間的脂肪沉積能力差異。這與上述同一品種中豬脂肪沉積能力差異的原因并不相同。同樣，不同品種豬肝臟中發(fā)現免疫相關基因差異表達，如：等。是T 淋巴細胞表達的共刺激分子，可以促進T 細胞的活化、增殖和產生細胞因子，對于調節(jié)性T 細胞存活和維持免疫穩(wěn)態(tài)至關重要。是一種通過糖基磷脂酰肌醇（GPI）錨定于細胞膜表面的補體調節(jié)蛋白,具有抑制同源補體攻膜復合物（MAC）形成和參與介導T 細胞活化等多種功能,進而保護宿主細胞。是一種誘導共刺激分子，優(yōu)勢表達在活化的T 細胞表面，在機體的免疫反應調節(jié)中發(fā)揮重要的生物學作用。是一種G 蛋白偶聯(lián)受體，主要參與免疫系統(tǒng)中T 細胞活化，介導細胞黏附、遷移及運動等。在癌癥中，能夠激活腫瘤干細胞，可促進癌細胞的增殖，并通過激活腫瘤細胞逃逸宿主免疫機制以抑制腫瘤細胞凋亡?；蛞卜Q原癌基因，其編碼蛋白在細胞增殖、分化和轉化的過程中發(fā)揮關鍵作用。它也可以通過細胞凋亡作用引起先天性全身性脂肪營養(yǎng)不良和增殖性筋膜炎。INF 是調節(jié)免疫應答過程中的細胞因子，在細胞抗病毒免疫中發(fā)揮重要的作用，其血清學水平與肝臟疾病的嚴重程度密切相關。以上這些基因在2個品種豬肝臟中表達的差異，可能引起了他們免疫性狀上的不同。

4 結 論

本研究系統(tǒng)分析了具有2 個品種內顯著差異脂肪沉積能力的松遼黑豬和長白豬的肝臟組織測序數據。不同表型間差異表達基因結果提示，等基因是肝臟中調控脂肪合成和代謝的關鍵基因；不同品種間差異表達基因分析表明，PPAR 信號通路改變了2 個品種間脂肪沉積能力，且等基因調控了免疫性狀。本研究對豬脂肪性狀的遺傳改良、肝臟功能解析有一定意義。