章會斌，韓 政，劉陽光，周 忍，陳一歌，許黎明，徐啟隆，殷宗俊*，張曉東*

（1.安徽農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，安徽合肥 230036；2.地方畜禽遺傳資源保護與生物育種安徽省重點實驗室，安徽合肥 230036）

白藜蘆醇（Resveratrol，RES）作為一種非黃酮類多酚化合物，廣泛參與細胞抗氧化作用，其甲基化類似物在豬卵巢顆粒細胞（Porcine Ovarian Granulosa Cells，pGCs）中表現(xiàn)出抑制作用，能影響顆粒細胞雌二醇及黃體酮的產(chǎn)生。此外已有研究證實RES 能促進大鼠卵巢膜間質細胞凋亡，損傷顆粒細胞形態(tài)并抑制細胞增殖?？勺兗艚樱ˋlternative Splicing，AS）普遍存在于高等生物體內，是一種常見的調節(jié)基因表達的機制。通過剪接基因產(chǎn)生多個mRNA，從而指導蛋白質發(fā)生結構及功能的多樣性變化。近年來，有學者針對畜禽基因可變剪接事件的鑒定和生信分析，揭示了可變剪接在動物體內的重要生理機制。研究發(fā)現(xiàn)，可變剪接可以通過調控信號通路中關鍵基因的轉錄，影響機體發(fā)育，并參與疾病的發(fā)生。在豬不同發(fā)育時期睪丸組織中鑒定到差異可變剪接基因與各時期的生理狀態(tài)有關，而北京鴨的皮脂中特有的可變剪接基因參與油脂合成，胸肌中發(fā)生可變剪接的基因與骨骼肌發(fā)育相關。

課題組前期已有研究指出，RES 可抑制pGCs 增殖，并對pGCs 凋亡產(chǎn)生影響?；诖?，本研究構建了RES 誘導pGCs 凋亡模型，首次通過轉錄組測序（RNA-seq）及生物信息學技術鑒定分析了RES 誘導pGCs 凋亡的可變剪接事件及差異可變剪接基因，有助于在分子水平進一步認識pGCs 凋亡的具體機制。

1 材料與方法

1.1 測序樣本的采集與制備 本實驗所用豬卵巢采集自某商業(yè)屠宰場180 日齡的三元雜交豬。豬只屠宰后立即采集、分離卵巢，并保存在37℃含500 IU/mL 青/鏈霉素的無菌生理鹽水中。2 h 內用保溫瓶運回實驗室備用。采用抽吸法收集卵泡液，并分離純化pGCs。將RES 溶解在二甲基亞砜（DMSO）中，制備0、25、50、75、100 μmol/L RES（RES 購自上海麥克林生化科技公司，純度≥99%）的完全培養(yǎng)基。將純化后的pGCs 接種至細胞培養(yǎng)板，待細胞在培養(yǎng)板內增殖到70%～80%的匯合度，更換含有已知濃度RES 的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2 細胞凋亡的檢測 在細胞加入RES 后的24 h 和48 h對pGCs 進行凋亡檢測。參考Annexin V-FITC/PI 雙染細胞凋亡檢測試劑盒說明書對pGCs 凋亡進行檢測，貼壁pGCs 用胰酶消化收集，用預冷PBS 洗滌2 次，棄上清。隨后加入5 μL Annexin V-FITC 染液，混勻后避光孵育15 min。再加入10 μL PI 染液混勻，再次孵育5 min 后，立即用流式細胞儀檢測pGCs 的凋亡。實驗重復3 次。

1.3 總RNA 的提取及轉錄組測序 采用TRIzol 法提取pGCs 的總RNA，利用Nanodrop 檢測RNA 濃度及純度，進一步利用Agilent 2100 bioanalyzer 檢測RNA 完整性。經(jīng)質檢合格后委托北京諾禾致源生物科技有限公司進行RNA-seq 文庫構建和測序。基于Illumina Hiseq 2500 測序平臺構建鏈特異性文庫。經(jīng)FastQC 軟件質控，去除帶接頭的序列（Reads）、低質量序列及無效堿基后，篩選得到純凈序列（Clean Reads）用于后續(xù)分析。使用HISAT2 軟件（v2.1.0）將Clean Reads 與豬參考基因組（v11.1）比對，以FPKM（Fragments Per Kilobase of transcript per Million mapped reads）作 為標準歸一化各組基因表達量。本文基于RNA-seq 數(shù)據(jù)鑒定發(fā)生在pGCs 中的可變剪接事件，研究參與pGCs凋亡的可變剪接基因。

1.4 可變剪接事件鑒定 通過rMATS 軟件（v4.0.2）對9 個樣本的可變剪接位點進行分析。rMATS 主要識別外顯子跳躍（Skipping Exon，SE）、內含子滯留（Retention Intro，RI）、外顯子互斥（Mutually Excl usive Exons，MXE）、5'端可變剪接（Alternative 5'Splici ng Site，A5SS）、3'端可變剪接（Alternative 3'Splicing Site，A3SS）等5 類可變剪接事件。此外對值進行錯誤發(fā)現(xiàn)率（False Discovery Rate，F(xiàn)DR）校正，F(xiàn)DR<0.01 作為判定可變剪接差異顯著性的閾值。

1.5 差異基因的GO 注釋和KEGG 通路分析 使用GOseq R 軟件包對差異基因進行基因本體（Gene Ontology，GO）富集分析，利用KOBAS（v2.0）軟件進行京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Gens and Genomes，KEGG）通路富集分析，并基于Edge R 軟件繪制差異可變剪接基因的火山圖。

1.6 實時熒光定量（qRT-PCR）檢測 隨機挑選6 個基因（），利用qRT-PCR 檢測其相對表達量。使用Primer Premier軟件（v5.0）設計引物，以作為內參基因，委托上海生物工程股份有限公司合成所需引物（引物序列見表1）。PCR 反應體系總體積為20 μL：iTaqUniversal SYBRGreen Super Mix 10 μL，上下游引物各0.4 μL（0.1 μg/μL），cDNA 模板1 μL，ddHO 8.2 μL。PCR 反應程序為：95 ℃預變性30 s；95 ℃5 s，61℃35 s（40 個循環(huán)）；97℃30 s，65℃90 s，97℃10 s。實驗在Bio-rad CFX96 Touch實時熒光定量PCR 儀中進行。

表1 實時熒光定量引物序列

1.7 統(tǒng)計分析 使用Excel 2010 整理數(shù)據(jù)，采用2法計算基因相對表達量，使用SPSS 軟件（v20.0）對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，方差分析和顯著性檢驗使用-test和one-way ANOVA 來進行分析，并在GraphPad 軟件上繪圖。

2 結果與分析

2.1 白藜蘆醇對豬卵巢顆粒細胞的影響 如圖1 所示，RES明顯誘導了pGCs 凋亡，并且當RES 濃度達到50 μmol/L時，與對照組相比差異極顯著。因此選取50 μmol/L 作為低濃度誘導凋亡處理組（標記為L），100 μmol/L 為高濃度誘導凋亡處理組（標記為H），分別與空白對照組（標記為C）做比較，探討RES 誘導pGCs 凋亡的差異基因表達。

圖1 不同濃度RES 對pGCs 的影響

2.2 數(shù)據(jù)產(chǎn)出與質控 pGCs 的9 個樣本經(jīng)Illumina PE150系統(tǒng)測序后，平均共產(chǎn)生90 510 724 個Raw Reads，去除帶adapter 的Reads、含未知堿基的Reads 以及成對的低質量Reads 后，平均每個樣本篩選到89 216 903 個Clean Reads（表2）。與豬的參考基因組（v11.1）平均比對率達96.04%上，測序總體錯誤率均在0.03%以內，其中高質量Clean Reads 的Q30 占比在94%以上，說明測序數(shù)據(jù)真實可靠。

表2 轉錄組測序數(shù)據(jù)及比對結果

2.3 基因表達趨勢分析 對3 組pGCs 中基因的表達模式進行聚類（<0.001），發(fā)現(xiàn)3 組pGCs 呈現(xiàn)8 種表達模式（圖2），分為8 個模塊（分別是Profile 0、1、2、3、4、5、6、7）。有676 個基因表達與RES 濃度呈正相關（Profile 7），329 個基因表達量與濃度呈負相關（Profile 0），391 個基因的表達量在低濃度處理組中存在拐點（Profile 6）。對Profile 6 中的基因進行GO 功能富集和KEGG 通路分析（<0.05），發(fā)現(xiàn)Profile 6 中的基因主要富集在細胞內，與DNA 復制、谷胱甘肽運輸、氧化還原酶活性等條目相關，參與卵巢類固醇生成、甾醇激素合成、谷胱甘肽代謝等信號通路（圖3）。

圖2 基因表達趨勢聚類

圖3 模塊6 中基因的GO 和KEGG 富集

2.4 可變剪接事件鑒定及差異基因篩選 將9 個樣本的轉錄組數(shù)據(jù)與豬參考基因組比對后，通過rMATS 軟件對基因組比對結果進行可變剪接分析，在低濃度組與對照組（L vs.C）的比較中，共鑒定出34 186 個可變剪接事件。在高濃度組與對照組（H vs.C）的比較中，共鑒定出34 536 個可變剪接事件（表3）。在不同的可變剪接事件類型中，以SE 類型的可變剪接為主。以<0.05、FDR<0.01 作為差異顯著的判斷標準，在L vs.C 組中篩選到198 個基因參與了236 個可變剪接事件，在H vs.C 組中，有603 個基因發(fā)生了779 個可變剪接事件。

表3 可變剪接事件統(tǒng)計

不同濃度RES 誘導pGCs 凋亡的比較中，SE 類型的可變剪接數(shù)量均最多。在L vs.C、H vs.C 組中，pGCs 發(fā)生SE、RI、MXE 等類型可變剪接事件的比例基本無明顯變化（圖4），分別為75%、7%、9%，以及78%、8%、7%。在L vs.C 組中，SE 事件有178 個，在H vs.C 組中，SE 事件則增加到605 個。A3SS、A5SS類型分別由8%下降到4%，由1%上升到3%。由此可見，參與不同濃度RES 誘導pGCs 凋亡的可變剪接基因具有特異性，可變剪接事件的數(shù)量在不同細胞狀態(tài)下存在較大差異。

圖4 各類型可變剪接事件的比例

利用DESeq 軟件對3 組pGCs 的可變剪接基因進行差異分析，按照差異表達倍數(shù)log2|FC|>1、顯著性<0.05 為標準篩選差異可變剪接基因，結果如圖5 所示，L vs.C 組有6 個差異可變剪接基因（3 個基因顯著上調，3 個基因顯著下調）。H vs.C 組有35 個差異可變剪接基因（15 個基因顯著上調，20 個基因顯著下調）。

圖5 差異可變剪接基因火山圖

2.5 差異可變剪接基因GO 富集分析 為了解發(fā)生可變剪接基因的功能，對發(fā)生差異可變剪接的基因進行了GO 注釋和功能分析。L vs.C 組中6 個發(fā)生差異可變剪接的基因被富集到208 個生物學過程（Biological Process，BP）條目、27 個分子功能（Molecular Function，MF）條目和23 個細胞組分（Cellular Components，CC）條目，推測發(fā)生差異可變剪接的基因可能廣泛參與生物學過程。針對富集到的結果，選取具有統(tǒng)計學意義（<0.05）的10 個GO 條目，發(fā)現(xiàn)差異可變剪接基因主要富集在谷氨酰胺合成與代謝、氨基酸合成、細胞凋亡、氧化還原等生物學過程（表4）。

表4 L vs.C 組合差異可變剪接基因GO 分析

H vs.C 組中發(fā)生差異可變剪接的基因有35 種，被富集到831 個生物學過程條目、167 個分子功能條目和134 個細胞組分條目。其中顯著富集的10 個GO 條目（表5），主要與脂多糖結合、細胞對缺氧反應的正向調節(jié)、吞噬小泡中的蛋白質加工、低氧誘導因子-1 信號通路正調控、吞噬囊泡中蛋白質加工的調控、谷氨酰胺生物合成、磷脂酰膽堿分解代謝等生物過程相關，在分子功能上發(fā)揮脂多糖運輸功能。

表5 H vs.C 組合差異可變剪接基因GO 分析

2.6 差異可變剪接基因KEGG 通路富集分析 如圖6 所示，L vs.C 組中差異可變剪接基因主要富集于代謝途徑、卵巢類固醇生成、氨基酸生成及代謝等通路。H vs.C 組發(fā)生差異可變剪接的基因被富集到卵巢類固醇生成、-氨基丁酸能突觸、谷氨酸能突觸、精氨酸及葉酸生物合成、維生素消化吸收等通路。

圖6 差異可變剪接基因的KEGG 富集分析

2.7 白藜蘆醇誘導豬卵巢顆粒細胞凋亡關鍵可變剪接基因的篩選 基于所篩選2 個組合的差異可變剪接基因，對其差異表達進行了分析（圖7），發(fā)現(xiàn)有4 個基因在L vs.C 及H vs.C 中存在共同表達，分別是醛酮還原酶家族1 成員C3 基因（Aldo-keto Reductase Family 1 Member C1，）、谷氨酸-氨連接酶基因（Glutamate-Ammonia Ligase，）、肌氨酸脫氫酶基因（Sarcosine Dehydrogenase，）以及MAP 激酶激活死亡結構域基因（MAP Kinase Activating Death Domain，）。結合上文的GO功能富集和KEGG 通路分析，發(fā)現(xiàn)及基因被顯著富集到80 個GO 條目和20 條KEGG 信號通路（圖8），廣泛參與了與細胞生長發(fā)育、信號轉導、細胞凋亡及代謝過程。其中，基因被64 個GO 條目及13 個信號通路富集，表明基因對細胞生命活動影響程度更高。以上分析結果表明這4 個發(fā)生差異可變剪接的基因，可能在RES 誘導pGCs 凋亡中發(fā)揮作用。

圖7 差異可變剪接基因的維恩圖

圖8 共表達差異基因富集到GO/KEGG 的數(shù)目

2.8 qRT-PCR 驗證測序可靠性 為了驗證測序結果，隨機選擇了6 個基因進行qRT-PCR 驗證（圖9）。結果顯示，差異表達基因在各組中的表達趨勢與轉錄組測序集中的結果一致，證實了測序數(shù)據(jù)的可靠性。

圖9 差異可變剪接基因的qRT-PCR 和RNA-seq 結果比對圖

3 討 論

一個基因可以在mRNA 前體中以不同的剪接方式形成多種mRNA 剪接異構體，經(jīng)過翻譯，最終在蛋白水平層面表現(xiàn)出不同的功能和結構特異性，被認為是形成基因組和蛋白組多樣性的一種有效機制。目前研究表明，基因可通過可變剪接等調控機制，對細胞增殖分化、壞死及凋亡等生命過程產(chǎn)生重要影響。作為生命科學領域研究的重要技術，RNA-seq 能高效產(chǎn)生基因組序列、準確定量出基因表達量，結合生信分析手段可以實現(xiàn)在全基因組水平分析各種細胞不同生理狀態(tài)下的可變剪接事件。

本研究證實了50 μmol/L 和100 μmol/L RES 極顯著的促進了pGCs 凋亡，并通過RNA-seq 和生信分析，對RES 誘導pGCs 凋亡相關基因的差異表達和可變剪接進行研究，在50 μmol/L RES 處理組發(fā)現(xiàn)了6 個差異可變剪接基因，100 μmol/L RES 處理組有35 個差異基因發(fā)生了可變剪接。此外大多數(shù)發(fā)生可變剪接的基因主要發(fā)生了外顯子跳躍類型的剪接，3'端可變剪接和5'端可變剪接的類型較少，表明可變剪接對于調控這些基因的表達具有重要作用。

通過對發(fā)生差異可變剪接的基因進行GO 功能富集分析發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)基因富集在氨基酸合成及代謝、細胞凋亡、氧化還原及細胞缺氧反應調節(jié)、蛋白質加工調控等與細胞生命活動相關的GO 條目中，這表明可變剪接通過調控差異基因的蛋白質產(chǎn)物而在RES 誘導pGCs凋亡的過程中發(fā)揮重要作用。此外，不同濃度RES 處理pGCs，存在著不同的特異性可變剪接基因，證實了可變剪接在不同細胞狀態(tài)下對蛋白質產(chǎn)物結構及功能起調控作用。在KEGG 通路富集分析中，差異可變剪接基因主要富集到的信號通路（卵巢類固醇生成信號通路、代謝途徑信號通路的信號通路、氨基酸代謝相關信號通路等）均與激素分泌、細胞凋亡、有機物的吸收相關，這與前人研究一致。研究表明，卵巢類固醇生成信號通路受損會抑制哺乳動物卵泡排卵、導致顆粒細胞功能異常，代謝途徑信號通路廣泛發(fā)生在機體，參與生命活動的調節(jié)。

為進一步篩選可能參與RES 誘導pGCs 凋亡的可變剪接基因，結合差異可變剪接基因的GO 和KEGG 富集分析結果，發(fā)現(xiàn)及基因廣泛參與了細胞生命活動相關的GO 條目和信號通路，可能是參與RES 誘導pGCs 凋亡的關鍵基因。其中，基因家族成員被證實參與了多囊卵巢綜合征和卵巢腫瘤的發(fā)生，與妊娠晚期卵泡黃體退化相關?；蚺c谷氨酰胺合成相關，已有研究指出該基因可以參與細胞壞死性凋亡進程和有絲分裂?；蚩梢耘c基因互作，在腫瘤細胞侵襲、遷移及細胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用。而基因可以通過抑制細胞凋亡促進肺腺癌細胞生長，與卵巢癌細胞死亡相關。前人研究結果提示，本文所篩選的4 個差異可變剪接基因均與細胞增殖及凋亡相關，這些可變剪接基因可能在RES 誘導pGCs凋亡過程中發(fā)揮特定功能。

4 結 論

本研究基于RNA-seq 和生物信息學分析，鑒別并篩選了白藜蘆醇誘導豬卵巢顆粒細胞凋亡過程中發(fā)生的差異可變剪接事件，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)基因發(fā)生了外顯子跳躍形式的可變剪接。通過GO 和KEGG 分析，進一步篩選得到了及等可能參與白藜蘆醇誘導豬卵巢顆粒細胞凋亡的差異可變剪接基因。本研究為豬卵巢顆粒細胞凋亡機制的研究提供了一定的數(shù)據(jù)支持，也為進一步研究白藜蘆醇對卵巢發(fā)育的影響提供了科學的理論基礎。