郝希晨，戴海濤，高美妮，付宜鎧，張 鈺，郭子揚(yáng)，張 涵，邢淳梓，王雨涵

（天津大學(xué) 理學(xué)院，天津 300355）

1 引言

蛋白質(zhì)是人體中重要的組成部分，也是生物身體中能量的主要來(lái)源。蛋白質(zhì)在醫(yī)學(xué)研究和癌癥診斷中有指示疾病的特點(diǎn)，因此蛋白質(zhì)的高靈敏檢測(cè)和選擇性鑒別是極其重要的。比如，人尿白蛋白對(duì)糖尿病腎病、心血管和腎臟疾病的診斷有重要價(jià)值。在免疫檢測(cè)反應(yīng)中，最常使用的方法是熒光檢測(cè)。雖然它具有良好的靈敏度，但是此方法需要標(biāo)記，因此耗時(shí)耗力［1-10］。質(zhì)譜法、酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）和熒光免疫分析法等其他的常規(guī)技術(shù)在蛋白質(zhì)分析方面的能力各不相同，但由于成本高和操作復(fù)雜，這些方法和儀器仍然存在應(yīng)用上的局限性。因此，開發(fā)一種高性能、低成本、穩(wěn)定的蛋白質(zhì)檢測(cè)器件對(duì)于提升疾病早期檢出率具有重要的意義。

液晶（LCs）作為一種響應(yīng)快速、靈敏度高和成本低的材料，在生物傳感領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。近幾年，基于液晶的生物傳感器和傳感平臺(tái)快速發(fā)展，尤其在蛋白質(zhì)分子檢測(cè)方面得到了研究者的重視。在液晶/液體或者液晶/玻璃界面，生物分子的引入將破壞液晶分子的有序定向。由于液晶自身的各向異性，在偏光顯微鏡下觀察，其光學(xué)特性將因?yàn)樯锓肿拥囊攵淖?，因此通過(guò)檢測(cè)液晶器件光學(xué)特性的方法可以獲得生物分子的濃度等信息［11-15］?；谝壕У纳飩鞲刑峁┝艘环N新的檢測(cè)免疫化合物的技術(shù)，為生物醫(yī)學(xué)和臨床檢測(cè)提供了新的方法和平臺(tái)。

基于液晶的生物傳感器件常采用液晶盒制備，將液晶滲入定向好的具有一定厚度的玻璃盒中間［16］，通過(guò)觀察生物分子所造成的透過(guò)率的改變來(lái)實(shí)現(xiàn)傳感。這種結(jié)構(gòu)制備相對(duì)復(fù)雜，生物分子不容易進(jìn)入傳感區(qū)域。由于無(wú)標(biāo)記的生物檢測(cè)技術(shù)，如表面等離子體共振（SPR），以及臨床生物檢測(cè)都是在單個(gè)的玻璃、塑料或者膜的基底上形成的，因此，這種組裝液晶盒的方法較為復(fù)雜和繁瑣，不能很好地在臨床中應(yīng)用［17-21］。最近，Wei Lee 等人提出基于液晶聚合物的單基底的生物傳感技術(shù)。該技術(shù)將液晶與光致聚合物混合制備于單玻璃基底上，通過(guò)光固化，實(shí)現(xiàn)液晶器件的制備。這種技術(shù)操作簡(jiǎn)單，節(jié)省材料，符合臨床檢測(cè)要求，對(duì)牛血清白蛋白的檢測(cè)極限達(dá)到了1.6×10-12g/mL［15］。這種方法只是利用了液晶的分子定向特性，液晶分子自身的可調(diào)控優(yōu)勢(shì)沒(méi)有得到充分利用。并且單個(gè)玻璃基底只能測(cè)出一種濃度的BSA，效率比較低。因此，進(jìn)一步探索基于液晶的單基底高通量光電生物傳感具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

本文提出一種單基底高通量液晶光電測(cè)量生物傳感方案。在單ITO 玻璃上制備叉指電極，通過(guò)施加面內(nèi)電壓，控制電極間液晶分子的定向。引入生物分子，擾動(dòng)液晶分子的定向，改變其光學(xué)性能以實(shí)現(xiàn)生物傳感功能。進(jìn)一步在叉指電極上制備方格子陣列（液晶池子），實(shí)現(xiàn)高通量陣列BSA 濃度的傳感。本研究結(jié)果為單基底高通量光電生物傳感器提供了新的思路。

2 實(shí)驗(yàn)材料、裝置及檢測(cè)原理

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

垂直定向劑為二甲?；?-三甲氧基硅基丙基］氯化銨（DMOAP），向列相液晶為QYPDLC-7（波長(zhǎng)為589 nm，溫度為20 ℃下雙折射率Δn=0.224）。預(yù)聚物采用光致聚合物NOA65（Norland），以牛血清白蛋白（BSA）作為測(cè)試用的標(biāo)準(zhǔn)蛋白（Sigma Aldrich）。

2.2 單基底器件的制備

在ITO 玻璃（2 cm×2 cm）上制備叉指電極，整個(gè)電極區(qū)域的長(zhǎng)度為2 cm，寬度為1.2 cm。為了保證液晶分子能夠在電極之間獲得足夠大的電壓，電極與電極之間的間隔設(shè)置為50 μm，如圖1（a）所示?；咨鲜紫戎苽銬MOAP 層，形成垂直定向?qū)印?/p>

圖1 （a）樣品叉指電極示意圖；（b）生物傳感系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)裝置。Fig.1 （a）Schematic diagram of interdigital electrode；（b）Experimental device of biosensor system.

使用去離子水將BSA 溶液稀釋成特定的濃度，將BSA 溶液滴在DMOAP 修飾的玻璃基底上（BSA 液滴覆蓋一個(gè)叉指電極）。隨后將玻璃基底放在熱臺(tái)上，30 ℃加熱30 min，固化BSA。接著將LC/NOA65 的混合物滴在玻璃基板上，旋涂均勻。用強(qiáng)度為15 mW/cm2的紫外燈曝光30 s，以形成聚合物網(wǎng)絡(luò)。采用奧林巴斯IX71 偏光顯微鏡（POM）觀察正交偏振條件下樣品的透光率來(lái)標(biāo)定BSA 的濃度。圖1（b）給出了用于蛋白質(zhì)濃度分析的實(shí)驗(yàn)裝置圖，其中Agilent33210 A 信號(hào)發(fā)生器和TREK 623B 高壓放大器通過(guò)同軸電纜連接，用于在液晶器件上施加電場(chǎng)。

高通量測(cè)試的樣品采用如圖2（a）所示的陣列化液晶格（或液晶池子），每個(gè)格子的尺寸為800 μm×800 μm，制備于叉指電極上。制備好液晶定向?qū)雍螅诿總€(gè)液晶池子中利用毛細(xì)滴管（直徑為300 μm）滴入不同濃度的BSA 并固化，與前述的步驟一致，在基底上制備液晶/聚合物薄膜，BSA 固化后的液晶池子如圖2（b）所示。圖2（b）中的圓環(huán)是因?yàn)锽SA 在干燥過(guò)程中，從BSA 液滴邊緣蒸發(fā)的水被從內(nèi)部蒸發(fā)的水補(bǔ)充，導(dǎo)致溶液向外流動(dòng)，將蛋白質(zhì)溶質(zhì)帶到液滴邊緣，從而形成環(huán)狀外形，即咖啡環(huán)效應(yīng)?？Х拳h(huán)效應(yīng)會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生影響，但也在一定程度上增加了能夠檢測(cè)的最小濃度的極限。本實(shí)驗(yàn)將不同濃度的BSA 根據(jù)圖像亮度分別進(jìn)行嚴(yán)格標(biāo)定，使灰度值和濃度值相對(duì)應(yīng)，并且對(duì)亮度取平均值來(lái)減小咖啡環(huán)效應(yīng)的影響。

圖2 光刻方格圖像（LC 池）。（a）LC 池子；（b）含有BSA 的LC 池子。Fig.2 Lithographic grid image（LC cell）.（a）LC pool；（b）LC pool containing BSA.

2.3 蛋白質(zhì)濃度測(cè)試原理

偏光顯微鏡（POM）的起偏（P）和檢偏（A）方向設(shè)定為正交，如圖3 所示。初始狀態(tài)，未加入BSA 的樣品，液晶垂直定向，入射光偏振方向和液晶分子定向垂直，經(jīng)過(guò)樣品后偏振態(tài)不發(fā)生改變，因此整個(gè)視場(chǎng)為黑色，如圖3（a）所示。當(dāng)面內(nèi)電場(chǎng)電壓超過(guò)Friederieksz 轉(zhuǎn)變電壓時(shí)，液晶分子沿電場(chǎng)方向轉(zhuǎn)動(dòng)［22］，在偏光顯微鏡下觀察到的電極間的圖像由黑色慢慢變亮。這主要是因?yàn)橐壕Х肿友刂妶?chǎng)方向排列，使得出射光的偏振狀態(tài)發(fā)生了改變，如圖3（b）所示。當(dāng)加電壓足夠高時(shí)，電極中心處的液晶分子定向與基底平行，如圖3（c）所示。此時(shí)經(jīng)過(guò)樣品后，在電極中心處入射光的偏振狀態(tài)不改變，偏光顯微鏡下觀察到的電極中心區(qū)域又變?yōu)楹谏?3］。而在電極邊緣處，液晶分子定向具有一定的傾角，因此入射光經(jīng)過(guò)以后偏振狀態(tài)也發(fā)生改變，在偏光顯微鏡下能顯示一定的亮度。圖3 中直線表示線偏振光，而橢圓則表示出射光，為非線偏振光。當(dāng)加入BSA 之后，由于BSA 會(huì)擾亂液晶分子定向，因此偏光顯微鏡下觀察到的圖像呈不同的亮度，如圖3（d）所示。結(jié)合灰度的變化，即可進(jìn)行樣品濃度的判斷。為了使在一定電壓下，POM 亮度的變化比較好地表現(xiàn)濃度的變化，在進(jìn)行圖像處理時(shí)，主要選擇電極中心處的一個(gè)直線進(jìn)行灰度的統(tǒng)計(jì)和計(jì)算。

圖3 液晶分子定向以及出射光的偏振方向示意圖。（a）未加電壓時(shí)；（b）加電壓后（沒(méi)有BSA）時(shí)；（c）電壓足夠高時(shí)；（d）有電壓，同時(shí)加入BSA 時(shí)。Fig.3 Schematic diagram of liquid crystal molecular orientation and polarization direction of outgoing light.（a）No voltage is applied；（b）Voltage is added（without BSA）；（c）Voltage is high enough；（d）Voltage and BSA is added at the same time.

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

3.1 單基底濃度檢測(cè)

按照2.2 節(jié)中的操作步驟，首先在ITO 玻璃基底上制備DMOAP 垂直定向?qū)樱尾煌瑵舛鹊腂SA 并固定，隨后制備LC/NOA65 混合液，選取NOA65 的含量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）為3%［17］，旋涂至玻璃基底，并采用紫外線照射固化。在叉指電極的正負(fù)極加電，電壓范圍控制在0～50 V。在偏光顯微鏡下觀察液晶在加電時(shí)的明暗變化。

圖4給出了BSA 濃度為10-3g/mL 時(shí)，不同電壓下的偏光顯微鏡圖像。圖4 中的黑色圈為視場(chǎng)中的偏振旋轉(zhuǎn)架的圖像，為無(wú)效區(qū)域。圖4（a）顯示當(dāng)不加電時(shí)，由于BSA 對(duì)液晶定向的擾動(dòng)，電極液晶圖像在POM 下觀察到的圖像為亮。圖4（b）～（f）顯示施加不同電壓情況下，電極寬度內(nèi)的灰度變化。其中，白色箭頭指出的位置為電極的區(qū)域。由圖可看出電極中間的部分越來(lái)越暗，而電極兩側(cè)則越來(lái)越亮。在外加電壓作用下，面內(nèi)電極間的液晶分子定向隨著電壓的方向改變，電極中間的液晶分子方向沿著電場(chǎng)的方向，因而呈現(xiàn)黑色。而電極邊緣的電場(chǎng)呈現(xiàn)彎曲狀態(tài)，液晶分子也與平面有一定的夾角，所以POM 圖像在電極的邊緣是亮的。

圖4 BSA 濃度為10-3 g/mL 時(shí)液晶光致聚合物復(fù)合膜在不同電壓下的光學(xué)圖像。（a）0 V；（b）10 V；（c）20 V；（d）30 V；（e）40 V；（f）50 V。Fig.4 Optical images of LC photopolymer composite film at different voltage when BSA concentration is 10-3 g/mL.（a）0 V；（b）10 V；（c）20 V；（d）30 V；（e）40 V；（f）50 V.

圖5（a）～（e）給出濃度為10-3～10-7g/mL 的BSA 在0 V（上側(cè)）和15 V（下側(cè)）時(shí)的POM 圖像。由POM 的圖像可以清楚地看到，隨著生物分子濃度的減小，對(duì)液晶的擾動(dòng)越來(lái)越小，因此，觀察到的圖像逐漸變暗。

圖5 不同施加電壓條件下，偏光顯微鏡效果，（a）10-3 g/mL；（b）10-4 g/mL；（c）10-5 g/mL；（d）10-6 g/mL；（e）10-7 g/mL（上側(cè)為0 V，下側(cè)為15 V）。Fig.5 POM images with various applied voltage.（a）10-3 g/mL；（b）10-4 g/mL；（c）10-5 g/mL；（d）10-6 g/mL；（e）10-7 g/mL（top row 0 V，bottom row 15 V）.

圖6 給出了在不同電壓條件下，不同濃度的BSA 表現(xiàn)出的灰度值。隨著施加電壓的增加，圖像的灰度平均值減小，當(dāng)電壓加到10 V 左右時(shí)，各個(gè)濃度圖像的灰度值逐漸趨于穩(wěn)定。說(shuō)明此時(shí)的電場(chǎng)已經(jīng)足夠大，使液晶分子完全垂直于電極。所以在外加電場(chǎng)作用下，能夠提升高濃度BSA 的檢測(cè)性能。

圖6 不同濃度BSA 對(duì)應(yīng)的灰度平均值隨電壓的變化Fig.6 Mean gray value of BSA with different concentrations changed with voltage.

為定量分析BSA 濃度與圖像的灰度平均值的關(guān)系，本文利用圖像處理軟件分析了電壓為5 V 時(shí)不同濃度的圖像的灰度值。并且用電壓為0 V 時(shí)的圖像灰度值作為參照。如圖7（a）所示，在有一定的偏置電壓時(shí)，灰度隨濃度變化的曲線的線性度更好。當(dāng)未施加電壓時(shí)，液晶分子定向受到BSA 分子作用和周圍液晶分子的彈性作用，因此液晶分子方向的變化隨BSA 分子方向的變化而變化，其具有一定的隨機(jī)性。但是當(dāng)外加電場(chǎng)后，液晶分子的定向同時(shí)受到BSA 分子和電場(chǎng)作用，因?yàn)殡妶?chǎng)作用是固定的指向，所以液晶分子變化具有一定的有序性，這也提升了亮度變化的線性度。另外，液晶分子在電場(chǎng)作用下的重定向具有一定的閾值，在本實(shí)驗(yàn)中0～5 V 之間的電壓對(duì)液晶分子的影響比較小，5 V 以上的電壓則逐漸趨于飽和，降低了檢測(cè)的靈敏度，因此隨后的分析均選擇在5 V 外加電壓條件下。

定量的標(biāo)定可以定義標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)S：

其中，G0和GBSA分別為無(wú)BSA 和存在BSA 時(shí)圖像的灰度。為確定未知蛋白分析物的濃度，可以將相同體積（5 μL）的分析物固定在相同DMOAP 和相同電極間隔玻璃基底上，然后用液晶薄膜進(jìn)行檢測(cè)。未知蛋白分析物的濃度可以通過(guò)在校準(zhǔn)曲線中插值其相對(duì)強(qiáng)度來(lái)確定，校準(zhǔn)曲線如圖7（b）所示。

圖7 （a）電壓為0 V 和5 V 時(shí)BSA 濃度與圖像灰度的關(guān)系；（b）校準(zhǔn)曲線。Fig.7 （a）Relationship between BSA concentration and image gray level when voltage is 0 V and 5 V；（b）Calibration curve.

3.2 高通量分析方案

在實(shí)際應(yīng)用中，需要快速測(cè)量大量不同濃度的樣品，因此高通量的蛋白質(zhì)分析具有重要的意義。3.2 節(jié)中采用的方法，在滴入BSA 時(shí)，因?yàn)闈舛炔煌瑫?huì)導(dǎo)致BSA 液滴擴(kuò)散的面積不同，所以同時(shí)檢測(cè)多個(gè)濃度的樣品具有一定的困難。為了克服這個(gè)困難，本文采用光刻方法在ITO 表面電極之間制備正方形格子（液晶池子）陣列，其尺寸為800 μm×800 μm。每個(gè)液晶池子可以滴入不同濃度的BSA。為了保證滴入的BSA 能夠完全在單個(gè)池子里面，不會(huì)與其他濃度的BSA混合，選擇直徑為300 μm 的毛細(xì)管進(jìn)行點(diǎn)樣。隨后在其上制備液晶聚合物層，在POM 下觀察得到的圖像如圖8（a）所示，其中標(biāo)出了不同濃度BSA 所對(duì)應(yīng)的液晶池子。圖中，所有的電極都沒(méi)有呈現(xiàn)出來(lái)，或者電極區(qū)域呈全亮的狀態(tài)，這是因?yàn)锽SA 破壞了液晶定向所導(dǎo)致的。施加面內(nèi)電場(chǎng)后，不同電壓下觀察到的POM 圖像如圖8（b）～（e）所示。每個(gè)液晶池子都保證電極在池內(nèi)?？梢钥闯鲭S著電壓的增加，電極圖樣逐漸顯現(xiàn)，但是其灰度分布依然是電極中間黑兩邊亮。由于在顯微鏡下所看到的視場(chǎng)范圍有限，在橫向上只能看到3～4個(gè)液晶池子，因此可同時(shí)分析BSA 濃度依次為10-3，10-4，10-5，10-6，10-7g/mL時(shí)的POM 圖像。圖9 給出了同一個(gè)電極內(nèi)，從左到右不同BSA 濃度的圖像灰度值（即BSA 濃度依次為10-3，10-4，10-5g/mL），其灰度峰值從左到右依次降低，所以通過(guò)一個(gè)曲線即可以確定多個(gè)BSA 濃度的數(shù)值，實(shí)現(xiàn)了高通量的檢測(cè)方案，提高了蛋白質(zhì)檢測(cè)效率并且降低了檢測(cè)成本。

圖8 （a）不同濃度BSA 和（b）不同電壓下（0，5，20，50 V）液晶光致聚合物復(fù)合膜的光學(xué)圖像。Fig.8 Optical images of liquid crystal photoinduced polymer composite films at（a）different concentrations of BSA and（b）different voltages（0，5，20，50 V）.

圖9 不同電壓下液晶池子中電極間的圖像灰度值Fig.9 Gray values of images between electrodes in the liquid crystal cell at different voltages

4 結(jié)論

本文制備了具有面內(nèi)電極的單基底液晶生物傳感器，對(duì)其外加電場(chǎng)能夠提升傳感特性的線性度。對(duì)BSA 的檢測(cè)范圍達(dá)到10-3～10-7g/mL，其檢測(cè)極限可達(dá)到10-7g/mL。利用光刻技術(shù)在基底上制備了陣列化的液晶池子，提高了檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度的效率。由于偏光顯微鏡視場(chǎng)的限制，同時(shí)檢測(cè)的樣品的數(shù)目較少，未來(lái)可通過(guò)提升光刻精度減小液晶池子的方法來(lái)提升同時(shí)檢測(cè)的通道數(shù)目。本研究設(shè)計(jì)的液晶傳感技術(shù)方案，具有操作簡(jiǎn)單，可電調(diào)控檢測(cè)范圍，效率高的特點(diǎn)，為高效率、高性能的液晶傳感提供了一種新的思路。