洪 波, 常 青, 翟穎妍, 任博文, 謝毓芬, 張 鋒,*

(1. 陜西省生物農(nóng)業(yè)研究所, 西安 710043; 2. 陜西省林業(yè)科學(xué)院, 西安 710082)

昆蟲的嗅覺系統(tǒng)主要包括氣味結(jié)合蛋白(odorant binding proteins, OBPs)、化學(xué)感受蛋白(chemosensory proteins, CSPs)、氣味受體(olfactory receptors, ORs)、味覺受體(gustatory receptors, GRs)、離子型受體(ionotropic receptors, IRs)、感覺神經(jīng)元膜蛋白(sensory neuron membrane proteins, SNMPs)和氣味降解酶(odorant degrading enzymes, ODEs)等(Vosshalletal., 1999; De Bruyne and Baker, 2008; Sánchez-Graciaetal., 2009)。其中，CSPs最初是在黑腹果蠅Drosophilamelanogaster中被鑒定出來的，當(dāng)時(shí)稱為OS-D(olfactory specific protein D)(McKennaetal., 1994)，直到大量CSPs從沙漠蝗Schistocercagregaria的觸角化學(xué)感器中被鑒定出之后，開始命名為化學(xué)感受蛋白(Angelietal., 1999; Pelosietal., 2018; 周巧玲等, 2021)。近年來，隨著高通量測序技術(shù)的快速發(fā)展，CSPs在鱗翅目、鞘翅目、雙翅目、膜翅目等10多個(gè)目的昆蟲中得到克隆和鑒定(Robertsonetal., 1999; Anderssonetal., 2013; 李慧等, 2018)。在鞘翅目昆蟲中，目前已有赤擬谷盜Triboliumcastaneum(Dippeletal., 2014)、華北大黑鰓金龜Holotrichiaoblita(Sunetal., 2014)、沙蔥螢葉甲Galerucadaurica(Lietal., 2018)、華山松大小蠹Dendroctonusarmandi(Lietal., 2018)、松墨天牛Monochamusalternatus(Alietal., 2019)、蘋果小吉丁蟲Agrilusmali(Lietal., 2021)、甘薯小象甲Cylasformicarius(Huaetal., 2021)、溝眶象Eucryptorrhynchusscrobiculatus和臭椿溝眶象Eucryptorrhynchusbrandti(Wangetal., 2021)等多個(gè)物種CSPs基因鑒定和蛋白功能的研究報(bào)道。

棗食芽象甲Scythropusyasumatsui(異名Pachyrhinusyasumatsui)又稱棗飛象，屬鞘翅目(Coleoptera)象甲科(Curculionidae)，是一種嚴(yán)重危害棗屬植物的寡食性害蟲，目前廣泛分布于我國北方紅棗主產(chǎn)區(qū)(洪波等, 2017)。近年來，該蟲在陜西和山西兩省黃河沿岸棗區(qū)連年暴發(fā)成災(zāi)，危害呈加重趨勢，而目前對于該蟲的防治仍以傳統(tǒng)化學(xué)農(nóng)藥為主。長期大量化學(xué)藥劑的使用，導(dǎo)致棗食芽象甲產(chǎn)生抗藥性，并對環(huán)境和食品安全構(gòu)成嚴(yán)重威脅(張鋒等, 2015; 楊斌等, 2019; 閻雄飛等, 2020)。因此，探索綠色、環(huán)保、高效的棗食芽象甲防治技術(shù)對實(shí)現(xiàn)紅棗提質(zhì)增效、保證紅棗產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展有重要意義。由于該蟲主要取食棗屬植物，意味著嗅覺在其識別特定寄主植物方面發(fā)揮著重要作用。然而，近年來對棗食芽象甲的相關(guān)研究僅限于該蟲對棗樹揮發(fā)物的EAG和嗅覺行為方面(閻雄飛和李善才, 2012; 王晶玲等, 2017; 閻雄飛等, 2020)，而對該蟲的化學(xué)感受機(jī)制知之甚少，有關(guān)棗食芽象甲CSP基因鑒定及蛋白功能的研究尚未見報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)室基于前期已測定的棗食芽象甲成蟲觸角轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，共鑒定到12個(gè)CSP基因(數(shù)據(jù)待發(fā)表)，其中觸角候選基因CSP4在轉(zhuǎn)錄組中的FPKM(fragments per kilobase million)值相對較高(FPKM=1 766.13)，推測該基因在棗食芽象甲對揮發(fā)物的嗅覺識別過程中發(fā)揮重要作用。因此，本研究克隆和鑒定出棗食芽象甲化學(xué)感受蛋白基因PyasCSP4，運(yùn)用RT-qPCR技術(shù)分析該基因在棗食芽象甲成蟲各組織中的表達(dá)情況，通過原核表達(dá)純化獲取PyasCSP4目的蛋白，并利用熒光競爭性結(jié)合實(shí)驗(yàn)對該蛋白與35種棗樹Zizyphusjujuba揮發(fā)物的結(jié)合特性進(jìn)行測定和分析，以期了解PyasCSP4在棗食芽象甲嗅覺識別中的作用，為闡明棗食芽象甲的化學(xué)感受機(jī)制及開發(fā)基于行為調(diào)控的防控技術(shù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

供試棗食芽象甲老熟幼蟲于2020年4月中旬采自陜西省延川縣棗園，帶回實(shí)驗(yàn)室后置于養(yǎng)蟲罐中并覆蓋土壤(土壤相對濕度為60%，土壤厚度5 cm)。待成蟲羽化后將雌、雄成蟲分離，置于人工氣候箱內(nèi)以新鮮棗芽飼養(yǎng)。飼養(yǎng)溫度為(25±1)℃，相對濕度為60%±5%，光周期為16L∶8D。

1.2 RNA提取和cDNA合成

選取棗食芽象甲3日齡雌、雄成蟲各200頭在體視鏡下解剖，收集所有成蟲的觸角(雌雄各約400根)，去除觸角的頭(雌、雄各20個(gè))、胸(雌、雄各20個(gè))、腹(雌、雄各20個(gè))、足(雌、雄各50頭，取前、中、后足)和翅(雌、雄各50頭，取前、后翅)，立即置于液氮中冷凍。采用Trizol法提取各組織樣品的總RNA，用微量分光光度計(jì)(SimpliNano, 美國GE公司)測定各組織樣品RNA的濃度和純度，將濃度值大于100 ng/μL，OD260/OD280值為1.8～2.0的樣品視為合格，然后取各組織總RNA 1 μg，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒[TaKaRa寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司]反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 棗食芽象甲CSP4基因克隆

基于本實(shí)驗(yàn)室前期已測定的棗食芽象甲雌成蟲觸角轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(GenBank登錄號: SRR7871392)，以棗食芽象甲雌成蟲觸角cDNA為模板，設(shè)計(jì)特異性引物(CSP4-F/CSP4-R) (表1)擴(kuò)增候選CSP4基因序列。RT-PCR反應(yīng)體系(20 μL): cDNA模板1.0 μL，正反向引物(10 μmol/L)各1.0 μL, 2×Taq MasterMix 10 μL, ddH2O 7.0 μL。反應(yīng)程序: 95℃ 3 min; 95℃ 30 s, 56℃ 30 s, 72℃ 30 s, 共35個(gè)循環(huán); 72℃延伸10 min。進(jìn)行PCR產(chǎn)物的菌液PCR檢驗(yàn)和測序驗(yàn)證。本研究所用引物和測序均由生工生物工程(上海)有限公司完成。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.4 棗食芽象甲CSP4基因的序列分析

利用在線工具ORF finder(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)預(yù)測CSP4基因的開放閱讀框(ORF)；使用SignalP 5.0 Server(https:∥services.healthtech.dtu.dk/service.php? SignalP-5.0)預(yù)測CSP4的信號肽序列；使用在線軟件ExPASy的ProtParam工具(http:∥web.expasy.org/protparam/)預(yù)測氨基酸的分子量和等電點(diǎn)。使用DNAMAN 9.0軟件進(jìn)行不同物種的氨基酸序列同源性分析。將棗食芽象甲CSP4氨基酸序列與從NCBI中下載的鞘翅目昆蟲的CSP氨基酸序列進(jìn)行多序列比對分析，利用MEGA X軟件的鄰接法(neighbor-joining, NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(設(shè)置bootstrap值為1 000)。

1.5 棗食芽象甲CSP4基因的相對表達(dá)量分析

以1.2節(jié)獲得的各組織cDNA為模板，選取棗食芽象甲EF-1α(GenBank登錄號: OK105108)和β-actin(GenBank登錄號: OK322363)作為雙內(nèi)參基因，進(jìn)行棗食芽象甲成蟲組織中CSP4的表達(dá)量的qPCR檢測，qPCR所用的特異性引物見表1。qPCR反應(yīng)體系(20 μL): cDNA 1.0 μL, 正反向引物(10 μmol/L)各0.8 μL, TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ 10 μL, ROX Reference Dye 0.4 μL, ddH2O 7.0 μL。反應(yīng)程序: 95℃ 30 s; 95℃ 5 s, 60℃ 30 s, 72℃ 30 s, 共40個(gè)循環(huán)，最后在60～95℃記錄熔解曲線。棗食芽象甲成蟲每個(gè)組織(觸角、去除觸角的頭、胸、腹、足和翅) 測定3個(gè)重復(fù)樣品，每個(gè)樣品重復(fù)測定3次。

1.6 棗食芽象甲CSP4的原核表達(dá)及純化

根據(jù)棗食芽象甲CSP4的編碼區(qū)序列，去除信號肽序列后設(shè)計(jì)帶有BamHⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)的引物(CSP4-eF/CSP4-eR)(表1)，以雌成蟲觸角cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物純化回收后連接至pMD19-T載體，并轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，菌液PCR進(jìn)行檢驗(yàn)。將含有目的片段的pMD19-T/PyasCSP4重組質(zhì)粒DNA和pET32a(+)質(zhì)粒DNA用BamHⅠ和HindⅢ限制性內(nèi)切酶(TaKaRa)分別進(jìn)行雙酶切，純化回收后利用T4 DNA連接酶將目的片段連接到表達(dá)載體pET32a(+)上，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，鑒定陽性克隆并再次測序驗(yàn)證，最后將序列正確的重組質(zhì)粒pET32a(+)/PyasCSP4轉(zhuǎn)入BL21(DE3) 感受態(tài)細(xì)胞。

挑取含pET32a(+)/PyasCSP4質(zhì)粒的單克隆菌落于LB液體培養(yǎng)基中37℃ 220 r/min振蕩培養(yǎng)，當(dāng)菌液OD600值為0.6～0.8時(shí)，加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)5 h，離心收集菌體后利用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)進(jìn)行破碎，然后4℃ 12 000 r/min離心30 min后收集上清和沉淀，通過SDS-PAGE檢測蛋白的表達(dá)情況。利用Ni-NTA鎳柱(七海復(fù)泰生物科技有限公司)對上清液中的目的蛋白進(jìn)行純化，經(jīng)不同梯度咪唑緩沖液(20, 40, 80, 100, 150, 200和300 mmol/L)洗脫后，獲得的重組PyasCSP4蛋白洗脫液在Tris-HCl(pH 7.4)緩沖液中充分透析后，用于Western blot檢測及后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

使用重組腸激酶(翊圣生物科技股份有限公司)切去重組蛋白的His標(biāo)簽，純化獲得目的蛋白PyasCSP4，最后利用BCA法在全波長酶標(biāo)儀(BioTek Epoch2，美國Biotek公司)下測定蛋白濃度。

1.7 Western blot免疫印跡檢測

利用轉(zhuǎn)膜儀(DYCZ-40S，北京六一生物科技有限公司)(電流300 mA，轉(zhuǎn)膜時(shí)間1 h)使重組蛋白從SDS-PAGE膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜(0.22 μm，默克Millipore)上。首先用封閉液(TBST+5%脫脂奶粉)對膜封閉2 h，然后用1∶5 000倍稀釋的抗His標(biāo)簽鼠單克隆抗體(康為世紀(jì)生物科技有限公司)室溫封閉孵育過夜。第2天用洗脫液TBST洗膜5次，然后加入1∶10 000倍稀釋的羊抗鼠二抗(康為世紀(jì))室溫反應(yīng)2 h，再用洗脫液TBST洗膜5次，最后加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑在成像系統(tǒng)(710Pro，北京百晶生物技術(shù)有限公司)中顯色觀察。

1.8 熒光競爭結(jié)合實(shí)驗(yàn)

選用35種本實(shí)驗(yàn)室前期通過GC-MS鑒定出的及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道(楊立軍等, 2012; 閻雄飛等, 2017, 2020)的棗樹幼芽和葉片揮發(fā)物(未發(fā)表數(shù)據(jù))作為PyasCSP4蛋白的結(jié)合配體(表2)，均購自Sigma-Aldrich和Aladdin試劑公司，以1-NPN作為熒光探針，使用色譜級甲醇將1-NPN和氣味配體標(biāo)樣配置為1 mmol/L的試樣。設(shè)定熒光分光光度計(jì)(F-2700，日本HITACHI公司)的激發(fā)光波長為337 nm，掃描發(fā)射波長為370～550 nm。首先移取PyasCSP4蛋白溶液至石英比色皿中，稀釋為2 mL終濃度2 μmol/L的溶液，然后按2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 和20 μmol/L的終濃度依次加入1-NPN，并記錄每個(gè)濃度下最大發(fā)射波長的熒光值，利用Scatchard方程計(jì)算PyasCSP4蛋白與1-NPN的解離常數(shù)K1-NPN。

向比色皿中加入2 μmol/L PyasCSP4重組蛋白溶液和2 μmol/L 1-NPN，充分混合后記錄初始熒光值，然后將每種氣味配體按2, 4, 6, 8, 10, 14, 16和20 μmol/L的終濃度依次加入比色皿，并記錄熒光值，每樣品3次重復(fù)。假設(shè)PyasCSP4蛋白活性為100%，且在飽和狀態(tài)下蛋白與氣味配體的結(jié)合比為1∶1，根據(jù)公式Ki=IC50/(1+[1-NPN]/K1-NPN)計(jì)算各配體的解離常數(shù)(Ki)，其中IC50為PyasCSP4/1-NPN復(fù)合物的熒光強(qiáng)度值下降至50%時(shí)配體的濃度，[1-NPN]為未結(jié)合的1-NPN濃度。一般認(rèn)為當(dāng)Ki<10 μmol/L時(shí)，蛋白和配體的結(jié)合能力較強(qiáng)；而當(dāng)Ki>20 μmol/L時(shí)兩者的結(jié)合能力很弱，基本沒有結(jié)合能力(Warisetal., 2020)。

1.9 數(shù)據(jù)分析

利用2-ΔΔCt方法計(jì)算PyasCSP4基因的相對表達(dá)量(Livak and Schimittgen, 2001)。PyasCSP4在不同組織間的表達(dá)量差異用單因素方差分析(one-way ANOVA)進(jìn)行檢驗(yàn)，在不同性別間的表達(dá)量差異用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)(independent samplest-test)檢測。

2 結(jié)果

2.1 棗食芽象甲CSP4基因的克隆及序列

基因克隆獲取棗食芽象甲化學(xué)感受蛋白基因的cDNA序列，將該基因命名為PyasCSP4(GenBank登錄號: OK322362)，其開放閱讀框(ORF)全長366 bp，編碼121個(gè)氨基酸，氨基酸序列的N端有18個(gè)氨基酸組成的信號肽序列，去除掉信號肽的成熟肽由103個(gè)氨基酸組成，含4個(gè)保守的半胱氨酸殘基，不存在跨膜結(jié)構(gòu)域，為典型的分泌蛋白。成熟蛋白預(yù)測分子量大小為11.70 kD，理論等電點(diǎn)為8.67，不穩(wěn)定指數(shù)為32.30，親水性平均值(GRAVY)為-0.806，表明其為親水性蛋白。

2.2 PyasCSP4與其他昆蟲CSPs的多序列比對及系統(tǒng)發(fā)育

PyasCSP4與鞘翅目昆蟲華山松大小蠹、間大小蠹Dendroctonusadjunctus、甘薯小象甲Cylasformicarius及其他昆蟲CSPs的氨基酸多序列比對發(fā)現(xiàn)(圖1)，PyasCSP4序列與其他昆蟲一樣都具有4個(gè)保守的半胱氨酸殘基，且分布符合鞘翅目昆蟲C1-X6-C2-X18-C3-X2-C4(X為除去半胱氨酸的其他氨基酸)的特征(Maleszka and Stange, 1997)。通過對PyasCSP4序列同源性比較發(fā)現(xiàn)，PyasCSP4與其他鞘翅目昆蟲CSP序列同源性相對較低，與間大小蠹DadjCSP2的氨基酸序列一致性最高，僅為65%；與甘薯小象甲CforCSP8、華山松大小蠹DarmCSP2和苜蓿葉象甲AnthonomusgrandisAgraCSP12的氨基酸序列一致性分別為62%, 61%和57%。將PyasCSP4與其他7種鞘翅目昆蟲的CSPs(79種)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示PyasCSP4沒有與其他種類聚為一支(圖2)，表明PyasCSP4與目前已有研究的其他鞘翅目昆蟲CSP進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖1 棗食芽象甲PyasCSP4與其他昆蟲CSPs的氨基酸序列比對Fig. 1 Amino acid sequence alignment of PyasCSP4 fromScythropus yasumatsui with CSPs from other insect species蛋白來源物種及GenBank登錄號 Origin species of proteins and their GenBank accession numbers: CforCSP8: 甘薯小象甲 Cylas formicarius, QWS70520; DarmCSP2: 華山松大小蠹 Dendroctonus armandi, AXF53965; DadjCSP2: 間大小蠹 Dendroctonus adjunctus, QPZ89236; AgraCSP11: 苜蓿葉象甲 Anthonomus grandis, AVI04881; AgraCSP12: 苜蓿葉象甲 Anthonomus grandis, AVI04882; CbowCSP6: 大猿葉甲 Colaphellus bowringi, ALR72520; AmalCSP6: 蘋果小吉丁蟲 Agrilus mali, AXG21599; MaltCSP10: 松墨天牛 Monochamus alternatus, AIX97085; AmelCSP6: 西方蜜蜂 Apis mellifera, NP_001071287; CpalCSP14: 大草蛉 Chrysopa pallens, AKW47193; CnipCSP14: 日本通草蛉 Chrysoperla nipponensis, AKW47216; RpedCSP2: 點(diǎn)蜂緣蝽 Riptortus pedestris, AWW17226. 星號表示保守位點(diǎn)的半胱氨酸殘基。The conserved cysteines are indicated with asterisks.

圖2 鄰接法構(gòu)建的基于氨基酸序列的棗食芽象甲PyasCSP4與其他昆蟲CSPs的系統(tǒng)發(fā)育樹(1 000次重復(fù))Fig. 2 Phylogenetic tree of PyasCSP4 from Scythropus yasumatsui and CSPs from other insect species constructedby neighborhood-joining method based on their amino acid sequences (1 000 replicates)蛋白來源物種及GenBank 登錄號Origin species of proteins and their GenBank accession numbers: 棗食芽象甲Scythropus yasumatsui (PyasCSP4); 赤擬谷盜Tribolium castaneum(TcasCSP1, NP_001039273; TcasCSP2, NP_001039277; TcasCSP4, NP_001039285; TcasCSP5-8, NP_001039287-NP_001039290; TcasCSP9, NP_00103928; TcasCSP10-14, NP_001039278-NP_001039282; TcasCSP15, NP_001039291; TcasCSP17, NP_001039284; TcasCSP18, NP_001039286; TcasCSP19, EFA07577; TcasCSP20, NP_001039274); 華山松大小蠹Dendroctonus armandi (DarmCSP1, AXF54070; DarmCSP2, AXF53965; DarmCSP3-5, AXF54071-AXF54073; DarmCSP6, AXF54077; DarmCSP7-9, AXF54074-AXF54076); 松墨天牛Monochamus alternatus (MaltCSP1-7, AIX97041-AIX97047); 甘薯小象甲Cylas formicarius (CforCSP1-7, QFO46789-QFO46795; CforCSP8-10, QWS70520-QWS70522); 棉鈴象甲Anthonomus grandis (AgraCSP1-2, AVI04873-AVI04874; AgraCSP4-9, AVI04876-AVI04880; AgraCSP10, AWF93846; AgraCSP11-12, AVI04881-AVI04882); 暗黑鰓金龜Holotrichia parallela (HparCSP1-16, AKI84384-AKI84399); 蘋果小吉丁蟲Agrilus mali (AmalCSP1-8, AXG21594-AXG21601).

2.3 PyasCSP4的組織表達(dá)譜

組織表達(dá)結(jié)果表明(圖3)，PyasCSP4在棗食芽象甲成蟲不同組織中均有表達(dá)，在雌成蟲觸角和翅中的表達(dá)量顯著高于在雌成蟲其他組織中的(F5,12=1 195.08,P<0.05)，其中PyasCSP4在雌成蟲翅中的表達(dá)量最高，分別為雌成蟲頭(去除觸角)、胸、腹和足中表達(dá)量的1.26, 2.90, 4.34和8.36倍；PyasCSP4在雄成蟲觸角和翅中的表達(dá)量顯著高于在雄成蟲其他組織中的(F5,12=206.31,P<0.05)，其中PyasCSP4在雄成蟲觸角中的表達(dá)量最高，分別為在雄成蟲頭(去除觸角)、胸、腹和足中表達(dá)量的1.14, 1.82, 3.56和2.91倍。PyasCSP4在成蟲觸角、頭(去除觸角)、足和翅中的表達(dá)量存在性別差異，在雌成蟲觸角(t=13.65,P<0.05)、頭(去除觸角)(t=9.11,P<0.05)和翅(t=21.71,P<0.05)中的表達(dá)量顯著高于在雄成蟲中的，在雄成蟲足(t=7.63,P<0.05)中的表達(dá)量顯著高于在雌成蟲中。

圖3 PyasCSP4在棗食芽象甲成蟲不同組織中的表達(dá)量Fig. 3 Expression levels of PyasCSP4 in differenttissues of Scythropus yasumatsui adultsAn: 觸角Antenna; He: 頭(去除觸角) Head without antenna; Th: 胸Thorax; Ab: 腹Abdomen; Le: 足Leg; Wi: 翅Wing. 圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；柱上不同大寫字母和小寫字母分別表示雌成蟲和雄成蟲不同組織間的基因相對表達(dá)量差異顯著(P<0.05, Tukey氏法)，星號和ns分別表示雌、雄成蟲間相同組織中的基因相對表達(dá)量經(jīng)t檢驗(yàn)差異顯著(P<0.05)和差異不顯著(P>0.05)。Data in the figure are mean±SE. Different uppercase and lowercase letters above bars indicate significant difference in the gene relative expression levels among different tissues of female adults and male adults, respectively (P<0.05, Turkey’s test). The asterisk and ns indicate significant difference (P<0.05) and no significant difference (P>0.05), respectively, in the gene relative expression levels in the same tissue between female adults and male adults by t-test.

2.4 重組蛋白PyasCSP4的原核表達(dá)及純化

重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a(+)/PyasCSP4轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞BL21，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后用12% SDS-PAGE檢測，結(jié)果表明未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的菌液中沒有出現(xiàn)目標(biāo)蛋白條帶，目標(biāo)蛋白主要在上清中表達(dá)(圖4)。表達(dá)蛋白經(jīng)過純化和腸激酶切后，分別在30 kD左右(圖4: A, 5泳道)和12 kD左右(圖4: A, 6泳道)出現(xiàn)單一條帶，表明獲得了純度較高的蛋白。Western blot免疫印跡檢測也表明在相應(yīng)位置產(chǎn)生特異性條帶，說明該條帶為目的蛋白條帶(圖4: B, 7泳道)。測定腸激酶切后的PyasCSP4蛋白濃度為0.66 mg/mL。

圖4 PyasCSP4重組蛋白的SDS-PAGE(A)及Western blot(B)檢測Fig. 4 SDS-PAGE (A) and Western blot (B) analysesof the recombinant PyasCSP4M: 蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量 Protein molecular weight marker; 1: 未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的pET32a(+)/PyasCSP4表達(dá)產(chǎn)物 Expression product of pET32a(+)/PyasCSP4 without induction with IPTG; 2: 經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的pET32a(+)/PyasCSP4表達(dá)產(chǎn)物 Expression product of pET32a(+)/PyasCSP4 induced with IPTG; 3: 上清中的表達(dá)產(chǎn)物 Expression product in supernatant; 4: 包涵體中的表達(dá)產(chǎn)物 Expression product in inclusion bodies; 5: 純化的PyasCSP4重組蛋白 Purified recombinant PyasCSP4; 6: 經(jīng)腸激酶切除His標(biāo)簽后純化的PyasCSP4重組蛋白 Purified recombinant PyasCSP4 without His-tag; 7: 純化的PyasCSP4重組蛋白Western blot檢測 Purified recombinant PyasCSP4 detected by Western blot.

2.5 重組PyasCSP4與棗樹揮發(fā)物的結(jié)合能力

利用Scatchard方程計(jì)算出重組PyasCSP4與1-NPN的解離常數(shù)(Ki)為4.311 μmol/L(圖5)，表明兩者間具有較強(qiáng)的結(jié)合能力且具有飽和效應(yīng)。熒光競爭結(jié)合實(shí)驗(yàn)測定結(jié)果表明，有25種化合物配體能將CSP4/1-NPN復(fù)合物的熒光強(qiáng)度值下降至50%(Ki<20 μmol/L)，表明PyasCSP4的結(jié)合譜較寬(表2)。PyasCSP4與7種醇類化合物均能結(jié)合，其中與1-戊烯-3-醇和芳樟醇有較強(qiáng)的結(jié)合能力，Ki分別為8.17和9.85 μmol/L，與其他5種醇類均具有中等的結(jié)合能力(圖6: A)。在9種萜類化合物中，PyasCSP4與α-蒎烯、α-水芹烯和羅勒烯的結(jié)合能力最強(qiáng)，Ki分別為6.29, 6.58和6.69 μmol/L，與3-蒈烯、莰烯和D-檸檬烯也有中等的結(jié)合活性，Ki分別為10.60, 12.77和13.36 μmol/L，與月桂烯結(jié)合能力很弱，與β-石竹烯和角鯊烯沒有結(jié)合能力(圖6: B)。在9種酯類中，PyasCSP4與異戊酸葉醇酯、丁酸乙酯和2-甲基丁酸葉醇酯的結(jié)合能力較強(qiáng)，Ki分別為8.47, 9.13和9.30 μmol/L，與乙酸丁酯和2-甲基丁酸乙酯有中等結(jié)合能力，與乙酸葉醇酯、己酸乙酯結(jié)合能力很弱，與棕櫚酸甲酯和油酸甲酯沒有結(jié)合能力(圖6: C)。在6種醛類中，PyasCSP4除與反-2-己烯醛沒有結(jié)合能力外，與其他5種化合物均具有中等以上的結(jié)合能力，其中與辛醛的結(jié)合能力較強(qiáng)，Ki為8.47 μmol/L(圖6: D)。在4種其他化合物中，PyasCSP4與檸檬腈和2-甲基-1-苯基丙烯的Ki分別為10.64和14.42 μmol/L，與丁香酚的結(jié)合能力很弱，與十二烷沒有結(jié)合能力(圖6: E)。

圖5 重組蛋白PyasCSP4與1-NPN的結(jié)合曲線Fig. 5 Binding curve of the recombinant PyasCSP4with 1-NPN

圖6 重組蛋白PyasCSP4與不同棗樹揮發(fā)物的結(jié)合曲線Fig. 6 Binding curves of the recombinant PyasCSP4 with different jujube volatiles

表2 重組蛋白PyasCSP4與不同棗樹揮發(fā)物(配體)的結(jié)合特性Table 2 Binding characteristics of the recombinant PyasCSP4 with different jujube volatiles (ligands)

3 結(jié)論與討論

本研究首次克隆獲得了棗食芽象甲化學(xué)感受蛋白基因PyasCSP4的cDNA序列。序列分析表明該基因編碼的氨基酸序列具有4個(gè)保守的半胱氨酸殘基，N端有18個(gè)氨基酸組成的信號肽序列，不存在跨膜結(jié)構(gòu)域，是典型的分泌蛋白，且排列方式為C1-X6-C2-X18-C3-X2-C4(圖1)，與鞘翅目、雙翅目、半翅目和鱗翅目等昆蟲的CSP蛋白相似，表明化學(xué)感受蛋白在昆蟲種間和種內(nèi)具有保守性(Xuetal., 2009)。氨基酸序列比對及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系表明，PyasCSP4與其他鞘翅目昆蟲CSP的序列同源性較低，且PyasCSP4在系統(tǒng)發(fā)育樹中沒有與其他CSP聚為一支(圖2)，表明PyasCSP4與目前已有研究的其他鞘翅目昆蟲CSP的進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)，推測可能與相近物種CSP研究較少有關(guān)(李慧等, 2018; 饒福強(qiáng)等, 2021)。

RT-qPCR結(jié)果 (圖3) 表明，PyasCSP4基因在棗食芽象甲雌、雄成蟲不同組織中均有表達(dá)，但表達(dá)量有所差異，該基因在雌成蟲的觸角和翅中表達(dá)量顯著高于其他組織。PyasCSP4在翅中表達(dá)量較高的結(jié)果與綠盲蝽AlucCSP2和AlucCSP3(Huaetal., 2013)、褐飛虱NlugCSP5(Yangetal., 2014)、粘蟲MsepCSP8(Younasetal., 2018)和梨小食心蟲GmolCSP8(Lietal., 2019)等基因的組織表達(dá)譜結(jié)果相似。且研究發(fā)現(xiàn)CSP在東亞飛蝗翅上的化學(xué)感器中大量表達(dá)，表明除觸角外，翅部也可能參與化學(xué)感受過程，并在嗅覺和味覺識別中發(fā)揮重要作用(Zhouetal., 2008; Huaetal., 2013)。因此，推測PyasCSP4可能參與了棗食芽象甲對嗅覺或味覺的識別，其具體功能還有待于進(jìn)一步研究。另外，PyasCSP4基因在棗食芽象甲雌、雄成蟲腹部的表達(dá)量較低(圖3)，推測PaysCSP4可能不參與性腺中性信息素的識別和運(yùn)輸(Lietal., 2015)。

本研究通過對PyasCSP4進(jìn)行原核表達(dá)和純化，獲取了可用于熒光競爭結(jié)合實(shí)驗(yàn)的目的蛋白。熒光競爭結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (圖6) 表明，PyasCSP4具有廣泛的氣味結(jié)合譜，能夠與多種氣味配體，包括醇、萜、酯、醛、烯烴及腈類等物質(zhì)產(chǎn)生較為廣譜的結(jié)合能力，尤其與α-蒎烯、α-水芹烯和羅勒烯等萜類物質(zhì)的結(jié)合能力最強(qiáng)(表2)。閻雄飛等(2020)測定棗食芽象甲成蟲對26種棗樹揮發(fā)性物質(zhì)的EAG和行為反應(yīng)結(jié)果表明，羅勒烯、棕櫚酸甲酯和壬醛對雌、雄成蟲均有明顯吸引作用，反-2-己烯醇對雌成蟲表現(xiàn)出引誘作用。PyasCSP4與羅勒烯、壬醛和反-2-己烯醇這3種揮發(fā)物均有中等以上的結(jié)合能力(表2)，表明其可能在棗食芽象甲搜尋寄主植物過程中發(fā)揮重要化學(xué)感受作用；而PyasCSP4與棕櫚酸甲酯不能結(jié)合，推測其與棕櫚酸甲酯的分子特性有關(guān)。相關(guān)研究表明，在一定范圍內(nèi)，蛋白和配體的結(jié)合能力隨氣味分子的碳原子數(shù)量增加而逐漸降低(Yuetal., 2009; Yinetal., 2012)。本研究中PyasCSP4除與橙花叔醇(C15)有中等結(jié)合能力外，與其他碳原子數(shù)量超過11的配體，如與十二烷(C12)、β-石竹烯(C15)、棕櫚酸甲酯(C17)、油酸甲酯(C19)和角鯊烯(C30)均無法結(jié)合(表2)，表明氣味分子碳原子數(shù)量對PyasCSP4與配體的結(jié)合影響較大。另外，配體的分子空間構(gòu)象也能影響PyasCSP4的結(jié)合能力，如α-蒎烯、α-水芹烯、羅勒烯、3-蒈烯、莰烯、D-檸檬烯和月桂烯均為鏡像異構(gòu)體，PyasCSP4與α-蒎烯、α-水芹烯和羅勒烯表現(xiàn)出很強(qiáng)的結(jié)合活性，與3-蒈烯、莰烯和D-檸檬烯結(jié)合能力為中等，而與月桂烯不能結(jié)合(表2)。因此，為了精確揭示PyasCSP4與氣味分子的具體結(jié)合機(jī)制，還需解析其蛋白晶體結(jié)構(gòu)或通過同源建模及蛋白與配體的分子對接進(jìn)行驗(yàn)證(李廣偉等, 2017)。

綜上，本研究推測PyasCSP4在棗食芽象甲嗅覺識別和定位寄主植物的過程中發(fā)揮重要作用，這為闡明棗食芽象甲嗅覺機(jī)制，進(jìn)一步開展以棗食芽象甲CSP為靶標(biāo)的綠色防控措施提供了科學(xué)參考。在后續(xù)研究中，將對PyasCSP4進(jìn)行RNA干擾(RNAi)分析，從電生理和行為學(xué)水平驗(yàn)證該基因在棗食芽象甲中的生理功能。