馮渝驊， 姜 雷， 許夢瑩，3， TREMBLAY Pier-Luc，2， 張 甜，2，3，4，5*

(1.武漢理工大學(xué)化學(xué)化工與生命科學(xué)學(xué)院， 武漢 430070； 2. 武漢理工大學(xué)三亞科教創(chuàng)新園， 海南 三亞 572024；3.武漢理工大學(xué)紹興高等研究所， 浙江 紹興 312300； 4.武漢理工大學(xué)硅酸鹽建筑材料國家重點實驗室， 武漢 430070；5.武漢理工大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院， 武漢 430070)

作為一種綠色環(huán)保的能源獲取方式，光催化材料自20世紀(jì)70年代由日本學(xué)者Fujishima發(fā)現(xiàn)并報導(dǎo)后[1]，受到全世界學(xué)者的關(guān)注.ZnSe作為一種半導(dǎo)體材料有著合適的禁帶寬度2.69 eV[2]，能夠吸收可見光并產(chǎn)生光生電子—空穴對，將水中的H+還原為H2，并有許多學(xué)者對此進行了研究和報導(dǎo)[3-5].硒化鋅制備通常以操作簡單的水熱法制得[5-6]，且相比石墨相氮化碳有著更窄的禁帶寬度[7]，而禁帶寬度更為優(yōu)秀的硫化鎘中含有的鎘元素被認為是對人體腎臟有極大危害性的重金屬元素[8]，硒化鋅相比之下具有更好的生物相容性[9-10].因此，硒化鋅作為一種半導(dǎo)體光催化材料有著很大的發(fā)展前景.然而光催化材料只能將水還原為氫氣或進行污染物降解[2，6，11]，也有學(xué)者對光電催化還原二氧化碳進行了研究，但是總體的效率仍然偏低[12].生物發(fā)酵可以在溫和的條件下大量獲得對人有利用價值的有機物[13-14]，近年有學(xué)者提出，將光催化材料與微生物發(fā)酵系統(tǒng)相結(jié)合，將光催化材料作為無法直接利用太陽能的微生物和陽光之間的能量橋梁，提升微生物發(fā)酵產(chǎn)物獲取量[15]，并且有學(xué)者將光電化學(xué)與Spromusaovata2662相結(jié)合，達到提升其乙酸產(chǎn)量的目的，并將該系統(tǒng)稱為“人工光合系統(tǒng)”[16]，還有學(xué)者通過將光催化材料與RalstoniaeutrophaH16相結(jié)合，提升了發(fā)酵系統(tǒng)的聚-β-羥基丁酸酯(PHB)的積累量[17-19]，這種生物雜化光合系統(tǒng)能夠充分利用太陽光獲得多碳有機物，并且整個過程綠色環(huán)保，是一個十分有潛力的研究方向.本次研究選用RalstoniaeutrophaH16作為生物雜化光合系統(tǒng)的發(fā)酵菌株，通過ZnSe和R.eutrophaH16共同構(gòu)成生物雜化光合系統(tǒng)，用于提升PHB的產(chǎn)量.

1 材料和方法

1.1 材料

實驗所用試劑均未經(jīng)過進一步純化，未特殊說明均來自國藥化學(xué)試劑有限公司，分析純.具體使用試劑如下：氯化銨，硫酸鉀，七水合硫酸鎂，二水合磷酸二氫鈉，十二水合磷酸氫二鈉，二水合氯化鈣，七水合硫酸亞鐵，七水合硫酸鋅，一水合硫酸錳，鹽酸(信陽市化學(xué)試劑廠，分析純)，大豆蛋白胨(上海源葉生物科技有限公司，分析純)，胰蛋白胨(Sigma-Aldrich 試劑有限公司，分析純)，氯化鈉，磷酸氫二鉀，濃硫酸(信陽市化學(xué)試劑廠，分析純)，氯仿，甲醇，75%乙醇(武漢興和達商貿(mào)有限公司，75±5%)，高純氮氣(武漢同合氣體有限公司，99.999%)，氫氧化鈉，六水合硝酸鋅，硼氫化鈉，硒粉，二次蒸餾水，果糖(北京蘭杰柯科技有限公司，99%)，抗壞血酸.

1.2 分析儀器

氣相色譜儀GC 9720，浙江福立分析儀器股份有限公司；氣相色譜儀GC 9790plus，浙江福立分析儀器股份有限公司，高效液相色譜儀Breeze 2，Waters公司，美國；S-4800掃描電子顯微鏡，日立公司，日本；JEM-1011型透射電子顯微鏡，日本電子株式社會，日本；D8 ADVANCE粉末X射線衍射儀，Bruker公司，美國；UV 2550紫外可見光分光光度計，島津公司，日本.

1.3 ZnSe合成方法

稱取4 g NaOH溶解于100 mL水中，取25 mL配置好的NaOH溶液溶解1 g NaBH4，稱取2.087 g 硒粉置于三口燒瓶，并加入10 mL配置好的NaOH，密封后通入氮氣30 min，后將NaBH4溶液加入三口燒瓶，攪拌至硒粉完全溶解，稱取7.864 g六水合硝酸鋅，加入100 mL聚四氟乙烯內(nèi)襯中，并向其中加入45 mL NaOH溶液以及含硒前驅(qū)液，混勻后放入反應(yīng)釜中，在恒溫干燥箱中200 ℃反應(yīng)24 h，自然冷卻后離心，取沉淀，用二次蒸餾水水洗至中性，在恒溫干燥箱中避光干燥24 h，得到成品ZnSe.

1.4 Ralstonia eutropha H16培養(yǎng)方法

在-80℃冰箱中取出凍存的RalstoniaeutrophaH16(北納生物)，用接種環(huán)接種在加了5 mL TSB培養(yǎng)基試管中，TSB培養(yǎng)基各組份為17 g·L-1胰蛋白胨，3 g·L-1大豆蛋白胨，5 g·L-1NaCl，2.5 g·L-1K￣HPO￣4.在恒溫搖床(ZWY-2102C，上海智城分析儀器制造有限公司)中以30 ℃，200 r·min-1，培養(yǎng)24 h后取5 μL菌液，接種于含5 mL氮源限制培養(yǎng)基的試管中[20]，培養(yǎng)基各組份為1 g·L-1NH4Cl， 5.2 g·L-1Na2HPO4·2H2O，11.6 g·L-1Na2HPO4·12H2O，0.45 g·L-1K2SO4，0.8 g·L-1MgSO4·7H2O，0.082 g·L-1CaCl2·2H2O，1 mL·L-1微量元素溶液，20 g·L-1果糖，微量元素溶液成分為15 g·L-1FeSO4·7H2O，2.4 g·L-1MnSO4·H2O，2.4 g·L-1ZnSO4·7H2O，0.48 g·L-1CuSO4·5H2O，0.1 mol·L-1HCl.在恒溫搖床中培養(yǎng)至D(600)(600 nm波長下光吸收度)值為1，取50 μL菌液接種至加有不同ZnSe的氮源限制培養(yǎng)基中，在光照培養(yǎng)箱(GZL-P280D，合肥斯卡特生物科技有限公司)中在30 ℃，200 r·min-1下培養(yǎng)120 h，并對不同時間點的細菌PHB含量，培養(yǎng)基果糖濃度進行測試.

1.5 ZnSe產(chǎn)氫實驗方法

在總體積為120 mL的玻璃瓶中加入20 mg 合成的ZnSe材料，并加入0.4 mol·L-1的抗壞血酸[1]，以厭氧橡皮塞密封后通入純氮氣30 min，隨后超聲5 min，在500 W 氙燈太陽光模擬器(PL-XQ500W，北京普林塞斯科技有限公司)下進行光照，濾光片為波長大于420 nm.循環(huán)實驗在每次測試后鼓氣40 min，其余條件同上.

1.6 PHB測定方法

取4 mL菌液，以10 000×g相對離心力離心，收集沉淀，加入1.96 mL甲醇，0.04 mL濃硫酸，2 mL氯仿，在恒溫干燥箱中100 ℃反應(yīng)4 h，冷卻后加1 mL 二次蒸餾水，振蕩萃取，取下清液，用氣相色譜儀進行測試，色譜柱為RB-FFAP.

1.7 果糖濃度測試方法

取1 mL菌液，以10 000×g相對離心力離心，收集上清液，用高效液相色譜儀，視差檢測器進行測試，流動相為0.005 mol·L-1H2SO4，柱溫為50 ℃.

1.8 細胞干重占比，收率，量子效率的計算

取培養(yǎng)120 h后的4 mL菌液，離心后取沉淀，在恒溫干燥箱中干燥至衡重，記錄細胞干重質(zhì)量，收集到的PHB質(zhì)量比上細胞干重的值記為PHB在細胞干重中的占比CDW%.收率計算公式(1)如下：

Y=cPHB(g·L-1)/c果糖下降(g·L-1)× 100%，

(1)

其中，Y為果糖轉(zhuǎn)化為PHB的收率.量子效率計算通過假設(shè)系統(tǒng)中額外產(chǎn)生的PHB均來自光催化材料為細菌提供的額外還原當(dāng)量，計算額外產(chǎn)生的PHB所需的電子數(shù)與光激發(fā)電子數(shù)之間比值得到量子效率[17]，具體見反應(yīng)式(2)～(3)及公式(4)：

Acetoacetyl-CoA+NADPH+H+=

(R)-hydroxybutyryl-CoA+NADP+，

(2)

NADP++2e-+2H+=NADPH+H+，

(3)

量子效率=2×

(額外生成的PHB所需電子數(shù))/光激發(fā)電子數(shù)×

100%.

(4)

2 結(jié)果與討論

2.1 ZnSe光催化材料的表征

2.1.1 ZnSe材料的XRD表征 通過XRD表征可以觀察到，該水熱法合成的硒化鋅是經(jīng)典的閃鋅礦結(jié)構(gòu)是立方晶系面心晶格結(jié)構(gòu)，空間群號為216號，4個峰對應(yīng)的出峰角度和對應(yīng)晶面分別為27.2°(1 1 1)晶面，45.2°(2 2 0)晶面，53.6°(3 1 1)晶面和65.9°(4 0 0)晶面，對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)JCPDS號為37-1463，圖1為ZnSe的XRD表征結(jié)果.

圖1 ZnSe X射線衍射表征

2.1.2 ZnSe材料的UV-Vis表征 由于紫外光對微生物有很大的傷害，因此需要光催化材料在可見光范圍內(nèi)也能夠工作.通過對樣品進行200～800 nm范圍的UV-Vis表征測試，圖2(a)為ZnSe的UV-Vis表征結(jié)果，可以得到ZnSe的最大吸收波長為460 nm，說明該材料可以在可見光波長范圍內(nèi)工作，符合該次實驗的要求.通過Kubelka-Munk公式對光吸收圖譜進行歸一化換算，換算公式如下：

(F(R)·hυ)2=A·(hυ-Eg)，

(3)

其中，F(xiàn)(R)，hυ，A和Eg分別為Kubelka-Munk變量，能量子，儀器常數(shù)和禁帶寬度.圖2(b)為換算圖.從圖中斜率最大處做切線，可以得到該次實驗合成的ZnSe禁帶寬度約為2.52 eV，大于光催化水分解所需的1.23 eV[2]，結(jié)合圖2(a)的結(jié)果，可以說明材料能夠在可見光范圍內(nèi)光催化分解水產(chǎn)氫.

圖2 ZnSe的UV-Vis圖譜及歸一化公式計算圖

2.1.3 ZnSe材料的SEM表征，TEM表征 材料的SEM表征結(jié)果見圖3(a)和圖3(b)，TEM表征結(jié)果見圖3(c).可以觀察到材料呈不規(guī)則塊狀顆粒，有明顯的團聚現(xiàn)象，顆粒的粒徑在150～400 nm之間.粒徑不均勻的可能原因在于反應(yīng)過程全程在水相溶液中進行，沒有加入有機試劑進行分散，且反應(yīng)過程為靜置反應(yīng)，會出現(xiàn)顆粒結(jié)晶聚集的情況.

圖3 ZnSe半導(dǎo)體材料的形貌

2.2 ZnSe半導(dǎo)體光催化產(chǎn)氫實驗

該次實驗首先對ZnSe在可見光范圍內(nèi)光催化水分解產(chǎn)氫的性能進行了研究，對比添加犧牲劑和不添加犧牲劑光照1 h的產(chǎn)氫量，結(jié)果如圖4(a)所示，可以發(fā)現(xiàn)ZnSe在不添加犧牲劑的情況下并未測出氫氣的產(chǎn)生，在添加抗壞血酸作為電子犧牲劑時，得到了2.39 mmol·g-1·h-1的氫氣生成速率.這是由于抗壞血酸作為電子犧牲劑所需要的氧化能級相比O2-更低，因此更容易被氧化，填補光生空穴的電子空缺[21]，具體的過程表示如式(4)所示：

(4)

其中，AA為抗壞血酸，h·為光生空穴，DHA為脫氫抗壞血酸，e-為光生電子.

實驗還對ZnSe材料連續(xù)光催化產(chǎn)氫進行了測試，結(jié)果如圖4(b)所示，在3 h的產(chǎn)氫測試中，每1 h對氫氣的含量進行測試，第1、2、3 h的氫氣產(chǎn)生量分別為2.39、6.03、7.55 mmol·g-1·h-1，在1 h至2 h之間，此時由于連續(xù)光照，反應(yīng)器的溫度上升，增強了反應(yīng)活性，因此使得氫氣的產(chǎn)量高于第1 h時的氫氣含量.

在ZnSe的循環(huán)性能測試中，對其進行了3 h 3次循環(huán)實驗，結(jié)果如圖4(c)所示.在第3次循環(huán)的3 h氫氣產(chǎn)生量為3.03 mmol·g-1·h-1，相比第1次循環(huán)3 h的6.03 mmol·g-1·h-1有明顯的下降，是第1次循環(huán)3 h時的50.3%，這是由于材料中的Se2-被氧化，催化劑的活性逐漸下降.

圖4 ZnSe 光催化產(chǎn)氫測試結(jié)果

2.3 光照對ZnSe生物雜化光合系統(tǒng)的影響

該次實驗將ZnSe與RalstoniaeutrophaH16進行異養(yǎng)生長混合培養(yǎng)，并測量了120 h培養(yǎng)中PHB的積累量變化曲線圖5.通過對比未加入ZnSe的光照/黑暗組和加入1 g·L-1ZnSe的光照/黑暗組，可以發(fā)現(xiàn)，在所有實驗組中，R.eutropha均在72至96 h時快速在體內(nèi)積累PHB，在96 h處達到最高值，并在120 h后趨于穩(wěn)定.在96 h時1 g·L-1ZnSe光照和黑暗組PHB濃度為1.82 g·L-1和0.81 g·L-1，未加材料的光照和黑暗組分別為0.98 g·L-1和0.78 g·L-1，說明當(dāng)沒有加入光催化材料時，R.eutropha不能直接利用可見光促進自身的代謝積累PHB，當(dāng)加入材料而不光照時，光催化材料本身也對R.eutropha積累PHB沒有影響，只有當(dāng)整個系統(tǒng)同時滿足光照并加入光催化材料時，R.eutropha才能利用光能促進自身積累PHB.在長達120 h的培養(yǎng)實驗中，1 g·L-1材料光照組在72 h時開始有明顯的提升，并且保持與其他組的差距，說明材料在該系統(tǒng)中保持著長時間的穩(wěn)定性，通過結(jié)合ZnSe材料的催化劑失活機理，可以推測，在系統(tǒng)中有可以充當(dāng)電子犧牲劑的物質(zhì)存在，并能夠使光生電子與材料快速分離，使得ZnSe能夠一直保持穩(wěn)定.該次合成的ZnSe適用于與R.eutropha共同構(gòu)建生物光合雜化系統(tǒng)，對該系統(tǒng)生物發(fā)酵有明顯的提升作用.已經(jīng)有學(xué)者對相關(guān)的機理進行了一定的研究[17-19]，在光催化材料與微生物構(gòu)成的生物雜化光合系統(tǒng)中，光催化劑在光照時產(chǎn)生光生電子和氫氣等還原當(dāng)量會通過微生物細胞表面，進入細胞體內(nèi)，并顯著提高微生物體內(nèi)的NADPH/NADP+的水平，而NADPH作為R.ertrophaH16在代謝積累還原PHB的過程中起到充當(dāng)電子供體的作用，因此，光催化材料通過提供外源電子的方式可以顯著提高PHB在微生物中的積累量.

圖5 不同材料光照條件下R.eutropha異養(yǎng)生長120 h PHB累積濃度曲線

2.4 ZnSe濃度對生物雜化光合系統(tǒng)的影響

為了得到最佳的材料濃度，該次實驗還對不同濃度ZnSe對R.eutropha代謝積累PHB的影響進行了實驗.對0.3～3 g·L-1ZnSe組異養(yǎng)培養(yǎng)120 h后的PHB含量進行測試，結(jié)果如圖6所示，在與未加材料光照組的結(jié)果比較中可以看到，0.3 g·L-1ZnSe材料對系統(tǒng)并沒有明顯的影響，隨著ZnSe濃度的不斷升高，PHB在細菌體內(nèi)的積累量也逐漸升高，在1 g·L-1時達到最高，此時PHB的積累量為1.70 g·L-1，相比未加材料光照組的0.91 g·L-1提升約1.87倍，當(dāng)材料濃度繼續(xù)上升時，R.eutropha對PHB的積累量也逐漸下降，但材料濃度增加至3 g·L-1時，仍能得到1.46 g·L-1的PHB產(chǎn)量，系統(tǒng)中PHB產(chǎn)量下降是因為當(dāng)材料濃度過大時，材料無法充分利用光能，細菌也無法充分與材料相結(jié)合.因此說明該系統(tǒng)中ZnSe的最佳濃度為1 g·L-1，當(dāng)材料濃度上升至最佳濃度的3倍仍然對系統(tǒng)有著促進作用，說明該材料有著優(yōu)異的生物相容性.

圖6 120 h后不同ZnSe含量PHB積累量

2.5 系統(tǒng)效率的計算

通過對細胞干重(cell dry weight， CDW)，果糖轉(zhuǎn)化PHB收率和量子效率的計算可以得到表1，其中PHB的量子效率計算以在8 690 lx光強下，未加入材料的R.eutrophaH16異養(yǎng)生長120 h后得到的PHB產(chǎn)量為空白值，其余實驗組在相同條件下得到的PHB減去空白值得到的額外PHB產(chǎn)量被認為是由光子經(jīng)光催化劑轉(zhuǎn)化為細菌可以利用的形式進入細菌體內(nèi)轉(zhuǎn)化產(chǎn)生.從表1中可以看到，隨著ZnSe濃度不斷上升，CDW從20%提升至35%，隨后逐漸下降至32%.果糖的消耗量見圖7，總體上隨著材料的加入，果糖的消耗量也隨之上升，但除0.3 g·L-1以外，其余材料濃度的果糖對PHB的轉(zhuǎn)化率都高于未加材料組，最高可達到18%，說明在該系統(tǒng)中，材料可以促進細菌利用果糖并將果糖轉(zhuǎn)化為PHB.在量子效率的計算中，1 g·L-1ZnSe實驗組的量子效率可以達到19%，說明光子轉(zhuǎn)化為微生物積累PHB所利用的還原當(dāng)量的效率比較高.

圖7 不同ZnSe濃度組120 h果糖消耗量

表1 PHB細胞干重占比，果糖轉(zhuǎn)化收率和量子效率

3 結(jié)論

通過水熱法合成的ZnSe顆粒粒徑在200 nm至400 nm之間，且禁帶寬度為2.52 eV，屬于可見光范圍能夠進行光催化水分解的光催化材料，在單純材料產(chǎn)氫的測試中，加入犧牲劑以后有2.39 mmol·g-1·h-1的氫氣產(chǎn)生速率，但是在循環(huán)實驗中表現(xiàn)出材料的穩(wěn)定性不佳，但是通過與R.eutropha的結(jié)合，構(gòu)筑生物光合雜化系統(tǒng)后可以明顯提升R.eutropha的PHB積累量，在本次實驗中，ZnSe的最佳濃度為1 g·L-1，此時得到1.82 g·L-1的PHB積累量，是空白對照組的1.87倍.在ZnSe濃度增加后系統(tǒng)的PHB產(chǎn)量仍比未加材料組高，說明材料有良好的生物相容性.ZnSe對R.eutropha的促進作用通過提升細菌利用果糖的力能和將果糖轉(zhuǎn)化為PHB的能力上，具體表現(xiàn)為加材料組的CWD高于未加材料組，果糖轉(zhuǎn)化PHB收率也高于未加材料組，且1 g·L-1ZnSe時系統(tǒng)的量子效率達到最高，此次研究旨在通過一種綠色環(huán)保的且低成本方式提升微生物發(fā)酵系統(tǒng)的效率和產(chǎn)物產(chǎn)量.