梁正，范穎欣，聶署萍

1 中山大學(xué)附屬第八醫(yī)院檢驗科，廣東 深圳 518033；2 廣東省興寧市第三人民醫(yī)院檢驗科

近年來，細菌耐藥已成為全球公共健康領(lǐng)域的重大挑戰(zhàn)。細菌的藥物敏感性測定能指導(dǎo)臨床合理用藥，避免抗生素的濫用，延緩耐藥菌的產(chǎn)生［1-3］。細菌藥敏試驗的常規(guī)方法主要有肉湯稀釋法、K-B 紙片擴散法、E-test 及自動化藥敏分析系統(tǒng)。自動化藥敏分析系統(tǒng)操作簡單、易標(biāo)準(zhǔn)化，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于臨床微生物實驗室［4-10］。BD Phoenix 和VITEK 2 Compact 是目前應(yīng)用最為廣泛的全自動微生物分析系統(tǒng)［11-15］。革蘭陽性細菌藥敏板PMIC-92 和革蘭陰性細菌藥敏板NMIC-413是根據(jù)臨床市場特征和病原菌流行病學(xué)現(xiàn)狀而設(shè)計的兩款新型藥物敏感性檢測試劑板。與其他商品化的藥敏檢測試劑相比，PMIC-92 和NMIC-413 藥敏板增加了抗菌藥物數(shù)量，如PMIC-92藥敏板包括磷霉素、米諾環(huán)素、頭孢洛林等，NMIC-413 藥敏板包括磷霉素、替加環(huán)素、頭孢哌酮/舒巴坦和多黏菌素等，為臨床抗感染藥物的選擇提供更多支持，進一步提高了臨床微生物實驗室細菌藥物敏感性的檢測能力。此外，這兩種藥敏板還依據(jù)細菌耐藥監(jiān)測數(shù)據(jù)對特定藥物擴大了MIC 檢測范圍。目前，國內(nèi)評估這兩種藥敏板檢測性能的研究少見。本研究以實驗室現(xiàn)有的VITEK 2 Compact 系統(tǒng)結(jié)合K-B 紙片擴散法作為參比方法，評估PMIC-92、NMIC-413 藥敏板對臨床菌株的藥敏檢測性能。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 收集2018 年7—10 月中山大學(xué)附屬第八醫(yī)院微生物室從臨床送檢各類標(biāo)本中分離的40 株臨床株［革蘭陽性菌17 株（葡萄球菌13 株、腸球菌4 株）、革蘭陰性菌23 株（腸桿菌科細菌15株、非發(fā)酵菌8 株）］及4 株實驗室保存的標(biāo)準(zhǔn)菌株（大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853、金黃色葡萄球菌ATCC29213、糞腸球菌ATCC29212）。標(biāo)準(zhǔn)菌株使用前通過甘油肉湯保存于-80 ℃環(huán)境中。復(fù)蘇后每天檢測3次，重復(fù)5 d，各測15 次。

1.2 主要儀器與試劑 BD Phoenix M50 全自動微生物鑒定藥敏分析儀及其配套NMIC-413 陰性細菌藥敏檢測板和PMIC-92 陽性細菌藥敏檢測板。BD Phoenix 鑒定及藥敏試驗培養(yǎng)液，藥敏指示劑（美國BD 公司）。Vitek 2 Compact 全自動微生物鑒定藥敏分析儀、Vitek 2 Compact GN 和GP 鑒定卡、Vitek 2 Compact AST-GN13、AST-GN335 及ASTGP639 藥敏卡（法國生物梅里埃公司）、藥敏紙片（英國OXOID 公司）、血瓊脂平板（安圖）、MH 瓊脂平板（凱林）、游標(biāo)卡尺、比濁儀、渦旋儀。

1.3 細菌藥敏檢測 將菌株接種至含有5%羊血的血瓊脂平板上，在35 ℃環(huán)境中孵育18～24 h。從平板上挑取單個菌落，傳代1 次。然后分別按照BD Phoenix M50 及Vitek 2 Compact 全自動微生物鑒定藥敏分析儀操作規(guī)程進行操作。對于部分Vitek 2 Compact 無法檢測的藥物，補充K-B 紙片擴散法檢測。藥敏結(jié)果參考CLSI2020 的折點報告其敏感（S）、中介（I）、耐藥（R）結(jié)果，當(dāng)結(jié)果出現(xiàn)重大差異（MD）和極重大差異（VMD）時，進行重復(fù)測定。①BD Phoenix M50 PMIC-92 和NMIC-413 藥 敏檢測：a.用無菌棉拭子，挑取單個菌落在鑒定肉湯管中，配置成0.50～0.60 麥?zhǔn)蠞舛鹊木?。b.取一只藥敏肉湯管，加入45 μL 藥敏指示劑，混勻。從鑒定肉湯管中吸取25 μL 菌懸液，加入藥敏肉湯中。c.把含有菌液的藥敏肉湯管傾倒入相應(yīng)檢測板的填充端口中，陽性球菌使用PMIC-92 檢測板，陰性桿菌菌選擇NMIC-413，讓液體沿檢測板軌道來回流動，然后再將檢測板按照儀器操作流程上機檢測。②Vitek 2 Compact AST-GN13、ASTGN335 及AST-GP639 藥敏 檢 測：a.將一次 性 塑料試管放置在載卡架上，每管中加入3 mL 的0.45%NaCl 溶液。b.用無菌棉拭子，挑取單個菌落在含NaCl 溶液的塑料試管中，配置成0.5～0.63 麥?zhǔn)蠞舛鹊木?。c.分別將145 μL（AST GN）或280 μL（AST GP）配制好的菌懸液加入新的含NaCl 溶液塑料試管中，做為藥敏管。d.將相應(yīng)藥敏卡片的輸樣管插入到藥敏管中，然后將載卡架加載至機器上進行檢測。③K-B 紙片擴散法藥敏檢測：由于部分細菌—抗生素組合如腸桿菌科—頭孢哌酮/舒巴坦及頭孢呋辛，銅綠假單胞菌—氨曲南，鮑曼不動桿菌—阿米卡星及氨芐西林/舒巴坦等，通過Vitek 2 Compact 相應(yīng)藥敏卡無法獲得準(zhǔn)確的藥敏試驗結(jié)果，以上抗菌藥物通過K-B紙片擴散法進行比對。具體步驟如下：a.用無菌棉拭子，挑取單個菌落在0.45%NaCl 溶液中，配置成0.5 麥?zhǔn)蠞舛鹊木骸.接種：用無菌棉拭子蘸取菌液，在管內(nèi)壁將多余菌液旋轉(zhuǎn)擠去后，在瓊脂表面均勻涂抹接種3 次，每次旋轉(zhuǎn)平板60°，最后沿平板內(nèi)緣涂抹1 周。c.貼抗菌藥物紙片：平板置室溫干燥3～5 min，用紙片分配器或無菌鑷子將含藥紙片緊貼在瓊脂表面，各紙片中心相距＞24 mm，紙片距平板內(nèi)緣＞15 mm。d.孵育：置35 ℃孵育16～18 h 后判讀結(jié)果。e.結(jié)果判讀：用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑（抑菌圖的邊緣應(yīng)是無明顯細菌生長的區(qū)域），測量時應(yīng)將平板置于黑色背景下，肉眼判讀；按照CLSI 2020 的折點對結(jié)果進行解釋。

1.4 藥敏結(jié)果分析 a.總分類一致性（CA）：研究產(chǎn)品與參比方法判斷試驗結(jié)果為敏感（S）、中介（I）、耐藥（R），結(jié)果完全一致。b.小誤差（MIE）：研究產(chǎn)品將中介判為S 或R，將R 或S 判為I。c.重大差異（MD）：研究產(chǎn)品結(jié)果為R，參比方法結(jié)果為S。d.極重大差異（VMD）：研究產(chǎn)品結(jié)果為S，參比方法結(jié)果為R。

2 結(jié)果

針對革蘭陽性菌藥敏板PMIC-92 共評估了14種抗菌藥物，分別為青霉素（47 株）、苯唑西林（28株）、替考拉寧（47 株）、萬古霉素（47 株）、利奈唑胺（47 株）、紅霉素（47 株）、克林霉素（28 株）、替加環(huán)素（47 株）、左氧氟沙星（47 株）、莫西沙星（28 株）、慶大霉素（28 株）、達托霉素（47 株）、利福平（28 株）及復(fù)方磺胺甲噁唑（28 株）。產(chǎn)生MIE 的細菌—抗生素組合（株數(shù)）為：金黃色葡萄球菌—利福平（1 株），屎腸球菌—利奈唑胺（1株）。產(chǎn)生MD 的細菌—抗生素組合（株數(shù)）為：金黃色葡萄球菌—青霉素（1 株），金黃色葡萄球菌—慶大霉素（1 株），沃氏葡萄球菌—復(fù)方磺胺甲噁唑（1 株）。無極重大差異（VMD）的細菌—抗生素組合。PMIC-92 比對了14 種抗菌藥物，在544株細菌—抗生素組合，總分類一致性（CA）為99.08%，小誤差（MIE）率為0.37%，重大差異（MD）率為0.55%。此外，在13 株臨床分離的葡萄球菌中，PMIC-92 檢出耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）5 株，與Vitek 2 Compact AST-GP639 的符合率為100%。

針對革蘭陰性菌藥敏板NMIC-413 共評估了17 種藥物，分別為頭孢呋辛（28 株）、頭孢曲松（29 株）、氨芐西林/舒巴坦（29 株）、哌拉西林/他唑巴坦（51 株）、頭孢他啶（51 株）、頭孢吡肟（51株）、頭孢哌酮/舒巴坦（51 株）、氨曲南（49 株）、亞胺培南（51 株）、厄他培南（26 株）、美羅培南（21 株）、阿米卡星（49 株）、左氧氟沙星（51 株），環(huán)丙沙星（47 株）、復(fù)方磺胺甲噁唑（49 株），慶大霉素（29 株）、妥布霉素（19 株）。產(chǎn)生MIE 的細菌—抗生素組合（株數(shù)）為：大腸埃希菌—亞胺培南（1 株）、銅綠假單胞菌—美羅培南（1 株）、木糖氧化無色桿菌—頭孢他定（1 株）、大腸埃希菌—頭孢吡肟（1 株）、銅綠假單胞菌—氨曲南（1 株）、沙門菌屬—環(huán)丙沙星（1 株）、大腸埃希菌—氨芐西林/舒巴坦（1 株）。產(chǎn)生MD 的細菌—抗生素組合（株數(shù)）為：大腸埃希菌—頭孢吡肟（2 株）、大腸埃希菌—頭孢哌酮/舒巴坦（1 株）、木糖氧化無色桿菌—頭孢哌酮/舒巴坦（1 株）、銅綠假單胞菌—復(fù)方磺胺甲噁唑（1 株）、嗜麥芽窄食單胞菌—復(fù)方磺胺甲噁唑（1 株）、銅綠假單胞菌—亞胺培南（1 株）、大腸埃希菌—慶大霉素（1 株）。產(chǎn)生極重大差異VMD 的細菌—抗生素組合（株數(shù)）為：大腸埃希菌—氨芐西林/舒巴坦（1 株）。NMIC-413 共比對了17 種抗菌藥物，在全部681 株細菌—抗生素組合中，總CA 為97.65%，MIE 率為1.03%，MD 率為1.17%，VMD 率為0.15%。在13株大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌臨床株中，NMIC-413 檢 出10 株 產(chǎn)ESBL 細 菌，與Vitek 2 Compact AST-GN13 的符合率為100%。

3 討論

近年來，由于抗菌藥物的廣泛使用，細菌耐藥已成為全球公共衛(wèi)生領(lǐng)域的重大挑戰(zhàn)，嚴(yán)重威脅著人類健康［2-3］?？焖?、準(zhǔn)確的藥敏檢測已成為臨床抗感染治療的迫切需求，不僅能指導(dǎo)臨床合理用藥，提高療效，節(jié)省費用，還能進行耐藥監(jiān)測及流行病學(xué)調(diào)查，為抗菌藥物的臨床使用及管理提供依據(jù)。全自動微生物鑒定與藥敏分析系統(tǒng)因其操作簡單、快速、標(biāo)準(zhǔn)化的特點，越來越多地應(yīng)用于臨床微生物室［4-8］。BD Phoenix 是目前全球應(yīng)用最為廣泛的全自動微生物鑒定與藥敏分析系統(tǒng)之一，其藥敏試驗采用比濁法和氧化還原法，報告實測最小抑菌濃度，結(jié)果準(zhǔn)確可靠［16-18］。陽性菌藥敏板PMIC-92 和陰性菌藥敏板NMIC-413 是兩款藥物敏感性檢測板，與其他商品化藥敏檢測試劑比較，PMIC-92 和NMIC-413 增加了抗菌藥物數(shù)量，如在腸桿菌目細菌藥敏檢測中，陰性菌藥敏板NMIC-413 與Vitek 2 Compact AST-GN13 相比增加了磷霉素、美羅培南、米諾環(huán)素、頭孢呋辛、頭孢西丁、莫西沙星、頭孢哌酮/舒巴坦、多粘菌素等藥物；PMIC-92 與VITEK 2 GP39 相比增加了替考拉寧、諾氟沙星、呋喃妥因等藥物，為臨床抗感染疾病的治療提供更多選擇。為評估其藥敏檢測性能，本研究將PMIC-92、NMIC-413 藥敏板與實驗室現(xiàn)有的Vitek 2 Compact系統(tǒng)進行比對，部分Vitek 2 Compact 無法準(zhǔn)確檢測的抗菌藥物，則通過與K-B 紙片擴散法比較對其進行評估。

本研究選取的評估菌株包括4 株標(biāo)準(zhǔn)株和40 株臨床分離株，臨床分離株中17 株革蘭陽性菌及23 株革蘭陰性菌，可以代表大多數(shù)臨床相關(guān)致病菌。針對革蘭陽性菌藥敏板PMIC-92 共評估了14 種抗菌藥物，在544 株細菌—抗生素組合，總CA 為99.08%，MIE 率為0.37%，MD 率為0.55%，表明其藥敏測定的準(zhǔn)確性，對于部分細菌—抗生素藥敏測定的MD＞3%，如金黃色葡萄球菌—慶大霉素，沃氏葡萄球菌—復(fù)方磺胺甲噁唑等，主要是由于本研究中針對該抗生素的菌株數(shù)量較少。此外，PMIC-92 成功檢出5 株MRS，敏感性和特異性均為100%。

本研究針對革蘭陰性菌藥敏板NMIC-413 共評估了17 種藥物，在全部681 株細菌—抗生素組合中，總CA 為97.65%，MIE 率為1.03%，MD 率為1.17%，VMD 率為0.15%。部分細菌—抗生素藥敏測定的MD＞3%，如大腸埃希菌—頭孢吡肟、大腸埃希菌—頭孢哌酮/舒巴坦、木糖氧化無色桿菌—頭孢哌酮/舒巴坦，嗜麥芽窄食單胞菌—復(fù)方磺胺甲噁唑，均是由于臨床菌株數(shù)量不夠?qū)е?，后續(xù)應(yīng)加大菌株的數(shù)量，進一步驗證這些抗生素的藥敏試驗測定性能。本研究中僅1 株大腸埃希菌—氨芐西林/舒巴坦出現(xiàn)了VMD。HONG 等［19］用825株臨床分離株來評價NMIC-413 藥敏測定性能，研究發(fā)現(xiàn)除了腸球菌—環(huán)丙沙星，不動桿菌屬—頭孢吡肟組合外，其他細菌—抗生素組合中CA 均超過90%，與本研究結(jié)果一致。此外，NMIC-413 還檢測出10 株產(chǎn)ESBL 腸桿菌科細菌，與Vitek 2 Compact的符合率為100%。研究［20］評估了BD Phoenix NMIC-413 藥敏板檢測腸桿菌目細菌碳青霉烯類藥物敏感性試驗的性能，結(jié)果表明與微量肉湯稀釋法及紙片法相比，BD Phoenix NMIC-413 藥敏板能更可靠的檢測碳青霉烯類耐藥的腸桿菌目細菌。充分表明革蘭陰性菌藥敏板NMIC-413 能對臨床常見的革蘭陰性菌進行快速準(zhǔn)確的藥敏測定。

總之，藥敏板PMIC-92 和NMIC-413 能分別對臨床分離的革蘭陽性菌和革蘭陰性菌的藥物敏感性進行快速、準(zhǔn)確的測定，可應(yīng)用于臨床實驗室進行藥敏檢測。