王 興陳子琪李 林廖金花王曉琳劉江源廖東華?

(1.江西中醫(yī)藥大學(xué), 南昌 330000;2.江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院, 南昌 330006)

心力衰竭(heart failure,HF)是多種原因?qū)е滦呐K結(jié)構(gòu)和/或功能的異常改變,使心室收縮和/或舒張功能發(fā)生障礙,從而引起的一組復(fù)雜臨床綜合征,是各種心臟疾病的嚴(yán)重表現(xiàn)和晚期階段,是心臟病患者死亡的主要原因。 目前我國(guó)約有850 萬(wàn)HF 患者,患病率逐年上升,再住院率日趨上漲,死亡率居高不下[1-2]。 中醫(yī)學(xué)認(rèn)為溫陽(yáng)益氣,化痰利水為治療此病的主要法則[3],真武湯源于《傷寒論》,由附子、生姜、白芍、白術(shù)、茯苓組成,為溫陽(yáng)利水,標(biāo)本兼治的代表性方劑,臨床應(yīng)用廣泛。 為了進(jìn)一步探究真武湯治療HF 的機(jī)制,本研究通過(guò)構(gòu)建冠脈結(jié)扎心衰大鼠模型,觀察真武湯對(duì)冠脈結(jié)扎心衰大鼠模型的治療作用及對(duì)心衰大鼠心肌病理形態(tài)學(xué)及心肌細(xì)胞凋亡的影響,探討其對(duì)凋亡相關(guān)蛋白及PI3K-AKT 信號(hào)通路的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6~7 周齡,SPF 級(jí)SD 大鼠,雄性,共48 只,體重220~250 g,購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[SCXK(湘)2019-0004],動(dòng)物飼養(yǎng)于江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技中心[SYXK(贛)2017-0004],將它們安置在恒定的室溫(25±1)℃,相對(duì)濕度(55±3)%。 12 h/12 h 晝夜循環(huán),動(dòng)物自由進(jìn)食飲水。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(JZLLSC20210059),并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R 原則給予人道的關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

真武湯顆粒劑(組成:附子,白芍,白術(shù),茯苓,生姜,江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院提供,全方生藥量62 g);氯沙坦鉀片(浙江華海藥業(yè)股份有限公司,0000005951)。

PI3 Kinase p110α(C73F8)Rabbit mAb(美國(guó)CST 公司,#4249);Anti-AKT1 antibody[ST48-09](杭州華安生物,ET1609-47);Phospho-Akt1(S124)antibody(杭州華安生物,ET1701-36);Bcl-2 抗體( abcam, ab32124 ); Caspase3 抗 體 ( abcam,ab13847);Bax 抗體(abcam,ab32503);Caspase8 抗體(華安生物,RT1099);Caspase9 抗體(abcam,ab184786);二抗goat anti-rabbit IgG-HRP(愛(ài)必信生物,abs20040);ELISA 試劑盒(江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司,MM-0067R1);DAB 濃縮型試劑盒(北京索萊寶,DA1010 ); Tunel 試 劑 盒 ( Roche 公 司,11684817910)。

正置顯微鏡(徠卡顯微系統(tǒng)有限公司);恒溫烘箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司);石蠟切片機(jī)(徠克公司); 攤片機(jī)(徠克公司); 冰凍切片機(jī)(thermo);脫水機(jī)(武漢俊杰電子有限公司);包埋機(jī)(武漢俊杰電子有限公司);Western blot 系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad);Bio-Rad 凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad);高通量組織研磨器(寧波新芝生物);離心機(jī)(湖南湘儀);酶標(biāo)儀(BioTek 儀器);DW3000 型小動(dòng)物人工呼吸機(jī)(安徽正華儀器設(shè)備有限公司);MD3000 型生理信號(hào)采集系統(tǒng)(淮北正華儀器設(shè)備有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 造模方法

造模方法參考文獻(xiàn)[4],實(shí)驗(yàn)前禁食12 h,腹腔注射2%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)進(jìn)行麻醉后將其固定在鼠板上,行經(jīng)口氣管插管術(shù)后接小動(dòng)物呼吸機(jī),調(diào)頻率為80 次/分,吸呼比1 ∶2,潮氣量4.5 L。連接心電圖機(jī),測(cè)量術(shù)前心電圖。 沿著胸骨左緣約3 mm 縱行剪開(kāi)胸部皮膚4 cm,逐層鈍性分離皮下、肌肉,暴露肋骨及肋間肌,在第三肋間剪開(kāi)肋間肌,利用自制的開(kāi)胸器撐開(kāi)肋骨,開(kāi)胸后撕破心包膜,暴露心臟,于肺動(dòng)脈圓錐及左心耳交界處下方2 mm處用6-0 縫線(xiàn)結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支(left anterior descending artery,LAD),結(jié)扎后關(guān)胸,逐層縫合肌肉皮膚,測(cè)量術(shù)后心電圖,心電圖提示ST 段升高則造模成功。 測(cè)量心電圖后拔出氣管插管,術(shù)后每天每千克予青霉素24 萬(wàn)單位,共5 d,預(yù)防感染。 假手術(shù)組大鼠開(kāi)胸后立即縫合。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)分組

術(shù)后4 周采用隨機(jī)數(shù)字表法將存活的大鼠分為6 組,每組7 只,分組如下:(1)假手術(shù)組:術(shù)后4 周給予生理鹽水灌胃28 d;(2)模型組:造模4 周后予生理鹽水灌胃28 d;(3)陽(yáng)性對(duì)照組:造模4 周后予氯沙坦鉀5 mg/kg 灌胃28 d;(4)真武湯低劑量組:造模4 周后予真武湯生藥量6 g/kg 灌胃28 d;(5)真武湯中劑量組:造模4 周后予真武湯生藥量12 g/kg 灌胃28 d;(6)真武湯高劑量組:造模4 周后予真武湯生藥量18 g/kg 灌胃28 d。

1.3.3 心臟彩超測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)小動(dòng)物超聲影像系統(tǒng)Vevo2100 型由江西中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物科技中心實(shí)驗(yàn)室提供。 用異氟烷吸入麻醉,應(yīng)用MS250 超聲探頭進(jìn)行心臟超聲影像分析。 測(cè)量射血分?jǐn)?shù)(LVEF);短軸縮短率(LVFS%)。

1.3.4 樣本制備及計(jì)算左心室質(zhì)量指數(shù)(LVMI)

取材前稱(chēng)體重,大鼠麻醉后,于腹主動(dòng)脈取血,靜置離心后分離血清,置于-80℃冰箱以備ELISA檢測(cè)。 開(kāi)胸取心臟,冰生理鹽水洗凈,濾紙吸干,沿房室溝剪掉兩心房,剪掉主、肺動(dòng)脈,緊貼室間隔右側(cè)剪下右心室游離壁,剩余部分即為左心室。 稱(chēng)取左心室質(zhì)量腹主動(dòng)脈取血分離血清,計(jì)算左心室質(zhì)量/體重,即LVMI。 在結(jié)扎部位以下處經(jīng)橫斷面切取心肌組織置于4%多聚甲醛固定。 剩余左室心肌梗死邊緣組織放入凍存管內(nèi),置于液氮中冷凍保存以備蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)。 LVMI=大鼠左心室質(zhì)量/大鼠體重。

1.3.5 心臟組織HE 染色

心肌組織固定后常規(guī)包埋切片,脫蠟,常規(guī)HE染色,封片,顯微鏡下觀察病理改變。

1.3.6 TUNEL 法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡水平

將蠟塊切成厚度為5 μm 的切片,脫蠟后進(jìn)行TUNEL 染色。 中性樹(shù)膠封片,顯微鏡下觀察切片中心肌細(xì)胞的凋亡水平。

1.3.7 免疫組織化學(xué)染色法:

免疫組化染色步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。檢測(cè)心肌凋亡代表性蛋白Bax、Bcl-2、Caspase3、Caspase8、Caspase9,顯微鏡400 倍視野下隨機(jī)采取5個(gè)視野,應(yīng)用Image Pro Plus 6.0 圖像分析軟件進(jìn)行結(jié)果分析。

1.3.8 ELISA 測(cè)定

按照說(shuō)明書(shū)操作步驟進(jìn)行檢測(cè)大鼠血清中BNP 的含量。

1.3.9 Western blot 檢測(cè)蛋白表達(dá)

取20 μg 各組左室心肌勻漿蛋白樣品,用SDSPAGE 分離,然后轉(zhuǎn)至PVDF 膜上,于5%脫脂牛奶中室溫封閉2 h;將PVDF 膜與相應(yīng)的一抗在4℃下孵育過(guò)夜,洗膜后二抗孵育(37℃,1 h),再次洗膜后發(fā)光并使用Image Lab 軟件分析結(jié)果。 目的蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參照蛋白灰度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件,進(jìn)行多組間比較用單因素方差分析(One-way ANOVA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì),組間兩兩比較用方差分析后的LSD 檢驗(yàn)。 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,以P<0.05 為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 實(shí)驗(yàn)圖采用GraphPad Prism8 軟件繪制。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況及心電圖表現(xiàn)

大鼠造模后心電圖可見(jiàn)明顯ST 段抬高,提示造模成功(圖1)。 術(shù)后喂養(yǎng)4 周,模型組大鼠可見(jiàn)精神萎靡、活動(dòng)量減少、四肢及尾部稍有浮腫,各給藥組和模型對(duì)照組比較精神狀態(tài)較好,活動(dòng)較自如,四肢及尾部浮腫減輕。

圖1 大鼠心電圖Figure 1 Rat ECG

2.2 對(duì)大鼠心臟形態(tài)學(xué)指標(biāo)的影響

如表1 所示,與假手術(shù)組相比,模型組大鼠LVMI 值顯著升高(P<0.01),提示模型組出現(xiàn)明顯的左室肥厚。 LVEF 值和LVFS 值顯著下降(P<0.01),側(cè)面證明大鼠造模成功。 與模型組比較,各給藥組LVMI 值均顯著降低(P<0.01),其中中藥中劑量組效果最優(yōu),且優(yōu)于陽(yáng)性藥組;各給藥組LVEF值、LVFS 值均較模型組升高,其中中藥中劑量組顯著升高(P<0.01),中藥低、高劑量組升高明顯(P<0.05),陽(yáng)性藥組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 各組大鼠彩超圖見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠心臟彩超圖Figure 2 Color Doppler echocardiography of rats in each group

表1 心臟形態(tài)學(xué)指標(biāo)Table 1 Cardiac morphological indexes

2.3 對(duì)大鼠HE 染色的影響

相較于假手術(shù)組,模型組心肌纖維排列紊亂、斷裂,同時(shí)并伴隨著心肌細(xì)胞腫脹、肥大,有炎性細(xì)胞浸潤(rùn),與模型組比較,真武湯低、中、高劑量組及陽(yáng)性藥組心肌細(xì)胞腫脹、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)存在不同程度的減輕,心肌纖維纖維排列較模型組整齊(圖3)。

圖3 各組大鼠HE 染色圖Figure 3 HE staining diagram of rats in each group

2.4 TUNEL 染色觀察各組大鼠心肌組織中心肌細(xì)胞凋亡水平比較

如圖4 所示,可見(jiàn)凋亡細(xì)胞核被染成棕黃色,正常細(xì)胞核呈藍(lán)色。 與假手術(shù)組比較,模型組大鼠心肌組織中形態(tài)不規(guī)則,大小不一致的心肌細(xì)胞核明顯增多,提示心肌細(xì)胞凋亡情況嚴(yán)重,與模型組比較,真武湯低、中、高及陽(yáng)性藥對(duì)照組形態(tài)和大小正常的藍(lán)色細(xì)胞核明顯增多,提示經(jīng)真武湯或氯沙坦鉀干預(yù)后凋亡現(xiàn)象改善。

圖4 各組大鼠TUNEL 染色Figure 4 TUNEL staining of rats in each group

2.5 心 衰 心 肌 組 織 中 Bcl-2、 Bax、 Caspase3、Caspase8、Caspase9 表達(dá)差異

如表2 所示,與假手術(shù)組比較,模型組Bcl-2表 達(dá) 顯 著 下 降(P< 0.01), Bax、 Caspase3、Caspase8、Caspase9 表達(dá)顯著升高(P<0.01)。 與模型組相比,低劑量組Bcl-2 表達(dá)增強(qiáng)(P<0.05),中、高劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組增強(qiáng)顯著(P<0.01)。 真武湯低、中、高劑量組及陽(yáng)性藥對(duì)照組Bax、Caspase3、Caspase8、Caspase9 蛋白表達(dá)降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01 或P<0.05)。 其中中藥中劑量組Bcl-2、Bax、Caspase3、Caspase8、Caspase9 蛋白表達(dá)與假手術(shù)無(wú)明顯差異,提示真武湯可有效抑制心衰大鼠過(guò)度凋亡,中劑量真武湯抗凋亡效果最佳。

表2 免疫組化分析結(jié)果(IOD/area)Table 2 Results of immunohistochemical analysis (IOD/area)

2.6 對(duì)大鼠BNP 水平和PI3K、AKT1、p-AKT1 表達(dá)的影響

相比于假手術(shù)組,模型組BNP 水平顯著升高(P<0.01),其余各組較模型組不同程度下降(P<0.01),中藥中劑量下降最為顯著(P<0.01)。 結(jié)果提示心衰大鼠模型造模成功,真武湯及氯沙坦均能有效降低大鼠BNP 水平,以中劑量效果最為顯著(圖5A)。

與假手術(shù)組相比,模型組PI3K、p-AKT1、AKT1表達(dá)均升高,與模型組比較,真武湯低、中、高劑量組PI3K、AKT1、p-AKT1 表達(dá)均下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05 或P<0.01),且真武湯各劑量組PI3K、p-AKT1、AKT1 表達(dá)水平與假手術(shù)組無(wú)明顯差異(P>0.05)(圖5B~5E)。

注:與假手術(shù)組相比, ##P<0.05, ####P<0.01;與模型組相比,??P<0.05,????P<0.01;與陽(yáng)性對(duì)照組相比,&&P<0.05,&&&&P<0.01。圖5 各組大鼠BNP 水平和Western blot 結(jié)果Note.Compared with the sham operation group, ##P<0.05, ####P<0.01.Compared with the model group, ??P<0.05,????P<0.01.Compared with the positive control group,&&P<0.05,&&&&P< 0.01.Figure 5 BNP level and Western blot results of rats in each group

3 討論

從中醫(yī)學(xué)角度討論,心衰多見(jiàn)本虛重而標(biāo)實(shí)亦重、虛實(shí)夾雜,互相裹挾之癥,以心氣心陽(yáng)虛憊為本,水飲、瘀血、痰濁乃標(biāo)實(shí)之候[5]。 心氣心陽(yáng)虛衰,推動(dòng)和溫煦的功能疲憊,進(jìn)而導(dǎo)致血瘀的病理狀態(tài),瘀血阻滯,血不利則為水,隨著病情遷延,虛實(shí)互為因果,水飲、痰濁、瘀血為盛,陰勝則陽(yáng)病,繼而加重心陽(yáng)之虛衰,心臟之虛累及五臟,致使心、腎、脾陽(yáng)衰憊,無(wú)力行水化氣,而致水飲內(nèi)停,飲停于內(nèi),或射肺,或凌心,或溢于肌膚,臨床所見(jiàn)則為喘、為悸、為腫[5-7]。 故而心衰病證的病機(jī)關(guān)鍵是陽(yáng)虛水泛,溫陽(yáng)益氣,化痰利水為治療此病的主要法則[8-9]。

真武湯為溫陽(yáng)利水代表方,臨床研究已證實(shí),真武湯治療HF 通過(guò)改善心臟射血分?jǐn)?shù)(LVEF)、每搏輸出量(SV)、心搏量指數(shù)(SVI)、心臟指數(shù)(CI)等從而減輕臨床癥狀[10-11]。

本研究選用結(jié)扎大鼠冠狀動(dòng)脈左前降支法構(gòu)建HF 模型, 此方法與臨床上由冠狀動(dòng)脈阻塞所引起的心肌梗死的病理特征相符,是較理想的構(gòu)建HF動(dòng)物模型的方法,也是目前研究HF 常用的動(dòng)物模型之一[12-13]。 在模型組中,大鼠出現(xiàn)明顯的左室肥厚,LVEF<50%,HF 標(biāo)志物BNP 水平明顯上升(P<0.01),判斷心衰模型建立成功[1,14]。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,真武湯能明顯改善HF 大鼠LVEF、LVFS、LVMI,增強(qiáng)HF 大鼠心肌收縮力,緩解HF 大鼠左室肥厚程度。 病理結(jié)果顯示心衰大鼠心肌細(xì)胞明顯腫脹、肥大及炎性細(xì)胞浸潤(rùn),改善HF 大鼠心肌纖維化,并能有效降低心衰大鼠血清BNP 水平,抑制心衰大鼠心肌細(xì)胞過(guò)度凋亡。 在真武湯各劑量組比較中,真武湯中劑量組各方面表現(xiàn)均優(yōu)于低、高劑量組。 另外,有研究指出真武湯方中君藥附子的毒效網(wǎng)絡(luò)具有極高的相似性,其強(qiáng)心作用也是其心臟毒性的原因[15]。 以上提示真武湯干預(yù)HF可能在某一劑量區(qū)域內(nèi)存在正向的量效關(guān)系,且與方中附子的劑量有關(guān)。

心肌細(xì)胞凋亡是心肌細(xì)胞丟失的主要原因,在心室重塑和隨后的HF 過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。 細(xì)胞的凋亡主要包括死亡受體介導(dǎo)和線(xiàn)粒體介導(dǎo)兩種途徑,死亡受體介導(dǎo)途徑通過(guò)形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物(DISC)激活Caspase8,進(jìn)而發(fā)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)活化Caspase3 等導(dǎo)致凋亡事件。 線(xiàn)粒體介導(dǎo)途徑通過(guò)影響線(xiàn)粒體膜通透性,促使線(xiàn)粒體內(nèi)凋亡啟動(dòng)因子釋放至胞質(zhì)形成凋亡復(fù)合體(apoptosome),激活Caspase9,進(jìn)而通過(guò)級(jí)聯(lián)反應(yīng)激活Caspase3 等發(fā)生凋亡。 Caspase8 和Caspase9 的激活是這兩種途徑最關(guān)鍵的過(guò)程[16]。 Bcl-2 家族的抗凋亡和促凋亡成員與線(xiàn)粒體凋亡通路密切相關(guān)。 Bcl-2 和Bax 是一組典型的抗凋亡蛋白和促凋亡分子,它們作用于線(xiàn)粒體外膜,導(dǎo)致凋亡啟動(dòng)因子的釋放[17]。 PI3K/AKT 信號(hào)通路是參與細(xì)胞增殖調(diào)控的重要通路,過(guò)往研究認(rèn)為短期激活PI3K/AKT 可抑制細(xì)胞凋亡因子,增強(qiáng)血管生成,調(diào)節(jié)Ca2+內(nèi)流,促進(jìn)心肌細(xì)胞能量的代謝以及抑制炎癥反應(yīng)的進(jìn)行等過(guò)程促進(jìn)生理性肥厚,保護(hù)心肌免受損傷,而長(zhǎng)期激活則可引起病理性肥厚和心力衰竭[18]。

本研究發(fā)現(xiàn)HF 大鼠PI3K、p-AKT1、AKT1 表達(dá)顯著 升 高, 同 時(shí) 伴 有Bax、 Caspase3、 Caspase8、Caspase9 表達(dá)上升,Bcl-2 表達(dá)降低,而真武湯可顯著降低Bax、Caspase3、Caspase8、Caspase9 表達(dá),提高Bcl-2 表達(dá)水平,PI3K、p-AKT1、AKT1 表達(dá)水平下降。 提示真武湯可能通過(guò)調(diào)控PI3K-AKT 通路,抑制凋亡相關(guān)蛋白表達(dá),進(jìn)而改善心室重構(gòu),增強(qiáng)心肌收縮力,延緩心衰進(jìn)程。