吳文棋莊旭輝王姝晨李靜靜王 霞王 勇馬武華?

(1.廣州中醫(yī)藥大學,廣州 510006;2.中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院麻醉科,廣州 510000;3.廣州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院麻醉科,廣州 510006;4.晉城市人民醫(yī)院麻醉科, 山西 晉城 048000)

支氣管哮喘(bronchial asthma)是在兒童及成人中最常見的慢性非傳染性疾病之一, 據統(tǒng)計全球共有3.34 億哮喘患者[1]。 流行病學顯示我國成人及兒童哮喘發(fā)病率均呈逐年上升趨勢, 給醫(yī)療系統(tǒng)及社會都造成了巨大負擔[2]。 氣道重塑(airway remodeling)是慢性哮喘的重要病理特征, 是導致哮喘患者持續(xù)氣道阻塞, 糖皮質激素等治療不敏感的重要因素[3-4]。 已有大量研究證實, 在支氣管哮喘患者中, 上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)在氣道重塑的發(fā)展進程中起關鍵作用[5-6]。 因此, 尋找有效的干預目標及靶標分子來抑制支氣管上皮細胞EMT 進程, 以改善氣道重塑并提高糖皮質激素類藥物的敏感性, 對改善支氣管哮喘患者疾病轉歸及生活質量至關重要。

絲裂原活化蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinase, MAPK) 信號通路包含3 種不同的級聯通路, 這些級聯根據其MAPK 關鍵蛋白命名, 包括細胞外信號相關激酶 (extracellular signalrelated kinases, ERK)、Jun 氨基末端激酶 (Jun Nterminal kinase, JNK)、和p38-MAPK。 據 報 道, ERK/MAPK 通路與細胞增殖、分化、遷移、衰老和凋亡有關[7]。 有研究報道ERK/MAPK 作為關鍵信號轉導通路參與各類纖維化疾病中的EMT 進程[8-9]。 本研究旨在驗證ERK/MAPK 信號轉導在哮喘氣道重塑模型/支氣管上皮細胞EMT 進程中的激活情況, 并探討ERK/MAPK 抑制劑PD98059對該進程的影響, 為通路抑制劑的臨床應用積累基礎的實驗依據。

1 材料和方法

1.1 細胞

人支氣管上皮細胞BEAS-2B(購于美國生物標準品資源中心)。

1.2 主要試劑與儀器

DMEM 高糖培養(yǎng)基、胎牛血清購于Gibco 公司;重組 TGF-β1 購 于 peprotec 公 司; CCK-8 試 劑MedChemExpress 公 司、 PD98059 購 于MedChemExpress 公司;Edu 細胞增殖試劑盒、Cy3 抗兔IgG 購于上海碧云天生物技術有限公司;transwell遷移板購于Corning 公司;vimentin 一抗、α-SMA 一抗、GAPDH 一抗購于CST 公司;p-ERK1/2 一抗、ERK1/2 一抗購于上海艾比瑪特生物醫(yī)藥有限公司。

Multiskan GO 酶標儀購于賽默飛公司;BGgdsAUTO710PRO 化學發(fā)光成像系統(tǒng)購于北京百晶生物技術有限公司;IX73 倒置熒光顯微鏡顯微鏡購于日本奧林巴斯株式公社。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)、分組及處理

將BEAS-2B 細胞培養(yǎng)于10%FBS 和1%青/鏈霉素配置的DMEM 高糖培養(yǎng)基中, 培養(yǎng)條件37℃、5% CO2;重組TGF-β1 使用10 mmol/L citric acid 溶解配置為50 μg/mL 溶液, 后用細胞培養(yǎng)液配置為5 ng/mL 溶液。 PD98059 使用DMSO 溶解為40 mmol/L 溶液儲存于-20℃冰箱, 并用細胞培養(yǎng)液配置為2.5、5、10、20、40 μmol/L 溶液。 實驗分組:正常組(Con 組), 模型組(TGF-β1 5 ng/mL), 干預組(TGF-β1 5 ng/mL +PD98059 2.5~40 μmol/L)。

1.3.2 細胞免疫熒光觀察細胞α-SMA 蛋白表達定位情況

將BEAS-2B 細胞以3000 個/孔接種于96 孔板, 設置正常組, 模型組(TGF-β1 5 ng/mL), 培養(yǎng)24 h 后, 對細胞進行不同的處理干預72 h。 棄去培養(yǎng)液, 4%多聚甲醛固定10 min, 使用封閉液室溫孵育1 h, 加入兔抗多克隆抗體(1 ∶200)過夜, Cy3 抗兔IgG 孵育1 h, DPAI 孵育10 min 后在倒置熒光顯微鏡顯微鏡下采集分析圖像。

1.3.3 CCK-8 檢測細胞活力

將BEAS-2B 細胞以3000 個/孔接種于96 孔板, 設置空白組、正常組(Con 組)、模型組(TGF-β1 5 ng/mL), 干預組(TGF-β1 5 ng/mL+PD98059 2.5~40 μmol/L, 共5 個濃度梯度)。 培養(yǎng)24 h, 待細胞貼壁后更換為含5 ng/mL TGF-β1 及2.5、5、10、20、40 μmol/L PD98059 的細胞培養(yǎng)液, 設置3 個復孔, 在培養(yǎng)箱孵育72 h。 處理結束后, 每組每孔加入CCK-8 10 μL, 在培養(yǎng)箱孵育2 h 后在酶標儀下測450 nm 下吸光度值, 細胞存活率(%)= ((A 實驗孔-A 空白孔)/(A 對照孔-A 空白孔))×100%。

1.3.4 Edu 檢測細胞增殖活性

將BEAS-2B 細胞以3000 個細胞/孔接種于96 孔板, 設置正常組, 模型組(TGF-β1 5 ng/mL), 干預組(TGF-β1 5 ng/mL+PD98059 10 μmol/L), 培養(yǎng)24 h后, 參考課題組以往研究及前人研究對細胞進行不同的處理干預72 h[10-11]。 干預結束后每組每孔加入50 μmol/L Edu 試劑, 根據預實驗結果,在培養(yǎng)箱孵育4 h。 嚴格按照Edu 細胞增殖試劑盒說明書操作, 其結果由Edu 陽性細胞(綠色)與hochest 33442 陽性細胞(藍色)的比率表示細胞增殖率。

1.3.5 Transwell 實驗檢測細胞遷移能力

細胞分組及處理同1.3.4, 將BEAS-2B 細胞以5×104個/孔接種于6 孔板, 對細胞進行不同的處理干預72 h。 將處理完畢的細胞用胰酶消化后, 用無血清培養(yǎng)基配成每毫升7000 個細胞的細胞懸液, 加入300 μL 細胞懸液到Transwell 小室, 下室加入含有10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)液700 μL, 培養(yǎng)箱孵育12 h 后, 將小室風干, 結晶紫染色15 min, 在顯微鏡觀察并隨機計數3 個視野的細胞。

1.3.6 Western blot 檢測EMT 標志蛋白及ERK/MAPK 蛋白表達情況

細胞分組及干預同1.3.5, 每孔加入RIPA 裂解液, 細胞刮刀刮取細胞, 4℃ 15000 r/min 離心。取上清液, 采用BCA 法測定蛋白濃度。 加入5× Lodding Buffer 后煮沸使蛋白變性。 配置SDS-PAGE凝膠。 經電泳、轉膜、室溫下使脫脂奶粉封閉1 h后, 4℃孵育一抗過夜, 室溫孵育二抗1 h, 化學發(fā)光儀發(fā)光成像, Image J 分析條帶灰度值。

1.4 統(tǒng)計學方法

所有實驗數據采用SPSS 21.0 軟件進行統(tǒng)計分析。 數據使用平均數±標準差(±s)進行展示。各組正態(tài)性檢驗采用Shapiro-Wilk 檢驗。 如實驗數據符合正態(tài)性分布,檢驗多組數據組間差異采用單因素方差分析(One way ANOVA)。 當方差齊,多組間兩兩組間比較采用LSD 檢驗, 方差不齊時采用dunnett’sT3 檢驗。P<0.05 認為有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 α-SMA 蛋白在支氣管上皮細胞及氣道重塑/上皮間質化細胞模型表達、定位

結果如圖1 所示, 與正常組相比, TGF-β1(5 ng/mL)可使細胞α-SMA 表達增多, 表現為細胞胞質紅色熒光更亮更密。 結果提示TGF-β1 成功誘導BEAS-2B 細胞上皮間質轉化模型。

2.2 PD98059 及TGF-β1 對支氣管上皮細胞存活率的影響

結果如圖2 所示, 與正常組相比, 模型組的細胞存活率沒有影響(P>0.05)。 與模型組相比, PD98059 與在2.5、5、10、20 μmol/L 濃度與TGF-β1共孵育處理對細胞存活率沒有影響(P>0.05)。 而PD98059 濃度增加到40 μmol/L 時, 可對BEAS-2B活性產生明顯抑制作用(P<0.05)。

注:與正常組相比, ?P<0.05。圖2 PD98059 及TGF-β1 對支氣管上皮細胞細胞存活率的影響Note.Compared with Con group, ?P<0.05.Figure 2 Effect of PD98059 and TGF-β1 on the survival rate of bronchial epithelial cells

2.3 PD98059 及TGF-β1 對支氣管上皮細胞增殖能力的影響

為排除增殖對細胞遷移的結果造成的影響, 使用Edu 增殖試劑盒檢測細各組細胞增殖情況。 結果如圖3 所示:正常組Edu 陽性率為(44.42±2.42), 模型組Edu 陽性率為(42.01±6.93), 干預組Edu 陽性率為(41.43±4.29)。 3 組間Edu 陽性率無顯著差異(P>0.05)。 結 果 提 示TGF-β1 及PD98059 對BEAS-2B 細胞增殖無影響(表1)。

表1 各組細胞增殖能力比較(±s)Table 1 Comparison of proliferation ability among groups

表1 各組細胞增殖能力比較(±s)Table 1 Comparison of proliferation ability among groups

組別Groups陽性細胞率(%)Edu positive cell rate F P正常組Con group 44.42±2.42模型組TGF-β1 group 42.01±6.93干預組TGF-β1+PD98059 group 41.43±4.29 0.314 0.742

圖3 PD98059 及TGF-β1 對支氣管上皮細胞增殖能力的影響Figure 3 Effect of PD98059 and TGF-β1 on the proliferation of bronchial epithelial cells

2.4 PD98059 及TGF-β1 對支氣管上皮細胞增殖能力的影響

結果如圖4 所示:與正常組相比, 模型組細胞遷移數明顯增加(P<0.05), 與模型組相比, PD98059干預后BEAS-2B 細胞遷移數明顯減少(P<0.05)。結果表明PD98059 能抑制TGF-β1 誘導的細胞遷移(表2)。

表2 各組細胞遷移能力比較 (±s)Table 2 Comparison of migration ability among groups

表2 各組細胞遷移能力比較 (±s)Table 2 Comparison of migration ability among groups

注:與正常組相比, ?P<0.05;與模型組相比, #P<0.05。Note.Compared with Con group, ?P<0.05.Compare with TGF-β1 group, #P<0.05.

組別Groups遷移率(%)Migration rate F P正常組Con group 100.00±0.00模型組TGF-β1 group 231.47±19.65?干預組TGF-β1+PD98059 group 157.76±6.46#91.321 <0.001

圖4 PD98059 及TGF-β1 對支氣管上皮細胞遷移能力的影響Figure 4 Effect of PD98059 and TGF-β1 on the migration of bronchial epithelial cells

2.5 PD98059 及TGF-β1 對支氣管上皮細胞EMT標志蛋白和ERK/MAPK 通路蛋白表達的影響

結果如圖5 所示:與正常組相比, 模型組細胞vimentin、α-SMA 和p-ERK 表達升高(P<0.05), 與模型組相比, PD98059 干預后BEAS-2B 細胞vimentin、α-SMA 和p-ERK 表達下降(P<0.05)。 結果表明PD98059 能抑制TGF-β1 誘導的細胞EMT 和ERK/MAPK 通路激活(表3)。

圖5 PD98059 及TGF-β1 對支氣管上皮細胞EMT 標志蛋白和ERK/MAPK 通路蛋白表達的影響Figure 5 Effect of PD98059 and TGF-β1 on the expression of EMT protein and ERK/MAPK pathway protein in bronchial epithelial cells

表3 各組細胞蛋白表達水平比較(±s)Table 3 Comparison of protein expression level among groups

表3 各組細胞蛋白表達水平比較(±s)Table 3 Comparison of protein expression level among groups

注:與正常組相比, ?P<0.05;與模型組相比, #P<0.05。Note.Compared with Con group, ?P<0.05.Compare with TGF-β1 group, #P<0.05.

組別Groups Vimentin α-SMA p-ERK正常組Con group 0.47±0.01 0.43±0.15 0.16±0.09模型組TGF-β1 group 1.09±0.08? 1.36±0.05? 0.64±0.10?干預組TGF-β1+PD98059 group 0.85±0.01# 0.77±0.07# 0.35±0.11#F 114.680 62.232 16.411 P 0.000 0.000 0.004

3 討論

本研究以TGF-β1 誘導人支氣管上皮細胞EMT模型, 檢測TGF-β1 干預及TGF-β1 及PD98059 聯合干預BEAS-2B 細胞的細胞活力、增殖能力、遷移能力及EMT 進程標志蛋白表達情況。

本研究參考Doerner 等[10]報道建立TGF-β1 誘導支氣管上皮細胞BEAS-2B 上皮間質轉化模型, 模擬臨床患者哮喘氣道重塑的情況。 觀察到BEAS-2B 細胞α-SMA 蛋白、vimentin 蛋白表達增多, 細胞遷移能力增加而且不影響細胞增殖, 提示細胞造模成功。 在TGF-β1 造模后,加入ERK/MAPK 通路抑制劑PD98059 作為干預組,在文獻報道中,PD98059在BEAS-2B 上的干預劑量從10 ~ 30 μmol/L 不等[12-14],且Tian 等[13]報道PD98059 在30 μmol/L時已經對細胞活力產生抑制作用。 因此,本研究設置濃度梯度檢測PD98059 對 BEAS-2B 細胞活性的影響。 結果發(fā)現PD98059 濃度增加到40 μmol/L時, 可對BEAS-2B 活性產生明顯抑制作用。 為控制PD98059 對細胞活性抑制而可能帶來的影響, PD98059 采用10 μmol/L 濃度用作后續(xù)實驗。

上皮間質轉化是一種生物學過程, 上皮細胞通過轉變?yōu)殚g質細胞, 失去細胞間的緊密連接, 獲得的遷移能力和分泌細胞外基質的能力, 伴隨著E-cadherin 的減少以及間質細胞來源蛋白:vimentin和α-SMA 等的增加[15]。 其中α-SMA 負責構成間質細胞纖維的主要成分, 參與細胞骨架的重塑[16]。近年來, 隨著對上皮間質轉化研究的不斷深入, 由TGF-β1 誘導的上皮間質轉化在哮喘患者氣道重塑中的作用愈發(fā)受到關注[17-18]。 TGF-β1 作為在炎癥和細胞外基質調節(jié)因素中的核心因子, 已被證實與哮喘炎癥與重塑起關鍵作用[19]。

氣道重塑作為慢性哮喘的重要病理特征, 其典型變化包括上皮損傷、粘液腺增生、上皮下基底膜沉積、血管生成和氣道平滑肌增加[20]。 氣道重塑是長期過敏源暴露及氣管炎性損傷的結果[21], 是導致哮喘患者激素治療不敏感的重要因素。 因此探索氣道重塑發(fā)生發(fā)展的分子機制及潛在的治療靶點是支氣管哮喘研究領域亟需解決的重難點。

在本研究中, 我們發(fā)現TGF-β1 誘導BEAS-2B中p-ERK1/2 表達明顯上升, 通過使用PD98059 抑制EKR/MAPK 可以抑制細胞遷移、α-SMA 蛋白、vimentin 蛋白的表達, 進而抑制EMT 進程。 ERK/MAPK 通路是所有 MAPK 信號轉導通路中最重要的信號級聯通路, 其中分為ERK1~5 五個亞族, 而ERK1/2 途徑是目前研究最火熱的MAPK 途徑[22]。ERK1/2 亞族能被生長因子或者激素刺激并激活Raf/MEK/ERK 級聯通路, 最終激活下游MAPK 信號并且發(fā)生磷酸化入核, 導致相應的基因轉錄[23]。最近的研究發(fā)現抑制ERK/MAPK 通路可以在癌癥、纖維化等疾病中發(fā)揮治療作用。 此外, 考慮到ERK/MAPK 通路參與細胞增殖生長過程[24], 因此本研究篩選出對細胞活力與增殖能力無影響的藥物濃度參與Transwell 實驗, 證明了PD98059 抑制TGF-β1 誘導的遷移細胞數增多與抑制細胞增殖無關, PD98059 通過抑制BEAS-2B 遷移能力導致遷移細胞數的減少。 本研究結果提示ERK 通路在支氣管上皮細胞EMT 中發(fā)揮重要作用, 通過抑制ERK/MAPK 通路介導的EMT 可能成為治療支氣管哮喘患者的一個潛在的靶點。 與之類似的是, 張愛芝等[25]研究發(fā)現激活大鼠平滑肌細胞可以有效促進cyclinD1 和氣道重塑。 Zha 等[26]報道PD98059可以通過抑制腎小管上皮細胞的EMT 進程, 減輕腎纖維化。 以上研究與本研究結果一致, 說明了PD98059 通過抑制EMT 進程在治療哮喘氣道重塑中的潛在價值。

本研究的不足之處在于我們的實驗僅在ERK/MAPK 通路上對TGF-β1 誘導的支氣管上皮細胞EMT 進行研究與分析, 但事實上, MAPK 通路中P38 通路及JNK 通路也參與了該過程[5]。 我們計劃在未來拓展研究, 試圖更加充分的認識氣道重塑中EMT 的發(fā)展進程。

綜上所述, 本研究發(fā)現TGF-β1 可能通過ERK/MAPK 通路促進人支氣管上皮細胞上皮間質轉化進程, PD98059 可以通過抑制ERK/MAPK 通路的激活抑制支氣管上皮細胞EMT 進程。