修銀玲孫凱旋于月新

(中國人民解放軍北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 生殖醫(yī)學(xué)科,沈陽 110000)

卵巢早衰(premature ovarian failure, POF)是指女性在40 歲前由于卵巢內(nèi)卵泡提前衰竭或卵泡發(fā)育停滯,導(dǎo)致的卵巢功能喪失[1]。 POF 的特點是雌激素水平低下,促性腺激素(Gn)水平升高,與絕經(jīng)后婦女相同[2]。 近幾年,卵巢早衰的發(fā)病率有上升趨勢,研究認為POF 與染色體缺陷、毒素暴露和自身免疫性疾病有關(guān),但多數(shù)患者病因尚不明確。 經(jīng)典的化療藥物如環(huán)磷酰胺(CTX)和白消安(BU)具有嚴重的生殖毒性,常用于構(gòu)建POF 動物模型[3]。

白藜蘆醇(resveratrol,RES)是一種多酚類天然植物抗毒素,廣泛存在于葡萄、果桑和其他植物中,它具有多種藥理作用,如抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗氧化、細胞保護、抗凋亡等[4]。 文獻報道,RES 可以通過降低LH、LH/FSH 比值和TNF-α 水平來改善卵泡發(fā)育[5]。 本研究觀察RES 對卵巢早衰小鼠的干預(yù)作用,并通過檢測Wnt/β-catenin 信號通路和抗氧化等指標,探討其可能機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF 級8 周齡雌性C57BL/6 小鼠40 只,體重(20±0.5)g,由遼寧長生生物技術(shù)有限公司提供 [SCXK(遼)2017-0001],小鼠飼養(yǎng)于北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院動物實驗科[SYXK(遼)2018-0021],本研究經(jīng)北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院動物倫理委員會批準(202005068),所有動物實驗符合3R 指導(dǎo)原則。

1.2 主要試劑與儀器

白藜蘆醇(美國Sigma 公司,貨號L1645);環(huán)磷酰胺(Cyclophosphamide,CTX,美國Sigma 公司,貨號C0768)和白消安(Busulfan,BUS,美國Sigma 公司,貨號B2635);兔抗鼠β-catenin 抗體(美國Sigma公司,批號SAB4501254);兔抗鼠Mvh 抗體(美國Sigma 公司,批號SAB540697);兔抗鼠Oct4 抗體(美國Sigma 公司,批號ZRB100);兔抗鼠SOD2 抗體(美國Sigma 公司,批號T4929);兔抗鼠Nrf2 抗體(美國Sigma 公司,批號SAB4501926);兔抗鼠Bax抗體(美國Sigma 公司,批號A5367);兔抗鼠Bcl-2抗體(美國Sigma 公司,批號A8924);熒光定量 PCR試劑盒(TaKaRa 公司,批號SR1110-200T);PCR 引物(Invtrogen 公司);免疫組化試劑盒(武漢博士德生物技術(shù)有限公司,批號14E25L13D124)。 蛋白電泳儀(美國Bio-Rad 公司); 顯微鏡購自日本OLYMPUS 公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組

C57BL/6 小鼠經(jīng)腹腔注射CTX(120 mg/kg)和BU(30 mg/kg)制成POF 模型,觀察4 周。 將RES 溶解于生理鹽水中,造模同時灌胃給藥28 d。 將小鼠分為4 組:對照組(Control)、模型組(Model group)、20 mg/kg RES 組(20 mg/kg RES group)和40 mg/kg RES 組(40 mg/kg RES group),每組10 只。 在治療最后1 d 測量并記錄小鼠和卵巢的重量。

1.3.2 蘇木精-伊紅(HE)染色觀察卵巢組織與卵泡計數(shù)

取小鼠卵巢組織,4%多聚甲醛固定過夜,石蠟包埋。 HE 染色后觀察卵巢形態(tài)特征,計算閉鎖率(閉鎖卵泡占卵泡總數(shù)的比例)和原始卵泡率(原始卵泡占卵泡總數(shù)的比例)。

1.3.3 RT-qPCR 檢測CyclinD1、Wnt1 和β-catenin mRNA 表達

采用TRIzol 試劑提取卵巢總RNA,按照PrimeScript RT-kit 方法,通過逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA,并按照TB-Green-Mix-kit 說明書進行RT-qPCR。 表1列出了RT-qPCR 引物序列,內(nèi)參采用GAPDH。

表1 引物序列(5’-3’)Table 1 Primer sequence

1.3.4 免疫組化染色觀察卵巢組織β-catenin 蛋白表達

卵巢組織石蠟切片經(jīng)脫蠟、水化,3%過氧化氫中孵育10 min,阻斷非特異性反應(yīng),切片加β-catenin一抗孵育4 h,然后加辣根過氧化物酶標記羊抗鼠二抗處理15 min,DAB 顯色試劑盒顯色,蘇木素輕度復(fù)染,脫水,透明,中性樹膠封片,以PBS 溶液作為一抗的陰性對照。

1.3.5 Western blot 法檢測Mvh、Oct4、β-caterin、SOD2、Nrf2、Bax 和Bcl-2 蛋白表達

取各組小鼠卵巢組織50 μg,RIPA 裂解液提取總蛋白,BCA 蛋白定量試劑盒檢測總蛋白濃度,采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGF)電泳后轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上,5%脫脂奶粉封閉1 h 后,加入一抗,4℃孵育過夜,將膜清洗3 次,然后二抗室溫孵育2 h,用凝膠圖像分析成像系統(tǒng)進行掃描分析,結(jié)果以目的蛋白相對表達量表示,目的蛋白相對表達量=目的蛋白IOD 值/內(nèi)參β-actin IOD 值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0 進行數(shù)據(jù)分析,數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準差(±s)表示,兩組間的統(tǒng)計學(xué)差異采用t檢驗,多組數(shù)據(jù)采用單因素方差分析,P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠體重、卵巢重量和卵巢/小鼠相對重量比

與模型組相比,20 mg/kg RES 組和40 mg/kg RES 組小鼠卵巢體積明顯變大;20 mg/kg RES 組和40 mg/kg RES 組小鼠體重、卵巢重量和卵巢/小鼠重量比均高于模型組,見圖1、表2。

表2 小鼠重量、卵巢重量和卵巢/小鼠重量比(±s,n=10)Table 2 Mice weight, ovary weight and ovary/mice weight ratio

表2 小鼠重量、卵巢重量和卵巢/小鼠重量比(±s,n=10)Table 2 Mice weight, ovary weight and ovary/mice weight ratio

注:與對照組相比,??P<0.01;與模型組相比, ##P<0.01。Note.Compared with the control group, ??P<0.01.Compared with the model group, ##P<0.01.

組別Groups小鼠重量(g)Mice weight卵巢重量(g)Ovarian weight卵巢/小鼠重量比Ovary/mice weight ratio對照組Control group 39.42±1.14 0.0310±0.0027 0.000786±0.000049模型組Model group 25.60±0.66?? 0.0067±0.0014?? 0.000265±0.000054??20 mg/kg RES 組 20 mg/kg RES group 30.24±1.57## 0.0157±0.0025## 0.000519±0.000077##40 mg/kg RES 組 40 mg/kg RES group 33.50±0.87## 0.0204±0.0028## 0.000608±0.000085##

圖1 各組小鼠卵巢形態(tài)比較Figure 1 Comparison of ovarian morphology between groups of mice

2.2 HE 染色觀察小鼠卵巢組織的病理變化

與對照組相比,模型組小鼠原始卵泡數(shù)量下降(P<0.01),而與模型組相比,20 mg/kg RES 組和40 mg/kg RES 組小鼠原始卵泡數(shù)量增加(P<0.05)。

與對照組相比,模型組小鼠閉鎖卵泡數(shù)量增加(P<0.01),而與模型組相比,20 mg/kg RES 組和40 mg/kg RES 組小鼠閉鎖卵泡數(shù)量下降(P<0.05),見圖2、圖3。

2.3 小鼠卵巢中CyclinD1、Wnt1 和β-catenin mRNA 表達

與對照組比,模型組小鼠卵巢組織中CyclinD1、Wnt1 和β-catenin mRNA 表達下降(P<0.01),而與模型組比,20 mg/kg RES 組和40 mg/kg RES 組小鼠卵巢組織中CyclinD1、Wnt1 和β-catenin mRNA 表達增加(P<0.05),見圖4。

注:與對照組相比,???P<0.01;與模型組相比, ##P<0.05, ###P<0.01。圖3 小鼠卵巢中原始卵泡和閉鎖卵泡比例(±s,n=10)Note.Compared with the control group,???P<0.001.Compared with the model group, ##P<0.05, ###P<0.001.Figure 3 Ratio of the primordial and atresia follicles in the ovaries

注:與對照組比,??P<0.01;與模型組比, #P<0.05,##P<0.01。圖4 小鼠卵巢組織中CyclinD1、Wnt1 和β-catenin mRNA相對表達量(±s,n=10)Note.Compared with the control group, ??P<0.01.Compared with the model group, #P<0.05, ##P<0.01.Figure 4 Relative expression level of CyclinD1, Wnt1 and β-catenin mRNA in mouse ovarian tissue

注:箭頭所指示均為成熟卵泡。圖2 白黎蘆醇對小鼠卵巢組織的影響(HE)Note.Arrows indicate mature follicles.Figure 2 Effect of resveratrol on ovarian tissue of mice

2.4 卵巢組織中β-caterin 蛋白表達情況

與對照組比,模型組小鼠卵巢組織中β-caterin陽性蛋白表達下降,而與模型組比,20 mg/kg RES組和40 mg/kg RES 組小鼠卵巢組織中β-caterin 陽性蛋白表達升高,見圖5。

圖5 小鼠卵巢組織中β-catenin 蛋白表達(免疫組化)Figure 5 Protein expression of β-catenin in mice ovarian tissue (immunohistochemistry)

2.5 卵巢組織中Mvh 和Oct4 蛋白表達情況

與對照組相比,模型組小鼠卵巢組織中Mvh 和Oct4 蛋白表達下降(P<0.001),而與模型組相比,20 mg/kg RES 組和40 mg/kg RES 組小鼠卵巢組織中Mvh 和Oct4 蛋白表達升高(P<0.05),且呈濃度依賴性,見圖6。

2.6 卵巢組織中SOD2、Nrf2、Bax 和Bcl-2 蛋白表達情況

與對照組相比,模型組小鼠卵巢組織中SOD2、Nrf2 和Bcl-2 表達下降,Bax 表達升高(P<0.001);與模型組相比,20 mg/kg RES 組和40 mg/kg RES 組小鼠卵巢組織中SOD2、Nrf2 和Bcl-2表達升高,Bax 表達下降(P<0.001),且呈濃度依賴性,見圖7。

3 討論

40 歲前自然絕經(jīng)這一臨床現(xiàn)象稱之為卵巢功能早衰,是危害女性健康的重要因素之一,目前各種中西醫(yī)治療方法效果均不理想[6]。 因此,為恢復(fù)卵巢功能尋找替代治療藥物至關(guān)重要。 白黎蘆醇是一種存在于多種植物中的非黃酮類多酚化合物,它具有抗菌、抗癌、抗炎、抗氧化等多方面的藥理活性[7]。 在癌細胞中,RES 具有強大的抗炎作用和抗氧化作用,并發(fā)現(xiàn)可誘導(dǎo)細胞凋亡和細胞周期阻滯[8-9]。

本實驗中,模型組小鼠體重、卵巢重量低于對照組;HE 染色觀察發(fā)現(xiàn),與對照組比較,模型組小鼠卵巢體積和成熟卵泡數(shù)量減少,而閉鎖卵泡數(shù)量增加;Western blot 檢測發(fā)現(xiàn),POF 小鼠卵巢Mvh 和Oct4 蛋白表達低于對照組,這些結(jié)果說明POF 小鼠建模成功[10]。

注:與對照組相比, ?P<0.05,??P<0.01;與模型組相比, ##P<0.01。圖6 白黎蘆醇對卵巢組織中Mvh 和Oct4 蛋白表達的影響(±s,n=10)Note.Compared with the control group, ?P<0.05,??P<0.01.Compared with the model group, # #P<0.01.Figure 6 Effect of resveratrol on the expression of Mvh and Oct4 proteins in ovarian tissues

注:與對照組相比, ?P<0.05,??P<0.01;與模型組相比, #P<0.05, ##P<0.01。圖7 白黎蘆醇對卵巢組織中SOD2、Nrf2、Bax 和Bcl-2 蛋白表達的影響(±s,n=10)Note.Compared with the control group, ?P<0.05,??P<0.01.Compared with the model group, # P<0.05, # #P<0.01.Figure 7 Effect of resveratrol on the expression of SOD2, Nrf2, Bax and Bcl-2 proteins in ovarian tissues

白黎蘆醇能消除POF 的免疫損傷,恢復(fù)卵巢功能,但其具體機制尚不明確[11]。 Mvh 是生殖細胞標志基因,Oct4 是胚胎干細胞標志物,通常以Mvh 和Oct4 作為指標評價雌性生殖干細胞(FGSCs)在小鼠體內(nèi)的存活情況[12]。 HE 染色觀察發(fā)現(xiàn),20 mg/kg RES 組和40 mg/kg RES 組小鼠原始卵泡數(shù)量低于對照組,但高于模型組;Western blot 法檢測發(fā)現(xiàn),RES 組Mvh 和Oct4 蛋白表達高于模型組,提示RES可能通過維持FGSCs 的存活來保護卵巢功能,這與HE 染色觀察結(jié)果基本一致。

Wnt/β-catenin 通路是經(jīng)典的Wnt 通路,參與機體許多重要生理活動,包括胚胎早期發(fā)育、生殖系統(tǒng)發(fā)育等[13]。 β-catenin 蛋白是Wnt 通路激活的重要標志,已被證明能持續(xù)增強FSH 分泌,促進卵泡發(fā)育[14];CyclinD1 位于β-catenin 下游,是重要的細胞周期調(diào)控蛋白[15-16]。 免疫組化觀察發(fā)現(xiàn),模型組卵巢組織中β-caterin 蛋白表達低于對照組,說明在POF 小鼠卵巢組織中,β-caterin 表達下調(diào),會抑制卵泡發(fā)育,可能對卵巢功能有一定影響,而RES 組βcaterin 陽性蛋白表達升高,且呈濃度依賴性,提示RES 可能上調(diào)β-caterin 表達,增強FSH 分泌,促進卵泡發(fā)育;RT-qPCR 法檢測發(fā)現(xiàn),RES 組CyclinD1、Wnt1 和β-catenin mRNA 表達均高于模型組,且40 mg/kg RES 組β-catenin mRNA 表達高于20 mg/kg RES 組。 這些結(jié)果進一步說明RES 可能通過上調(diào)Wnt1 mRNA 表達,使細胞質(zhì)中的β-catenin mRNA表達增加,進入細胞核,從而激活Wnt/β-catenin 通路的下游靶基因CyclinD1 mRNA,促進卵泡發(fā)育,有助于卵巢功能恢復(fù),這與免疫組化觀察結(jié)果基本一致。

Nrf2、HO-1 和SOD 是體內(nèi)抗氧化應(yīng)激和維持氧化還原平衡的幾個重要因子。 超氧化物歧化酶(SOD)是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶,可分為SOD1、SOD2 等,具有清除自由基,保護機體免受氧自由基損[17-18]。 Nrf2 為調(diào)控機體抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的核轉(zhuǎn)錄因子,能夠顯著誘導(dǎo)機體的內(nèi)源性抗氧化應(yīng)答[19]。 Western blot 檢測發(fā)現(xiàn),模型組SOD2 和Nrf2蛋白表達低于對照組(P<0.05),提示POF 可抑制SOD2 和Nrf2 蛋白表達,導(dǎo)致ROS 積累,使卵巢功能受損。 而RES 組SOD2 和Nrf2 蛋白表達高于模型組(P<0.05),且呈濃度依賴性,提示當POF 誘發(fā)卵巢氧化應(yīng)激時,RES 可促進Nrf2 激活并進入細胞核,啟動下游抗氧化基因SOD2 表達,起到清除自由基作用,延緩卵巢衰老。

Bax 和Bcl-2 均是Bcl-2 家族的重要分子,Bcl-2為抗凋亡蛋白,而Bax 為促凋亡蛋白。 Western blot檢測發(fā)現(xiàn),與對照組比較,模型組小鼠卵巢組織中Bcl-2 表達下降,Bax 表達升高,說明POF 可促進卵巢細胞凋亡,損害卵巢功能;與模型組比較,RES 組Bcl-2 表達增加,Bax 表達減少,說明RES 可抑制卵巢細胞凋亡,提高細胞存活率。

綜上所述,白藜蘆醇對卵巢早衰小鼠具有保護作用,其機制可能與抑制卵巢細胞凋亡,以及激活Wnt/β-catenin 通路促進卵巢功能恢復(fù)有關(guān)。