楊欣悅李佳佳董 翔是文輝李建瑛魏雪梅劉江偉?

(1.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院,新疆 石河子 832000;2.新疆軍區(qū)總醫(yī)院肛腸診療中心,烏魯木齊 830000;3.新疆軍區(qū)總醫(yī)院新疆特殊環(huán)境醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,烏魯木齊 830000;4.新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院呼吸危重癥醫(yī)學(xué)中心,烏魯木齊 830000)

高原急性肺水腫是急性高原疾病的肺部表現(xiàn)[1]。 高原肺水腫起病急、進(jìn)展快、死亡率高,是一種潛在的威脅生命的疾病[2]。 當(dāng)快速上升到海拔2500 m 以上的人不適應(yīng)高原環(huán)境時(shí),就會(huì)發(fā)生高原肺水腫[3]。 臨床上明顯的高原肺水腫以嚴(yán)重發(fā)紺、呼吸困難和咳嗽為特征[4]。 目前對(duì)于急性高原肺水腫,我們?nèi)匀蝗狈M(mǎn)意的預(yù)防和治療手段。 高原寒冷環(huán)境具有氣壓低、缺氧、寒冷、紫外線輻射強(qiáng)、植被稀疏、人口稀少等一系列特點(diǎn)。 目前,世界高原面積約為四千八百萬(wàn)平方千米,約占世界總面積的10%,中國(guó)是世界上高原面積最大的國(guó)家,海拔最高,人口最多[5]。 暴露在高原寒冷環(huán)境中的人,如工人、士兵、旅行者和高原常駐人群,都有發(fā)生高原肺水腫的可能[6]。

因此,開(kāi)展急性高原肺水腫有效防治藥物的研究非常必要。 而這些研究的基礎(chǔ)就是建立重復(fù)性好、評(píng)價(jià)體系健全的急性高原肺水腫動(dòng)物模型。 目前高原肺水腫的發(fā)病機(jī)制還未十分明確[7],可能與海拔高度[8]、運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度[9]及機(jī)體的適應(yīng)與重塑有關(guān),但至今仍無(wú)一種制作高原肺水腫模型的標(biāo)準(zhǔn)方法。 更重要的是,高原低壓缺氧常伴隨寒冷環(huán)境,即使在夏天,高原地區(qū)白天溫度常常在15℃以下,但目前出現(xiàn)的高原肺水腫模型大部分在常溫環(huán)境中建立,未考慮寒冷環(huán)境對(duì)肺水腫形成的影響,目前尚未見(jiàn)高原寒冷環(huán)境的肺水腫模型的文獻(xiàn)報(bào)道,因此建立一個(gè)符合高原實(shí)際環(huán)境的肺水腫模型是一個(gè)亟待解決的問(wèn)題。 在本研究中,我們使用模擬氣候艙來(lái)建立高原寒冷環(huán)境大鼠肺水腫模型,并評(píng)估肺濕/干重比、肺泡灌洗液中的總蛋白質(zhì)含量、肺泡組織的病理學(xué)的變化。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)采用SPF 級(jí)雄性SD 大鼠80 只(6~8 周齡、體重220~260 g),購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK(新)2018-0002]。 實(shí)驗(yàn)大鼠飼養(yǎng)在新疆軍區(qū)總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科SPF 級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室中[SYXK(軍) 2017-0050],環(huán)境條件:12 h/12 h 光暗循環(huán),溫度(21 ± 1)℃、濕度(45±5)%,充足供應(yīng)水與飼料。 所有實(shí)驗(yàn)方案獲新疆軍區(qū)總醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(DWLL20190320),遵從3R原則。

1.2 主要試劑與儀器

西北特殊環(huán)境人工實(shí)驗(yàn)艙(新疆軍區(qū)總醫(yī)院研制);BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒(北京索萊寶科技有限公司);戊巴比妥鈉(Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co.Ltd.)。 電子秤(上海儀器廠);光學(xué)顯微鏡CKX41(日本Olympus);TS-12U 生物組織脫水機(jī)(中國(guó)亞鵬);LEICA RM213 型組織切片機(jī)(德國(guó));BI-2000 醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)(成都泰盟科技公司 ;YB-6D 型生物組織石蠟包埋機(jī)(湖北孝感亞光電子技術(shù)公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 高原寒冷環(huán)境肺水腫模型建立

將100 只健康標(biāo)準(zhǔn)大鼠隨機(jī)分為2 組(每組50只):高原常溫組(HN 組)和高原寒冷組(HC 組)。每組按不同時(shí)間點(diǎn)分為5 個(gè)亞組:0 h 組、24 h 組、48 h 組、72 h 組、120 h 組。 0 h 組置于常溫環(huán)境中[溫度(21±1)℃,相對(duì)濕度(45±5)%],其余組放置在西北特殊環(huán)境人工實(shí)驗(yàn)艙(新疆軍區(qū)總醫(yī)院研制)的高原環(huán)境中。 HN 組實(shí)驗(yàn)艙條件設(shè)置12 h/12 h的光暗循環(huán),溫度(21±1)℃、相對(duì)濕度(45±5) %。HC 組實(shí)驗(yàn)艙條件設(shè)置:12 h/12 h 光暗循環(huán),白天12 h 15℃,夜間12 h 5℃,濕度(45±5)%。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,打開(kāi)艙門(mén),將高原24、48、72、120 h組的動(dòng)物暴露在高原低壓低氧艙內(nèi)。 設(shè)置高原環(huán)境參數(shù),海拔設(shè)置為7000 m,高度以10 m/s 的速度上升,設(shè)備達(dá)到預(yù)定高度后,保持濕度(45±5)%,實(shí)驗(yàn)艙壓力47.3 KPa,氧含量約9.9%[10]。

1.3.2 樣本解剖與采集

當(dāng)?shù)竭_(dá)相應(yīng)時(shí)間后,高度降低至海平面,打開(kāi)艙門(mén),在艙內(nèi)快速麻醉動(dòng)物,每組大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)。 沿胸部正中逐層剪開(kāi)胸壁,充分暴露胸腔后,先結(jié)扎右側(cè)主支氣管,將導(dǎo)管插入左主支氣管,經(jīng)氣管插管向左肺緩慢注入0.9%生理鹽水4 mL,緩慢回抽;反復(fù)沖洗2~3 次。收集肺泡灌洗液3 mL,用于肺泡灌洗液蛋白質(zhì)濃度測(cè)定。 分離右肺,取右肺上葉測(cè)量濕/干重比值。右肺中葉用4%多聚甲醛固定,用于病理HE 染色。

1.3.3 肺泡灌洗液蛋白質(zhì)濃度測(cè)定

取肺泡灌洗液,以3000 r/min 離心15 min,收集上清液,使用BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒,采用Bicinchoninic acid 法(BCA 法)檢測(cè)肺泡灌洗液中總蛋白濃度。

1.3.4 肺組織濕/干重比測(cè)定

肺組織濕/干重比可評(píng)估肺含水量。 處死大鼠并徹底放血,取右肺上葉,用濾紙輕輕吸去肺組織表面的血污。 然后將其放在錫箔紙上,用電子天平測(cè)量濕重,精確度為0.1 mg。 然后將肺組織與錫箔紙一起放入電烤箱,80℃加熱72 h,達(dá)到恒定重量(重復(fù)2 次稱(chēng)量干重誤差<0.002 g 為恒定重量),隨后記錄其重量為干重。 按Elliot 公式計(jì)算含水量:組織含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100 %。

1.3.5 肺組織HE 染色

右肺中葉在4%多聚甲醛中固定1 周后,不同濃度乙醇梯度脫水,包埋,切片,用HE 染色試劑盒染色。 染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察肺部病理變化,肺損傷程度通過(guò)用肺損傷評(píng)分的方法評(píng)估。 光學(xué)顯微鏡下肺組織損傷程度基于以下指標(biāo):(1)肺泡和間質(zhì)有無(wú)水腫;(2)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)程度;(3)出血程度。 肺的損傷嚴(yán)重程度分為以下幾類(lèi):無(wú)損傷得分為0;25%的肺野損傷得分為1;50%的肺野損傷得分為2;75%的肺野損傷得分為3;全肺野改變得分為4[11]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:采用SPSS 23.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。 組間比較采用單因素方差分析。 組內(nèi)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P<0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺組織濕/干重比分析

如圖1 所示,48、72 和120 h 的HC 組肺濕/干重比均高于0 h 的HC 組(P<0.05), 72 和120 h 的HN 組肺濕/干重比均高于0 h 的HN 組(P<0.05);48、72 和120 h 的HC 組的肺濕/干重比均高于HN組(P<0.05)。 高原寒冷環(huán)境下暴露48 h 時(shí)HC 組肺濕/干重比達(dá)到最高值(5.4218 ± 0.3983),與72和120 h 的HC 組比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

注:與高原常溫組0 h 相比, ?P<0.05;與高原寒冷組0 h 相比, #P<0.05;與高原常溫組48 h 相比,&P<0.05;與高原常溫組72 h 相比,※P<0.05;與高原常溫組120 h 相比,∮P<0.05。圖1 各組大鼠肺組織W/D 比的比較(±s)Note.Compared with the HN group for 0 h, ?P<0.05.Compared with the HC group for 0 h, # P<0.05.Compared with the HN group for 48 h,&P < 0.05.Compared with the HN group for 72 h,※P<0.05.Compared with the HN group for 120 h,∮P<0.05.Figure 1 Change of the lung water content in lung tissues in the rats of different groups

2.2 肺泡灌洗液蛋白質(zhì)含量分析

如圖2 所示,48、72 和120 h 的HC 組灌洗液蛋白含量均高于0 h 的HC 組(P<0.05),72 和120 h的HN 組灌洗液蛋白含量均高于0 h 的HN 組(P<0.05);48、72 和120 h 的HC 組的灌洗液蛋白含量均高于HN 組(P<0.05)。 高原寒冷環(huán)境下暴露48 h 時(shí)HC 組灌洗液蛋白含量達(dá)到最高值(5.4218±0.3983),與72 和120 h 的HC 組比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

2.3 肺組織病理學(xué)改變

注:與高原常溫組0 h 相比, ?P<0.05;與高原寒冷組0 h 相比, #P<0.05;與高原常溫組48 h 相比,&P<0.05;與高原常溫組72 h相比,※P<0.05;與高原常溫組120 h 相比,∮P<0.05。圖2 各組大鼠BALF 蛋白質(zhì)含量比較(±s)Note.Compared with the HN group for 0 h, ?P<0.05.Compared with the HC group for 0 h, # P<0.05.Compared with the HN group for 48 h,&P <0.05.Compared with the HN group for 72 h,※P<0.05.Compared with the HN group for 120 h,∮P<0.05.Figure 2 Comparison of bronchoalveolar lavage fluid protein content in the rats of different groups

大鼠肺組織HE 染色顯示,正常對(duì)照組肺泡結(jié)構(gòu)完整,肺間隔無(wú)增厚,肺泡腔或肺間質(zhì)未見(jiàn)明顯水腫,肺泡和肺間質(zhì)未見(jiàn)白細(xì)胞及紅細(xì)胞滲出(圖3A)。 與正常對(duì)照組相比,HN 組及HC 組表現(xiàn)出不同程度的肺組織結(jié)構(gòu)損傷,表現(xiàn)為肺泡結(jié)構(gòu)完整性受損,肺泡腔相互融合擴(kuò)張,形成巨大氣腫狀肺泡(圖3B),局部肺組織實(shí)變、部分肺泡塌陷(圖3C),部分靜脈血管水腫,肺間質(zhì)中有水腫液滲出(圖3D),部分肺泡管、肺泡囊及肺泡中有紅細(xì)胞浸潤(rùn)(圖3E)。

圖3 肺病理組織學(xué)變化Figure 3 Lung histopathological changes

如圖4 所示,48、72 和120 h 的HC 組病理組織學(xué)評(píng)分均高于0 h 的HC 組(P<0.05),72 和120 h的HN 組病理組織學(xué)評(píng)分均高于0 h 的HN 組(P<0.05);48、72 和120 h 的HC 組的病理組織學(xué)評(píng)分均高于HN 組(P<0.05)。 高原寒冷環(huán)境下暴露48 h 時(shí)HC 組病理組織學(xué)評(píng)分達(dá)到最高值(5.4218±0.3983),與72 和120 h 的HC 組比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)。

注:與高原常溫組0 h 相比, ?P<0.05;與高原寒冷組0 h 相比, #P<0.05;與高原常溫組48 h 相比,&P<0.05;與高原常溫組72 h 相比,※P<0.05;與高原常溫組120 h 相比,∮P<0.05。圖4 各組大鼠肺損傷評(píng)分的比較(±s)Note.Compared with the HN group for 0 h, ?P<0.05.Compared with the HC group for 0 h, #P<0.05.Compared with the HN group for 48 h ,&P< 0.05.Compared with the HN group for 72 h,※ P < 0.05.Compared with the HN group for 120 h,∮P<0.05.Figure 4 Comparison of score of lung injury in the rats of different groups

3 討論

長(zhǎng)期以來(lái),由于低壓缺氧、寒冷、復(fù)雜地形等極端環(huán)境因素,生活在高海拔地區(qū)一直是對(duì)人類(lèi)的挑戰(zhàn)[12]。 高海拔地區(qū)降低的氧分壓創(chuàng)造了一個(gè)獨(dú)特的環(huán)境條件稱(chēng)為高原低壓缺氧環(huán)境[13]。 在快速攀登海拔3000 m 以上地區(qū)的人群中,由急性高原病發(fā)展而來(lái)的急性高原肺水腫仍是一個(gè)未解決的問(wèn)題。在高海拔地區(qū)出現(xiàn)呼吸困難、咳嗽、粉紅色泡沫痰[1],可能?chē)?yán)重影響活動(dòng)或緊急軍事任務(wù)。

急性高原肺水腫是急進(jìn)高海拔地區(qū)時(shí)發(fā)生的一種非心源性肺水腫,通常發(fā)生在到達(dá)高海拔地區(qū)后2~5 d[6]。 高原環(huán)境大鼠肺水腫模型的成功建立受到海拔高度、減壓速度,持續(xù)時(shí)間、艙內(nèi)環(huán)境及機(jī)體情況等多種因素影響[14-16]。 現(xiàn)有的高原肺水腫動(dòng)物模型的研究都使用了大鼠模型。 大鼠在低氧條件下可誘導(dǎo)低氧性肺血管收縮反應(yīng),嚴(yán)重的低氧性肺血管收縮反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致高原肺水腫的發(fā)生[17]。以往的高原肺水腫模型建立方法,著重于海拔高度、缺氧和勞累等因素,國(guó)內(nèi)目前還未見(jiàn)報(bào)道有研究關(guān)注溫度對(duì)于肺水腫模型建立的影響,為了更加符合高原環(huán)境寒冷、低壓、缺氧的極端環(huán)境,本次實(shí)驗(yàn)在肺水腫模型建立的條件中加入了溫度這一影響因素,通過(guò)降低環(huán)境溫度結(jié)合低壓缺氧等條件更快、更全面的建立重復(fù)性好、最貼近高原真實(shí)環(huán)境的肺水腫模型,為急性高原肺水腫后續(xù)的治療創(chuàng)造基礎(chǔ)條件。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)特殊的低壓缺氧結(jié)合寒冷模擬高海拔暴露大鼠高原肺水腫的發(fā)生,即24、48、72 和120 h 的寒冷低壓缺氧狀態(tài)。 比較在不同環(huán)境溫度影響下不同暴露時(shí)間大鼠肺組織的變化及特異性指標(biāo),建立穩(wěn)定的急性高原肺水腫實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?本實(shí)驗(yàn)通過(guò)肺組織的HE 染色發(fā)現(xiàn),相較于0 h 時(shí),高原常溫及高原寒冷組其他時(shí)間點(diǎn)的大鼠均表現(xiàn)出不同程度的肺組織損傷表現(xiàn),尤其是高原寒冷48 h 組和高原常溫72 h 組,肺組織肺泡間隔明顯增寬,大量紅細(xì)胞和炎性細(xì)胞溢出,且出現(xiàn)肺泡間隔的明顯水腫,這一結(jié)果說(shuō)明在缺氧刺激下,肺部血管收縮,使血液更多的分布在阻力較小的毛細(xì)血管,使水腫液從毛細(xì)血管漏出、轉(zhuǎn)移并潴留,引起肺間質(zhì)和肺泡水腫。 肺組織濕/干重比值是評(píng)估動(dòng)物模型肺水腫整體嚴(yán)重程度的指標(biāo),肺泡灌洗液蛋白質(zhì)含量是評(píng)估肺泡毛細(xì)血管通透性的指標(biāo)[18]。 有相關(guān)研究表明,高原肺水腫大鼠具有肺含水量增加,肺泡毛細(xì)血管通透性增高的特征[18-20]。 同樣的,在我們的研究中高原寒冷48 h 組和高原常溫72 h 組大鼠肺組織中的濕/干重比值和肺泡灌洗液蛋白質(zhì)含量明顯高于其他組,說(shuō)明高原環(huán)境會(huì)使大鼠肺泡毛細(xì)血管通透性增強(qiáng)。 由此,結(jié)合上述3 項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)的變化,在高原寒冷環(huán)境48 h 組和高原常溫72 h 組大鼠的肺水腫模型建立成功,并且我們可以推定寒冷因素加速了肺水腫的發(fā)展進(jìn)程,可更快的建立急性高原大鼠肺水腫模型。

這種現(xiàn)象在肺組織病理變化中也同樣得到體現(xiàn)。 這說(shuō)明了寒冷可以加劇高原肺水腫的形成。寒冷應(yīng)激是一種嚴(yán)重的急性應(yīng)激類(lèi)型,可能導(dǎo)致局部及全身的免疫系統(tǒng)損傷[21],降低其防御功能,使其易受致病因素的影響[22],誘導(dǎo)氣道炎癥反應(yīng),導(dǎo)致肺功能下降[23]。 寒冷誘導(dǎo)的靶器官損害首先發(fā)生在血流豐富的組織中。 肺作為肺循環(huán)中的主要器官,為全身提供氧氣,是對(duì)血流變化最敏感的器官[24]。 寒冷應(yīng)激是一種已知的誘發(fā)和加重呼吸系統(tǒng)疾病的環(huán)境因素[25]。 相關(guān)研究表明,暴露于冷應(yīng)激可直接引起血流動(dòng)力學(xué)改變,導(dǎo)致血栓形成、組織缺血再灌注和炎癥損傷[26]。 在寒冷應(yīng)激期間,細(xì)胞外液的結(jié)晶會(huì)直接損傷細(xì)胞膜,使細(xì)胞膨脹[27],影響滲透壓,導(dǎo)致毛細(xì)血管通透性在快速血管收縮下發(fā)生變化[28]。 此外,肺直接暴露在冷空氣中,導(dǎo)致肺動(dòng)脈平滑肌收縮甚至痙攣[29]。 在高原環(huán)境中,缺氧會(huì)導(dǎo)致肺血管平滑肌收縮[13],加上寒冷因素的影響,會(huì)加劇肺血管的收縮,進(jìn)而形成肺動(dòng)脈高壓。在本實(shí)驗(yàn)中,由于設(shè)備和操作的復(fù)雜性,沒(méi)有測(cè)定肺動(dòng)脈壓這項(xiàng)指標(biāo)。 但在林雪等[30]研究中,與平原對(duì)照組相比,高原低壓低氧組大鼠的肺動(dòng)脈壓力明顯增高。 高原寒冷組大鼠的肺組織濕/干重比值和肺泡灌洗液蛋白質(zhì)含量顯著高于高原常溫組,并且肺組織病理學(xué)顯示肺泡上皮完整性被破壞,肺泡-毛細(xì)血管屏障功能持續(xù)受損。 由此,我們可以推測(cè),缺氧及寒冷聯(lián)合作用會(huì)顯著收縮肺部動(dòng)脈,使肺動(dòng)脈壓力升高,大量肺部血液積聚于壓力相對(duì)較小的毛細(xì)血管,導(dǎo)致毛細(xì)血管壓力升高,血液中蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)通過(guò)肺泡-毛細(xì)血管屏障進(jìn)入肺泡腔,使毛細(xì)血管中的膠體滲透壓降低并且破壞了肺泡上皮的完整性,使更多的富含蛋白質(zhì)的水腫液流入肺泡。

最后,從肺組織病理、肺組織濕/干重比值及肺泡灌洗液蛋白質(zhì)含量的結(jié)果來(lái)看,在高原常溫環(huán)境暴露72 h 組可建立急性高原肺水腫模型,但高原寒冷組的大鼠只需48 h 就可形成急性高原肺水腫。所以,暴露在模擬海拔7000 m 高原寒冷低壓缺氧環(huán)境至48 h 可成功建立急性高原肺水腫模型,且造模方法簡(jiǎn)便有效,用時(shí)更短,適合大批量快速的動(dòng)物造模,可重復(fù)性好,為我們后續(xù)對(duì)急性高原肺水腫的發(fā)病機(jī)制與預(yù)防治療打下良好的基礎(chǔ)。