喬靜，馮玲，顏秋霞，周秀琴，朱振杰，張國志，陳彩蓉

(廣州醫(yī)科大學附屬第六醫(yī)院，清遠市人民醫(yī)院生殖醫(yī)學中心，清遠 511520)

胚胎選擇是體外受精過程中進行胚胎移植的關(guān)鍵因素，相當一部分患者的胚胎移植入子宮后并不能著床[1]。近年來國際會議上對單胚胎移植的呼聲越來越高，故而胚胎優(yōu)選環(huán)節(jié)相當重要。體外受精中最常用的胚胎選擇方法是胚胎的形態(tài)分級[2]。然而，這種方法需要在特定的時間點將胚胎移出培養(yǎng)箱在顯微鏡下觀察胚胎，胚胎學家可獲得的信息相對有限；而且將胚胎移入和移出培養(yǎng)箱存在安全隱患及培養(yǎng)環(huán)境改變影響培養(yǎng)體系的穩(wěn)定，從而影響胚胎發(fā)育。

隨著IVF中時差成像(Time-lapse imaging，TLI)技術(shù)的引入，通過在確定的間隔和焦平面捕捉圖像來連續(xù)監(jiān)測胚胎發(fā)育成為可能[3]。TLI的優(yōu)點之一是能夠在不干擾培養(yǎng)條件的情況下實時觀察胚胎[4]，并提供了一種無創(chuàng)的方法來識別具有最高植入潛能的胚胎。自從這項技術(shù)投入使用以來，可以通過TLI識別與相關(guān)形態(tài)動力學參數(shù)預測胚胎發(fā)育和臨床結(jié)局。然而，關(guān)于其在臨床上的應用意義并未達成普遍共識。

本研究通過比較本中心TLI培養(yǎng)與常規(guī)培養(yǎng)的胚胎發(fā)育情況和妊娠結(jié)局，探討TLI的臨床應用價值，以期為TLI技術(shù)挑選胚胎移植提供參考。

資料和方法

一、研究對象

回顧性分析2019年1月至2020年12月在我中心行體外受精(IVF)或卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)并選擇新鮮周期移植的510例患者的510個周期的臨床資料。其中使用TLI系統(tǒng)培養(yǎng)胚胎的166個周期為TLI組，使用常規(guī)培養(yǎng)胚胎的344個周期為常規(guī)組。

納入標準：女方年齡<40歲，因輸卵管堵塞和卵巢高反應或男方因素(重度少、弱、畸精子癥，梗阻性無精子癥，性功能障礙等)接受輔助生殖治療；促排卵方案主要為改良長方案或拮抗劑方案；IVF/ICSI周期；首次行輔助生殖技術(shù)助孕，新鮮周期卵裂胚移植。

排除標準：獲卵數(shù)≤3個；合并子宮內(nèi)膜息肉、子宮肌瘤、輸卵管積水、子宮畸形(如縱隔子宮)、宮腔粘連、子宮內(nèi)膜異位癥、巧克力囊腫、復發(fā)性流產(chǎn)等；夫妻雙方染色體異常，或患有遺傳性疾?。缓喜⒆陨泶x性疾病，如糖尿病、高血壓、甲狀腺相關(guān)疾病等；基礎資料收集不全；男方無精子癥、睪丸發(fā)育不良、泌尿生殖系統(tǒng)炎癥。

二、診療回顧

1.取卵及人工授精：患者進行改良長方案或拮抗劑方案促排卵。當女方有2個或2個以上卵泡直徑≥18～20 mm時，肌肉注射HCG(珠海麗珠制藥)，34～36 h后經(jīng)陰道超聲引導下穿刺取卵，記錄獲卵數(shù)。男方在女方取卵日當天取精，精子和卵子在體外結(jié)合16～18 h后脫顆粒，或直接將卵子脫顆粒后行ICSI。所有患者在選擇胚胎培養(yǎng)方式(常規(guī)培養(yǎng)、TLI系統(tǒng)培養(yǎng))時，均在醫(yī)生告知情況后自愿做出決定，并簽署胚胎培養(yǎng)知情同意書。

2.胚胎培養(yǎng)：受精后的2PN胚胎轉(zhuǎn)入含G-1培養(yǎng)液(Vitrolife，瑞典)的培養(yǎng)皿。常規(guī)組放入普通培養(yǎng)箱(Labotech C60，德國)，培養(yǎng)環(huán)境為6.0%CO2、5%O2、37℃；TLI組放入Embryoslid培養(yǎng)皿，置于Embryo Scope時差培養(yǎng)箱(Vitrolife，瑞典)，培養(yǎng)箱環(huán)境6.0%CO2、5%O2、37℃。胚胎培養(yǎng)至第3天時，挑選優(yōu)質(zhì)胚胎進行新鮮移植或者冷凍，剩余胚胎換液繼續(xù)培養(yǎng)至第5或第6天，常規(guī)組胚胎更換至含G-2培養(yǎng)液(Vitrolife，瑞典)的培養(yǎng)皿；TLI組暫停拍照，取出培養(yǎng)皿，將G-1培養(yǎng)液吸出，盡快換成G-2培養(yǎng)液，再次放入TLI系統(tǒng)中培養(yǎng)。設置拍照時間間隔為1次/10 min和每小時7個等距的焦平面掃描，連續(xù)拍攝3～6 d。

3.胚胎評分和移植：常規(guī)組根據(jù)傳統(tǒng)胚胎評分方法(根據(jù)卵裂球分裂數(shù)目、卵裂球大小、均一度及碎片率)對胚胎進行評級，本中心的優(yōu)質(zhì)胚胎定義為第3天卵裂球數(shù)目7～9個、卵裂球均一且碎片率≤20%。而TLI組則根據(jù)標記胚胎發(fā)育的各個關(guān)鍵時間點結(jié)合胚胎發(fā)育動力學以及胚胎形態(tài)學優(yōu)選胚胎。每組根據(jù)各患者的具體情況，選擇1～2枚優(yōu)質(zhì)卵裂期胚胎進行新鮮周期移植。TLI組移植前需回看胚胎發(fā)育過程選擇優(yōu)質(zhì)胚胎，排除直接卵裂、逆卵裂、多核等異常發(fā)育來源的胚胎；剩余胚胎繼續(xù)囊胚培養(yǎng)。囊胚評分采用Gardner評分系統(tǒng)，根據(jù)囊胚的擴張和孵出程度將其分為1～6期，對3～6期的囊胚進一步評價內(nèi)細胞團(ICM)和滋養(yǎng)層細胞(TE)質(zhì)量。本中心定義3BC及以上的囊胚為可利用囊胚，≥3BB者為優(yōu)質(zhì)囊胚。

4.臨床結(jié)局評價：移植后14 d測β-HCG，陽性者于4～6周B超檢查見孕囊者為臨床妊娠。

三、觀察分析指標

患者一般資料，包括年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、基礎激素水平、不孕相關(guān)資料等；促排卵資料，包括Gn用量、獲卵數(shù)等；受精及胚胎培養(yǎng)資料，包括受精結(jié)局和胚胎質(zhì)量評估；新鮮周期移植結(jié)局，包括移植胚胎數(shù)量及質(zhì)量、移植日內(nèi)膜厚度、胚胎種植率、臨床妊娠率、流產(chǎn)率、雙胎率等。臨床妊娠率和種植率以胚胎移植后第5周超聲檢查探及宮內(nèi)孕囊為標準。

四、統(tǒng)計學分析

結(jié) 果

一、兩組患者的一般資料及促排卵情況比較

本研究共納入510例患者的510個周期，其中常規(guī)組344個周期、TLI組166個周期。兩組患者的女方BMI、不孕年限、基礎FSH水平、原發(fā)性不孕占比、Gn總量、獲卵數(shù)比較均無顯著性差異(P>0.05)，而TLI組的女方年齡顯著小于常規(guī)組，獲卵數(shù)顯著高于常規(guī)組(P<0.05)(表1)。

表1 兩組患者的一般資料及促排卵情況比較[(-±s)，n(%)]

二、兩組患者間胚胎發(fā)育情況比較

TLI組的正常受精率顯著高于常規(guī)組(P<0.001)，且囊胚形成率、可利用囊胚率與優(yōu)質(zhì)囊胚率均顯著高于常規(guī)組(P<0.05)；其它的相關(guān)評價指標比較均無顯著性差異(P>0.05)(表2)。

表2 兩組間胚胎發(fā)育情況比較(%)

三、兩組患者間新鮮周期移植結(jié)局比較

TLI組平均移植胚胎數(shù)顯著少于常規(guī)組(P<0.05)；TLI組胚胎種植率、臨床妊娠率及流產(chǎn)率均略高于常規(guī)組，雙胎率略低于常規(guī)組，但均無顯著性差異(P>0.05)(表3)。

表3 兩組間新鮮移植周期臨床結(jié)局比較[(-±s)，%]

四、基于傾向性得分評分匹配后的結(jié)果

考慮到基線數(shù)據(jù)包括年齡、獲卵數(shù)兩組不均衡，本研究進一步對數(shù)據(jù)進行傾向性得分評分匹配，比例為1∶1，最終得到常規(guī)組和TLI組各164例。

兩組患者間基線資料比較均無顯著性差異(P>0.05)(表4-1)。相關(guān)結(jié)局與未匹配前基本一致，TLI組正常受精率、囊胚形成率、可利用囊胚率、優(yōu)質(zhì)囊胚率均顯著優(yōu)于常規(guī)組(P<0.05)(表4-2)；TLI組移植胚胎數(shù)顯著低于常規(guī)組(P<0.05)，而組間胚胎種植率、臨床妊娠率、流產(chǎn)率、雙胎率均無顯著性差異(P>0.05)(表4-3)。

表4-1 傾向性匹配后兩組間基礎資料比較[(-±s)，%]

表4-2 傾向性匹配后兩組間胚胎發(fā)育情況比較(%)

表4-3 傾向性匹配后兩組間新鮮移植周期臨床結(jié)局比較[(-±s)，%]

討 論

TLI作為新的胚胎培養(yǎng)及觀察系統(tǒng)，根據(jù)其提供的完整胚胎動力學參數(shù)，可觀察到胚胎發(fā)育的異常事件，為胚胎學家挑選胚胎提供有利的依據(jù)。因此，TLI系統(tǒng)也越來越廣泛地應用于各大生殖中心實驗室，用于卵裂期胚胎的培養(yǎng)與選擇。

本研究發(fā)現(xiàn)，通過TLI系統(tǒng)培養(yǎng)的胚胎其正常受精率要比常規(guī)培養(yǎng)組高。伊斯坦布爾共識認為精卵結(jié)合后原核將在(17±1)h時間段出現(xiàn)[5]，但少部分胚胎可能會發(fā)生原核早消失或者晚發(fā)生事件[6]。而我中心常規(guī)培養(yǎng)的胚胎一般在受精18～19 h左右拿出培養(yǎng)箱在顯微鏡下觀察，因此有時會錯過原核觀察的時間；而TLI系統(tǒng)可以實時監(jiān)控原核的發(fā)生及消失，并以每10 min拍攝1次的頻率和每小時7個等距的焦平面掃描，減少了漏檢的幾率，因此，TLI系統(tǒng)培養(yǎng)較常規(guī)培養(yǎng)有更高的正常受精率。

胚胎正常的卵裂過程可能與正常的細胞骨架功能、誘發(fā)卵母細胞受精的激活事件(如鈣離子振蕩)、線粒體功能以及高質(zhì)量染色體有關(guān)[7-8]。這幾個因素可以在卵裂異常的發(fā)生中起作用，延遲和異常的分裂模式可能表明DNA損傷或染色體分離錯誤，這些錯誤可以激活一些細胞周期檢查點，阻止細胞周期進程，甚至導致非整倍體發(fā)生。有研究發(fā)現(xiàn)，通過TLI系統(tǒng)觀察到異常卵裂的胚胎行囊胚培養(yǎng)后，其囊胚形成率及優(yōu)質(zhì)囊胚率均低于正常卵裂的胚胎[4，7-9]；通過TLI的計算機自動細胞追蹤軟件結(jié)合形態(tài)學評估，可顯著提高囊胚期的胚胎發(fā)育能力[從(18.3±23.3)%提高到(68.2±1.7)%，P<0.05][2，10]。但2020年高洋等[11]研究表明，使用TLI系統(tǒng)培養(yǎng)的D3胚胎的可利用胚胎率、囊胚形成率、可利用囊胚率及優(yōu)質(zhì)囊胚率與常規(guī)培養(yǎng)相比較并無顯著性差異(P>0.05)。本研究發(fā)現(xiàn)，與常規(guī)組相比較，TLI組卵母細胞利用率及D3優(yōu)質(zhì)胚胎率并沒有提高，但囊胚形成率、可利用囊胚率和優(yōu)質(zhì)囊胚率均顯著改善(P<0.05)；且考慮到年齡、獲卵數(shù)在兩組間的不均衡，進一步通過傾向性得分評分匹配后，仍得到相同的結(jié)論。分析認為在常規(guī)培養(yǎng)中，一些被評為1、2級的優(yōu)質(zhì)胚胎，使用TLI系統(tǒng)有可能觀察到這些胚胎發(fā)生了卵裂扭轉(zhuǎn)、細胞直接卵裂、逆向卵裂及多核現(xiàn)象等，從而把它們歸為非優(yōu)質(zhì)胚胎，這有可能是本研究中TLI組D3優(yōu)質(zhì)胚胎率與常規(guī)組相比沒有提高的原因，而這些發(fā)育異常的胚胎有可能培養(yǎng)成很好的囊胚；此外TLI系統(tǒng)無干擾的培養(yǎng)環(huán)境保證獲取圖像信息的同時不造成培養(yǎng)環(huán)境波動[12]，有助于胚胎的發(fā)育，這可能也是本次研究中TLI組的囊胚形成率、可用囊胚率和優(yōu)質(zhì)囊胚率比常規(guī)組高的原因。

有研究認為，發(fā)生多核的胚胎可能是由于染色體畸變或發(fā)生嵌合造成的，而多核發(fā)生在4細胞期或同時發(fā)生在2細胞與4細胞時期，可能會降低患者的臨床妊娠率和著床率[3，13]。Ergin等[3]表明，胚胎發(fā)生異常第一次胞質(zhì)分裂、異常分裂和無序卵裂等現(xiàn)象，其胚胎后期發(fā)育潛能明顯低于正常分裂的胚胎。一項使用不同方法的薈萃分析表明，與傳統(tǒng)的孵育和評估相比，通過TLI優(yōu)選胚胎，避免了異常卵裂胚胎被移植，妊娠結(jié)局有所改善，顯著增高了持續(xù)妊娠率，降低了早期妊娠損失[4]。2019年的一篇綜述對9項隨機對照試驗、2 955名婦女進行總結(jié)，認為沒有足夠的證據(jù)表明TLI結(jié)合胚胎選擇軟件優(yōu)選胚胎，比傳統(tǒng)孵育和評估優(yōu)選胚胎在活產(chǎn)率、流產(chǎn)率或臨床妊娠率方面存在顯著差異[14]。Meseguer等[15]在一項對1 882個周期的回顧性研究中比較了TLI系統(tǒng)和常規(guī)胚胎培養(yǎng)的累積活產(chǎn)率，該研究顯示兩者的累積活產(chǎn)率相似[15]。因此，TLI系統(tǒng)在改善臨床結(jié)局這一方面依舊存在爭議。然而在本次研究中我們發(fā)現(xiàn)，新鮮胚胎移植周期中，TLI組在平均胚胎移植個數(shù)顯著少于常規(guī)組的情況下，臨床妊娠率有增長的趨勢(57.22% vs. 51.16%；傾向性匹配后57.32% vs. 54.88%)，雙胎率有降低趨勢(21.05% vs. 24.43%；傾向性匹配后21.28% vs. 25.56%)，雖然尚無統(tǒng)計差異(P>0.05)，但這在某種程度上說明正是因為使用TLI系統(tǒng)讓胚胎在穩(wěn)定的環(huán)境中培養(yǎng)，避免胚胎暴露在非生理條件下，如pH和溫度變化或氣體(CO2和O2)濃度改變，減少了胚胎產(chǎn)生物理和化學應激反應的風險[16]；且TLI系統(tǒng)讓我們連續(xù)地觀察到胚胎發(fā)育的全過程，從而可以更好、更精準地選擇胚胎移植，在減少移植胚胎個數(shù)的基礎上并未影響臨床結(jié)局，減低了雙胚移植帶來的多胎妊娠風險，為臨床實行單胚胎移植提供了很好的參考依據(jù)。

綜上所述，TLI系統(tǒng)作為新型胚胎培養(yǎng)體系，比常規(guī)培養(yǎng)更加便捷與穩(wěn)定，并且提高了正常受精率、可利用囊胚率及優(yōu)質(zhì)囊胚率，更有利于挑選優(yōu)質(zhì)胚胎進行臨床移植；雖現(xiàn)有數(shù)據(jù)顯示TLI系統(tǒng)對臨床結(jié)局的改善并不顯著，但隨著TLI系統(tǒng)的普及，可通過多中心前瞻性大數(shù)據(jù)研究進一步論證其對臨床結(jié)局的影響。