舒玉鳳，盧靜靜，陳 旭

（武漢設計工程學院食品與生物科技學院，湖北 武漢 430205）

蒲公英 （Taraxacum mongolicum） 味微苦，寒性，具有清熱解毒和利尿等功效[1]，多糖作為蒲公英中的活性成分，具備增強機體免疫力、降低血脂、預防衰老和抗輻射等功能，在醫(yī)療和保健方面具有重要的潛在應用價值[2-3]，因此蒲公英中多糖提取的研究越來越引起人們的關注?，F(xiàn)在國內(nèi)外比較普遍的使用酶解法和熱水浸提法提取蒲公英中的多糖[4-5]。與前兩者提取法相比較，超聲波輔助提取具有用時短、容易操作、效果良好等特點，已應用于植物有效成分的提取[6]，但在蒲公英多糖提取方面有關的報道不多。

自由基又稱游離基，能夠破壞細胞的化學物質，破壞機體內(nèi)的遺傳基因組織、酶、脂肪、碳水化合物等，進而導致食品發(fā)生腐敗變質。為有效扼制食品中有害微生物的生長和減緩其被氧化變質的過程，目前主要通過添加防腐劑和抗氧化劑，但工業(yè)合成的抗氧化物存在較多安全隱患。從食物和天然產(chǎn)物中尋找活性物質，開發(fā)抑菌、抗氧化、降低血糖、血脂及高血壓等功能性食品或藥物成為現(xiàn)下研究的熱門[7]。據(jù)文獻報道，天然活性成分可提供氫離子或螯合金屬離子，達到清除自由基的目的[8]，所以研究植物及中藥提取物對抑制其產(chǎn)生具有重要意義。

利用超聲波輔助水提法提取蒲公英多糖，探究各因素對蒲公英多糖得率的影響，并對此進行優(yōu)化以確定最佳提取條件，同時研究蒲公英多糖抗氧化活性，為進一步研究和開發(fā)蒲公英多糖尋找較為恰當?shù)奶崛》椒ê蜅l件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蒲公英，購自當?shù)刂兴幍辏黄咸烟?、濃硫酸、苯酚、乙醇、三氯化鐵、硫酸亞鐵、DPPH、H2O2和鄰苯三酚試劑，均為國產(chǎn)分析純；試驗用水為蒸餾水，購自屈臣氏。

1.2 儀器與設備

UV-1800 CP 型紫外分光光度計，上海美譜達儀器有限公司產(chǎn)品；FW-200 型高速萬能粉碎機，北京中興偉業(yè)儀器有限公司產(chǎn)品；HH-S4 型數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市富華儀器有限公司產(chǎn)品；MEC 型超聲波清洗機，深圳市明和超音波工業(yè)股份有限公司產(chǎn)品；DHG-9240（A） 型電熱鼓風干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司產(chǎn)品；TDL-5-A 型離心機，上海安亭科學儀器廠產(chǎn)品。

1.3 試驗方法

1.3.1 原料預處理

選取無蟲蛀、無霉斑的干燥蒲公英植株，置于高速粉碎機中粉碎，過60 目篩，將制備的蒲公英粉末采用索氏抽提法在50 ℃條件下，用石油醚回流處理4 h 后得到脫脂蒲公英粉末，過篩干燥備用。

1.3.2 蒲公英多糖提取工藝

稱取適量脫脂蒲公英粉，加入去離子水攪拌均勻，熱水浸提后取出室溫下冷卻。以轉速4 000 r/min離心10 min，取上清液，加入3 倍體積的95%乙醇，密封后于4 ℃的條件下靜置24 h，再次以轉速4 000 r/min 離心20 min，數(shù)次清洗沉淀，將沉淀用去離子水溶解并定容至100 mL，于波長490 nm 處測定吸光度。通過標準曲線計算多糖含量[13]，并按照公式計算蒲公英多糖得率。

式中：m1——多糖質量，g；

m2——樣品質量，g。

1.3.3 單因素試驗

以蒲公英粉末為試驗原料，利用超聲波輔助熱水浸提法，研究提取時間 （60，90，120，150，180 min）、超聲功率 （40，80，120，160，200 W）、提取溫度 （50，60，70，80，90 ℃） 和料液比 （1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50） 對多糖得率的影響。

1.3.4 響應面試驗

在單因素試驗條件下，將Box-behnken 試驗作為依據(jù)設計試驗原理，將蒲公英多糖得率作為響應值進行響應面試驗，并驗證最佳提取工藝條件。

響應面因素與水平設計見表1。

表1 響應面因素與水平設計

1.3.5 抗氧化活性測定

（1） DPPH·清除能力的測定。參考文獻[9-10]。準確取2.0 mL 不同濃度的樣品溶液和0.1 mmol/L 的DPPH 溶液2.0 mL 混合，充分搖勻，避光反應30 min，以無水乙醇作為空白，于波長510 nm 處測定吸光度。以維C 作為對照品，試驗3 次，取平均值。

（2） 羥基自由基（·OH） 清除能力的測定。參考文獻[9-10]。分別取不同濃度樣品溶液1.0 mL，加入 6 mmol/L 的 FeSO4溶液 1 mL，6 mmol/L 水楊酸 -乙醇溶液 1 mL 和 6 mmol/L 的 H2O2溶液 1 mL，于37 ℃下水浴400 min，然后于波長510 nm 處測定吸光度。以相同濃度的維C 作為對照，以相同體積的蒸餾水作空白組，試驗3 次，取平均值。

（3） 超氧陰離子自由基 （O2-·） 清除能力的測定。參考文獻[9-10]。分別取不同濃度的樣液2.0 mL，然后加入2.5 mL 濃度為0.05 mol/L 的Tris-HCl 緩沖液（pH 值8.8）。室溫下混勻后加入濃度為6 mmol/L的鄰苯三酚溶液0.1 mL 后開始計時5 min，每隔30 s記錄波長320 nm 處的吸光度。以相同濃度的維C 作為對照，以相同體積的蒸餾水作空白組，試驗3 次，取平均值。

1.3.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有試驗均平行3 次，取平均值。單因素及抗氧化試驗數(shù)據(jù)采用Origin 8.0 軟件處理，響應面優(yōu)化試驗采用Design Expert.V 8.0.6 軟件分析，并進行模型方差分析。

2 結果與分析

2.1 超聲波輔助提取蒲公英多糖的研究

2.1.1 單因素試驗

不同超聲時間、超聲功率、提取溫度和料液比對蒲公英多糖得率的影響見圖1。

由圖 1 （a） 可知，提取時間在 1.0～2.5 h 過程中，蒲公英多糖得率與時間呈正相關，在2.5 h 時多糖得率達到峰值，為58.6 mg/g，隨著提取時間增加至3 h 時，蒲公英多糖得率開始下滑。這可能是因為蒲公英中的多糖隨著超聲波引起的熱量匯集而開始溶解[11]，從而使多糖得率下跌。因此，超聲時間選擇2.5 h。由圖 1（b） 可知，超聲功率為 40～120 W時，蒲公英多糖得率隨與超聲功率呈正相關，功率為120 W 時多糖的得率達到峰值，為73.3 mg/g，繼續(xù)增大功率，多糖得率開始下滑。主要原因可能是超聲功率加大，劇烈的機械作用使得分子擴散速度加快，蒲公英多糖更容易滲出，但是機械功率過大之后，蒲公英中其他水溶性物質也被提取出來與多糖發(fā)生反應，從而使多糖得率下降。綜合實際因素，超聲功率定為120 W。由圖1（c） 可知，提取溫度為50～80 ℃時，蒲公英多糖得率與提取溫度呈正相關。在80 ℃時多糖得率達到最峰值，為59.6 mg/g，隨著提取溫度的升高，多糖的得率逐漸下降。可能是在超聲條件下細胞中內(nèi)容物的擴散更方便，使多糖的溶出更容易[11]，當溫度大于80 ℃時，超聲溫度過高使糖苷鍵發(fā)生斷裂，從而多糖得率有所下降。所以提取溫度為80 ℃。由圖1（d） 可知，在料液比為1∶20 時，蒲公英多糖得率最達到峰值，為68.3 mg/g，繼續(xù)增加料液比，蒲公英多糖得率減小，這是由于在超聲條件下，溶劑含量較大，蒲公英中其他水溶性雜質也容易溶出，經(jīng)過濃縮之后，多糖與其發(fā)生反應，從而使多糖得率下降。最佳料液比為1∶20（g∶mL）。

圖1 不同超聲時間、超聲功率、提取溫度和料液比對蒲公英多糖得率的影響

2.1.2 響應面優(yōu)化試驗

（1） 響應面試驗結果及方差分析。

響應面設計方案和試驗結果見表2。

表2 響應面設計方案和試驗結果

采用Design Eexpert V8.0.6 軟件對表2 中試驗結果進行多項擬合回歸，得到蒲公英多糖得率對超聲時間（A）、超聲功率（B）、提取溫度（C） 和料液比（D） 的二次多項回歸模型方程：

回歸方程系數(shù)顯著性檢驗和方差分析見表3。

由表3 可知，模型的p＜0.000 1＜0.01，差異極顯著；失擬項的p 值為0.052 4，不顯著，說明模型穩(wěn)定，數(shù)據(jù)沒有異常點；決定系數(shù)R2=0.999 7，調整確定系數(shù)R2Adj=0.999 4，響應值的變化有99.94% 來源于所選的超聲溫度、超聲時間和料液比3 個因素，說明模型擬合程度可靠，回歸方程能很好地展現(xiàn)各因素與響應值之間的關系。考查p 值與F 值大小，可知料液比的影響最大，提取溫度次之，超聲時間其后，超聲功率的影響最小。

表3 回歸方程系數(shù)顯著性檢驗和方差分析

各因素交互作用對蒲公英多糖得率的響應面見圖2。

響應曲面坡度體現(xiàn)了響應值面對操作條件改變的靈敏程度，即曲面陡峭度與多糖得率對于超聲時間、提取溫度、提超聲功率、料液比4 個條件的改變呈正相關。由圖2 可知，各因素交互作用的影響順序為 BC＞AD＞CD＞AC＞AB＞BD，與表 3 結果一致，即超聲功率和提取溫度曲面最陡峭，兩者交互作用對蒲公英多糖得率影響最大。而提取溫度和料液比的交互作用響應面較平緩，說明提取溫度和料液比的交互作用對蒲公英多糖得率影響不大。

2.2 最佳工藝條件驗證

通過回歸模型預計測得超聲波輔助提取蒲公英多糖的最佳工藝條件為超聲時間154.2 min，超聲功率136.55 W，提取溫度82.52 ℃，料液比1∶22.33（g∶mL），此條件下蒲公英多糖得率89.38 mg/g。

根據(jù)實際試驗條件調整提取工藝。超聲波輔助提取蒲公英多糖的工藝條件為超聲時間154 min，超聲功率137 W，提取溫度82.5 ℃，料液比1∶22（g∶mL）。

根據(jù)調整后工藝條件，設置5 組平行試驗進行試驗驗證。結果表明，超聲波輔助提取蒲公英多糖得率88.62±0.18 mg/g，與理論值相差微小，證明該回歸模型獲得了較為準確的優(yōu)化參數(shù)。

3 結論

通過單因素試驗和響應面分析法優(yōu)化超聲波輔助提取蒲公英多糖工藝參數(shù)。結果表明，超聲波輔助法提取蒲公英多糖的最佳條件為超聲時間154 min，超聲功率137 W，提取溫度82.5 ℃，料液比1∶22（g∶mL），此條件下多糖得率可到達88.62 mg/g，說明超聲波輔助提取法對蒲公英多糖的提取有較為明顯的增強作用，是一種操作性強且經(jīng)濟有效的提取方法。在各影響因素中，影響最大的是料液比，超聲功率和提取溫度兩者交互作用對蒲公英多糖得率影響最顯著。方差分析中決定系數(shù)R2為99.97%，變異系數(shù)為0.54%，說明試驗的數(shù)據(jù)穩(wěn)定、可靠，為蒲公英多糖提取的生產(chǎn)提供了理論依據(jù)。

試驗還研究了最優(yōu)工藝條件下提取的多糖在抗氧化性能力方面的效果。結果表明，蒲公英多糖對DPPH·，·OH 和 O2-·3種自由基均有一定清除作用，對DPPH·自由基清除率較強[12]，可用于天然抗氧化劑開發(fā)或功能性食品原料。綜上所述，試驗所提供的超聲波輔助提取蒲公英能顯著提高多糖得率。同時，有效保護了多糖的抗氧化活性，為蒲公英的深度開發(fā)提供了一定技術支持和理論依據(jù)。