張玉林，鄒 姮，張覘宇*

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 婦科，重慶 400016； 2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 婦產(chǎn)科 生殖醫(yī)學(xué)中心，重慶 400010；3.教育部生殖與發(fā)育國(guó)際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，重慶 400010)

近年來(lái)，年輕人群惡性腫瘤的發(fā)病率逐漸增加[1]。通常對(duì)于年輕患者的治療方式主要是手術(shù)和輔助化療相結(jié)合。而化療對(duì)于育齡期女性最為顯著的副作用為早發(fā)性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency，POI)和不孕。不同種類(lèi)的化療藥物可引起輕到重度的POI甚至卵巢早衰(premature ovarian failure，POF)。POI/POF是40歲前出現(xiàn)停經(jīng)、低雌激素及高性腺激素水平的一類(lèi)疾病[2]，極大地影響患者的生活質(zhì)量，已經(jīng)成為臨床亟待解決的問(wèn)題。

研究表明烷基化劑如環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide，CTX)對(duì)卵巢功能損傷較強(qiáng)，順鉑、阿霉素次之[3-4]。CTX是常用的化療藥物，可用于多種癌治療。CTX可損傷靜止的原始卵泡和非靜止的生長(zhǎng)卵泡，導(dǎo)致POI，但具體的機(jī)制尚不清楚。因此，本研究旨在建立穩(wěn)定CTX致大鼠POI模型，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序探討其潛在分子機(jī)制，為尋找預(yù)防及保護(hù)藥物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

SPF級(jí)8～10周齡SD雌性大鼠(重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)。環(huán)磷酰胺(江蘇盛迪有限公司)；戊巴比妥鈉(上海思域化工科技有限公司)；E2、FSH、AMH Elisa Kits(上海撫生實(shí)業(yè)有限公司)；Direct-zol RNA miniPrep Kits(ZYMO research, California, USA)；Illumina HiSeq測(cè)序儀(Illumina HiSeq 2000平臺(tái))。

1.2 方法

1.2.1 大鼠的分組及處理：將具有規(guī)律動(dòng)情周期的大鼠隨機(jī)分為4組,每組14只，第1天腹腔注射記為d1，共15 d。對(duì)照組0.9%氯化鈉溶液(d1～d15)，低劑量CTX組 (d1 50 mg/kg, d2～d15 8 mg/kg), 中劑量CTX組 (d1 100 mg/kg, d2～d15 8 mg/kg)和高劑量CTX組(d1 200 mg/kg, d2～d15 8 mg/kg)。每天觀(guān)察大鼠一般情況、生存狀態(tài)，繪制生存曲線(xiàn)，選取最適劑量構(gòu)建POI模型。構(gòu)模2周后處死大鼠進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。動(dòng)物飼養(yǎng)在動(dòng)物中心，所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均按照重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)的指導(dǎo)原則進(jìn)行。

1.2.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)E2、AMH及FSH水平：戊巴比妥鈉腹腔麻醉后經(jīng)腹主動(dòng)脈穿刺采血。按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定血清雌二醇(estradiol，E2)、抗米勒氏管激素(anti-Müllerian hormone，AMH)和促卵泡激素(follicle-stimulating hormone, FSH)水平。

1.2.3 陰道涂片檢測(cè)動(dòng)情周期：在構(gòu)模前、中、后，每日上午9時(shí)行陰道涂片，連續(xù)至少7 d。涂片用蘇木精和伊紅染色(HE)，在光鏡下觀(guān)察。動(dòng)情周期的階段由上皮細(xì)胞(有核和角質(zhì)化)和白細(xì)胞的比例和/或外觀(guān)判定。規(guī)律的動(dòng)情周期 (4～6 d：前期1 d, 發(fā)情期1～2 d,后期1 d,間期1～2 d)；不規(guī)則的周期包括間期延長(zhǎng)或發(fā)情期延長(zhǎng)(連續(xù)3～4 d發(fā)情期,或4～5 d間期)和不規(guī)則的周期(>4 d發(fā)情期或>5 d間期或無(wú)周期性)[5]。

1.2.4 卵巢的HE染色：只有含有清晰可見(jiàn)細(xì)胞核的卵母細(xì)胞的卵泡被計(jì)數(shù)。每個(gè)標(biāo)本統(tǒng)計(jì)1個(gè)完整卵巢的5張切片。

1.2.5 提取卵巢組織RNA及測(cè)序：Direct-zol RNA miniPrep試劑盒提取大鼠卵巢中的總RNA。使用Illumina HiSeq測(cè)序儀進(jìn)行mRNA測(cè)序。

1.2.6 差異表達(dá)基因的篩選及功能富集分析：采用FPKM值對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行歸一化。DESeq2軟件包獲得差異表達(dá)基因(differentially expressed genes，DEGs)。GO和KEGG分析DEGs的潛在功能及參與通路，篩選標(biāo)準(zhǔn)均為校正后P<0.05。

1.2.7 蛋白互作、關(guān)鍵基因及富集分析：通過(guò)String數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)DEGs行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析(Protein Protein Interaction network, PPI network)，在Cytoscape平臺(tái)完成PPI網(wǎng)絡(luò)的可視化并篩選出節(jié)點(diǎn)最高的14個(gè)關(guān)鍵基因，通過(guò)DAVID平臺(tái)對(duì)14個(gè)基因進(jìn)行GO及KEGG富集分析。篩選標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05且FDR<0.05。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,兩組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用構(gòu)成比(%)表示，兩組比較采用卡方檢驗(yàn)。所有分析均采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 大鼠生存情況

中、高劑量組大鼠毛發(fā)暗淡，水?dāng)z入和活動(dòng)量明顯下降，出現(xiàn)血尿及惡病質(zhì)。中劑量CTX組給藥第8、9、10天分別死亡1、3、5只。由于大鼠大量死亡，第10天停止注射CTX，第11、12天分別死亡1只，余3只。高劑量CTX組第8、9、10天分別死亡2、4、3只，第10天停止注射，第11、14天分別死亡1只，余3只。低劑量CTX組僅1只死亡。對(duì)照組無(wú)大鼠死亡(圖1A)。后續(xù)采用低劑量CTX構(gòu)建模型。與對(duì)照組相比，模型組大鼠體質(zhì)量顯著下降(圖1B)。

2.2 E2、AMH、FSH的表達(dá)水平

與對(duì)照組相比，模型組E2、AMH明顯降低(P<0.05)(圖2A～B)，而FSH明顯升高(P<0.01)(圖2C)。

A.survival curve; B.body weights; *P<0.05，**P<0.01，***P<0.001 compared with control group圖1 大鼠生存曲線(xiàn)及體質(zhì)量變化Fig 1 Survival curve and body weight(x±s,n=13)

A．E2; B.AMH; C.FSH; *P<0.05，**P<0.01 compared with control group圖2 性激素水平Fig 2 Sex hormone concentration(x±s,n=6)

2.3 動(dòng)情周期

給藥中模型組53.8%(7/13)出現(xiàn)異常的動(dòng)情周期，其中30.8%(4/13)間期延長(zhǎng)，23.1%(3/13)無(wú)規(guī)律。給藥后，模型組大鼠仍有46%(6/13)表現(xiàn)異常的動(dòng)情周期，分別有23.1%(3/13)表現(xiàn)為發(fā)情期延長(zhǎng)及無(wú)規(guī)律，而對(duì)照組大鼠均有規(guī)律的動(dòng)情周期(圖3)。

2.4 卵巢、子宮大體及卵巢重量

模型組卵巢及子宮較對(duì)照組變小，卵巢重量明顯減輕(P<0.05)(圖4)。

2.5 卵巢組織學(xué)

對(duì)照組卵泡數(shù)較多，各級(jí)卵泡可見(jiàn)，而模型組卵巢纖維化明顯，卵泡數(shù)較少，閉鎖卵泡增加。與對(duì)照組相比，模型組竇前卵泡、竇卵泡減少(P<0.01，P<0.05)，而閉鎖卵泡增加(P<0.01)(圖5)。

2.6 大鼠卵巢RNA-seq

對(duì)照組與模型組之間有829個(gè)上調(diào)和1 473個(gè)下調(diào)的DEGs,其功能主要涉及離子通道及跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，DEGs主要富集于神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路、cAMP信號(hào)通路、鈣信號(hào)通路、軸突導(dǎo)向通路、催產(chǎn)素信號(hào)通路、胰島素分泌通路、醛固酮合成及分泌通路等(圖6A～C)。

A.proestrus; B.estrous; C.metestrus; D.diestrus; E.estrous cycles before (0 week), during (1 week) and after CTX (3 weeks); *P<0.05，**P<0.01 compared with the control group圖3 動(dòng)情周期Fig 3 Estrous cycles(%,n=13)

A.ovary; B.uterus; C.ovarian weights; *P<0.05 compared with the control group圖4 卵巢、子宮大體形態(tài)及卵巢重量Fig 4 Gross appearance of ovary，uterus and ovarian weights(x±s,n=13)

A，B.ovary morphology of control group(×40，×100); C,D.model group(×40，×100); E.count of preantral follicles; F.antral follicles; G.atretic follicles(G); *P<0.05，**P<0.01 compared with the control group圖5 卵巢HE染色Fig 5 Histological changes of ovaries (x±s,n=9)

2.7 差異基因的PPI分析、關(guān)鍵基因篩選及富集分析

通過(guò)繪制DEGs的蛋白質(zhì)互作圖，根據(jù)節(jié)點(diǎn)的大小篩選出14個(gè)關(guān)鍵基因(CASR、PVALB、TH、NTRK2、GRIN1、CAMK2A、SHH、GRIN2A、LEP、GNG7、FRAS1、ALPPL2、ALPP和SLC17A7)，主要富集于酒精中毒及安非他命中毒通路(圖6D,7)。

3 討論

每年全球有多達(dá)百萬(wàn)女性罹患癌，約10%在育齡期，其中90%早期癌患者在治療后可以存活。早期癌主要實(shí)施保留生育功能手術(shù)并輔以化療。CTX為臨床常用的化療藥物，可以同時(shí)損傷靜止的原始卵泡及生長(zhǎng)期卵泡，導(dǎo)致POI甚至POF。首先，CTX可損傷原始卵泡，導(dǎo)致DNA斷裂、凋亡。其次，CTX可以損傷生長(zhǎng)卵泡的卵母細(xì)胞及支持細(xì)胞，導(dǎo)致卵泡閉鎖。第三，CTX可通過(guò)Akt信號(hào)通路使原始卵泡過(guò)度激活、耗竭。第四，CTX可損傷卵巢間質(zhì)和血管，導(dǎo)致卵泡損失[3]。目前CTX引起POI的機(jī)制仍不完全清楚，而且目前仍缺乏統(tǒng)一的CTX誘導(dǎo)大鼠POI的建模方法。

本實(shí)驗(yàn)中，中、高劑量CTX引起大鼠明顯的毒副作用、死亡率高。低劑量CTX對(duì)卵巢內(nèi)分泌功能、卵巢組織均有顯著的影響，因而采用此方案構(gòu)建大鼠POI模型是可行的。

卵巢組織的mRNA測(cè)序顯示兩組間的DEGs顯著富集于下述通路。神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路與生殖、性腺發(fā)育及排卵有關(guān)[6]。cAMP信號(hào)通路參與竇卵泡的類(lèi)固醇生成[7]。鈣信號(hào)通路對(duì)卵泡的成熟發(fā)揮重要的作用[8]。軸突導(dǎo)向通路基因的缺失可能與不孕有關(guān)[9]。通過(guò)DEGs的蛋白互作圖，篩選出14個(gè)關(guān)鍵基因。瘦素(leptin, LEP)編碼的蛋白與其受體結(jié)合，參與調(diào)節(jié)免疫和炎性反應(yīng)、血管生成、生殖等。POI患者的血清LEP水平較正常婦女明顯降低[10]。Sonic Hedgehog信號(hào)分子(sonic hedgehog signaling molecule，SHH)參與早期胚胎過(guò)程，SHH信號(hào)通路參與顆粒細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)[11]。神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(neurotrophic factors，NTs)有助于卵泡的形成和發(fā)育。神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)受體酪氨酸激酶2(neurotrophic receptor tyrosine kinase 2，Ntrk2)是NT-4/5和BDNF的高親和力受體，是卵泡組裝、生長(zhǎng)和存活所需的信號(hào)蛋白。卵母細(xì)胞特異性缺失Ntrk2會(huì)導(dǎo)致卵母細(xì)胞死亡、卵泡喪失和不育癥。缺乏Ntrk2的卵母細(xì)胞對(duì)PI3K-AKT介導(dǎo)的促性腺激素?zé)o反應(yīng)[12]。溶質(zhì)載體家族17成員7(solute carrier family 17 member 7，Slc17a7)與谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。

A.screening of DEGs; B.GO analysis; C.KEGG analysis；D.PPI network圖6 卵巢mRNA測(cè)序Fig 6 mRNA sequencing of ovaries(x±s,n=3)

谷氨酸離子受體NMDA型亞基1(glutamate ionotropic receptor NMDA type subunit 1，GRIN1)及GRIN2A屬于谷氨酸受體信號(hào)通路，谷氨酸神經(jīng)遞質(zhì)激活GRIN2A，調(diào)節(jié)GnRH神經(jīng)元中的Ca2+，引起GnRH分泌[13]。鈣調(diào)蛋白依賴(lài)性蛋白激酶Ⅱα(calcium dependent protein kinase Ⅱ alpha，CAMK2A)參與鈣信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制，作用于垂體分泌促性腺激素[14]。鈣敏感受體(calcium-sensing receptor,CaSR)是一種G蛋白偶聯(lián)受體，維持血清Ca2+穩(wěn)態(tài)，在卵泡的存活及成熟中發(fā)揮重要作用[15]。小清蛋白(parvalbumin，Pvalb)是高親和力鈣結(jié)合蛋白，表達(dá)于生長(zhǎng)卵泡的被膜細(xì)胞，在去垂體的成年大鼠中，Pvalb與產(chǎn)類(lèi)固醇激素的被膜細(xì)胞均消失，提示Pvalb參與卵巢類(lèi)固醇激素的代謝[16]。卵巢受下丘腦-垂體軸調(diào)控，機(jī)制十分復(fù)雜，高通量測(cè)序增加了POI的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)版圖，可能為POI研究發(fā)揮重要作用。

綜上所述，本研究建立了CTX誘導(dǎo)的大鼠POI模型，初步探討了CTX誘導(dǎo)的大鼠POI模型的損傷機(jī)制，為后續(xù)深入的機(jī)制研究提供了方向。

A.PPI networks of hub genes; B.GO and KEGG analysis圖7 Hub基因及其GO、KEGG分析Fig 7 Hub genes and GO and KEGG analysis