苗 方,孫佳琳,李偉男

(1.菏澤醫(yī)學(xué)?？茖W(xué)校, 山東 菏澤,274000；2.黑龍江民族職業(yè)學(xué)院，哈爾濱 150020；3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱 150040)

柴胡屬藥用植物，由于其顯著且穩(wěn)定的臨床療效，在中國和其他亞洲國家已經(jīng)使用了數(shù)千年.柴胡根、葉提取物在中藥中有著悠久的應(yīng)用歷史和重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值.柴胡中含有多種化學(xué)成分，包括皂苷、揮發(fā)油、黃酮、多糖等成分.柴胡皂苷a和d的含量也被收載進(jìn)《中國藥典》作為評(píng)價(jià)柴胡質(zhì)量的重要指標(biāo).

由于柴胡屬植物的地上部分占整個(gè)植物的一半以上，柴胡植株地上部位(花、莖、葉)的藥效成分含量低于地下部位(根)[1].目前多以柴胡根部作為藥用部位，但柴胡的質(zhì)量控制以及柴胡用藥部位仍存在爭議[2].

植物代謝研究已廣泛應(yīng)用于中藥活性成分和質(zhì)量評(píng)價(jià)研究[3].可揭示高等植物低營養(yǎng)耐性的機(jī)制，典型的例子包括低氮供應(yīng)誘導(dǎo)萵苣酚類物質(zhì)積累的研究[4]，以及氮水平對板藍(lán)根幼苗葉片的影響[3]，氮磷水平對枸杞果實(shí)產(chǎn)量和代謝組的影響[5-6].

氮(N)、磷(P)和鉀(K)被認(rèn)為是植物生長、發(fā)育和產(chǎn)量所必需的大量營養(yǎng)素，它們在植物代謝的許多方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[7].磷(P)是植物發(fā)育必不可少的營養(yǎng)物質(zhì)，與光合作用、細(xì)胞能量轉(zhuǎn)移和呼吸有關(guān).一方面，缺磷會(huì)導(dǎo)致植物通過降低三羧酸循環(huán)中有機(jī)酸的水平[8]來改變碳水化合物代謝，從而進(jìn)一步限制磷的消耗，進(jìn)而阻礙植物生長、繁殖和適應(yīng)不同環(huán)境的能力[9].另一方面，磷過?？蓳p害與淀粉[10]和其他次生代謝物(如類異戊二烯[11-12])生物合成負(fù)相關(guān)的植物性能，并降低根中硝酸鹽的同化[13].然而，作為植物生長必需養(yǎng)分，土壤中的磷主要以不溶形式存在，無法用于植物生長.植物通過復(fù)雜的生物過程(包括磷的再利用、調(diào)節(jié)其根系結(jié)構(gòu)、積累和分泌有機(jī)酸、以及創(chuàng)造植物根系與菌根真菌共生的能力)來應(yīng)對磷的缺乏[14-15].磷肥可提高土壤肥力，確保農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展[16].

柴胡的生長發(fā)育、產(chǎn)量和品質(zhì)都受到營養(yǎng)需求的數(shù)量限制，營養(yǎng)過多或過少都會(huì)抑制柴胡的生長發(fā)育.然而，野生柴胡資源逐漸匱乏，養(yǎng)殖柴胡的規(guī)模越來越大，必然涉及如何充分利用植物養(yǎng)分.目前，受不同質(zhì)量濃度P肥脅迫影響后，柴胡植株各部位中藥效成分，即柴胡皂苷含量變化的研究較少.本研究對不同質(zhì)量濃度P肥脅迫后柴胡各部位，即花、次莖、主莖和根中柴胡皂苷a、c和d的含量進(jìn)行高效液相色譜法(HPLC)測定，探究柴胡代謝產(chǎn)物柴胡皂苷隨環(huán)境脅迫影響的變化規(guī)律，為定向調(diào)控柴胡栽培技術(shù)，提高栽培柴胡藥材質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù).

1 試劑與儀器

柴胡皂苷a、c和d(純度≥98%，四川曼思特生物科技有限公司)；甲醇和濃氨水(為色譜純和分析純，哈爾濱華擎化學(xué)試劑有限公司)；南柴胡(B.scorzonerifoliumwilld.，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)鑒定).

梅特勒-托利多電子天平(廈門萊斯德科學(xué)有限公司)；YRE-2010Z旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(予華儀器供應(yīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器)；GL-16W臺(tái)式離心機(jī)(鹽城凱特實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；SB-5200D超聲波清洗機(jī)(張家港市科宇信超聲有限公司)；L-2000高效液相色譜儀和L-2200自動(dòng)進(jìn)樣器(桂林伯樂馬科技有限公司(primera scientific LLC)).

2 對照品及供試品的制備

混合對照品溶液的制備：電子天平精密稱量柴胡皂苷a、c和d對照品2.0、2.0和1.0 mg后，分別加入到10 mL容量瓶中.甲醇溶解后，并定容，作為混合對照品溶液.

供試品溶液的制備：分別將不同質(zhì)量濃度P肥脅迫后，柴胡植株的花、次莖、主莖和根的干燥樣品研碎，直至可全部通過65目篩.依照2020版《中國藥典》要求[17]，取柴胡的花、次莖、主莖和根各部位粉末約500 mg，置于具塞錐形瓶中.加入25 mL甲醇溶液(含5%(V/V)濃氨).超聲提取(溫度30 ℃，功率200 W，頻率80 kHz)0.5 h，濾過.甲醇分兩次洗滌藥渣和容器，將兩次洗滌液及濾液合并.使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓回收溶劑.甲醇將殘?jiān)鼜?fù)溶后，定容于10 mL容量瓶中.進(jìn)樣分析前，取續(xù)濾液(過45 μM微孔濾膜)作為供試品溶液.

3 柴胡皂苷分析方法的建立

3.1 柴胡皂苷檢測波長的選擇

據(jù)已報(bào)道的柴胡皂苷含量測定相關(guān)文獻(xiàn)[18]，同時(shí)確定柴胡皂苷a、c和d的最佳檢測波長為210 nm.

3.2 高效液相色譜條件

色譜柱為Diamonsil C18(4.6×250 mm，5 μm)；柱溫為25 ℃；流速為0.8 mL/min；進(jìn)樣量為10 μL.梯度洗脫條件見表1.

表1 洗脫梯度

3.3 專屬性考察

精密量取混合對照品及供試品溶液各10 μL，按色譜條件進(jìn)樣，對該測定柴胡皂苷a、c和d的HPLC法進(jìn)行專屬性考察.

圖1中可見， 供試品中的柴胡皂苷a、 c和d分離度較好， 雜質(zhì)對含量測定沒有干擾， 表明該同時(shí)測定柴胡皂苷a、 c和d含量的方法專屬性較強(qiáng).

圖1 供試品(A)與混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液(B)中柴胡皂苷a、c和d的色譜圖Figure 1 Chromatogram of saikosaponin a, c and d in test sample (A) and mixed standard solution (B)

3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

精密量取混合對照品溶液的1/2置于10 mL容量瓶中，甲醇稀釋至刻度.同法依次稀釋5次后，制得6個(gè)質(zhì)量濃度梯度的混合對照品溶液.按色譜條件測定后，以橫坐標(biāo)X和縱坐標(biāo)Y分別表示對照品溶液的質(zhì)量濃度(mg/mL)和峰面積.對混合對照品溶液中三種柴胡皂苷的測定結(jié)果各自進(jìn)行線性回歸.回歸方程及r值結(jié)果見表2.

表2 柴胡皂苷的線性回歸方程

3.5 精密度實(shí)驗(yàn)

將標(biāo)準(zhǔn)曲線中，最高質(zhì)量濃度的柴胡皂苷a、c和d的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，依照色譜條件，24 h內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄所測混合對照品中柴胡皂苷各個(gè)成分的峰面積.結(jié)果見表3.

表3 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.6 回收率實(shí)驗(yàn)

分別精密量取同一種供試品溶液2份，再精密量取最高質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液2 mL，加入到其中一份供試品溶液中.按色譜條件，兩份溶液持續(xù)進(jìn)樣5次，并記錄峰面積.通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各個(gè)成分的加樣回收率均值.結(jié)果見表4.

表4 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.7 重復(fù)性考察

按照供試品溶液制備方法，制備同一批柴胡樣品6份，按色譜條件測定，記錄各個(gè)樣品的峰面積，按三種柴胡皂苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各自含量.6份供試品溶液中含柴胡皂苷a平均量(RSD)為0.62 mg/mL(1.45%)，含柴胡皂苷c的平均量(RSD)為0.72 mg/mL(1.23%)，含柴胡皂苷d的平均量(RSD)為0.38 mg/mL(1.58%).結(jié)果表明該方法的重復(fù)性滿足同時(shí)測定含柴胡皂苷a、c和d量的要求.

4 樣品中含皂苷量的累積對比

按照色譜條件，分別記錄每次測定中柴胡皂苷三種成分的峰面積，通過線性回歸方程，計(jì)算每種樣品中含三種柴胡皂苷各自的量(mg/g).

含柴胡皂苷量測定結(jié)果見圖2，結(jié)果顯示對于不施加外界干擾的自然生長的柴胡對比組中，花中3種柴胡皂苷總量最高，且含柴胡皂苷c的量最高.而對于2020版《中國藥典》中柴胡質(zhì)量評(píng)價(jià)的主要指標(biāo)柴胡皂苷a和d，對比組中，根中含柴胡皂苷d的量遠(yuǎn)高于花、主莖和次莖部位.四個(gè)部位中含柴胡皂苷a的量都低于柴胡皂苷c和d的量.

圖2 低磷(LP)、高磷(HP)脅迫下柴胡花(F)、次莖(SS)、主莖(MS)和根(R)中含柴胡皂苷a、c、d的量與對比組兩年生(CP)柴胡中柴胡各部位中含皂苷量的累積對比圖Figure 2 Cumulative comparison of saikosaponin a, c and d contents in flowers (F), secondary stems (SS), main stems (MS) and roots (R) of Bupleurum under low phosphorus (LP) and high phosphorus (HP) stress with saikosaponin contents in various parts of Bupleurum in two-year-old (CP) Bupleurum in the control group

施加低質(zhì)量濃度的P肥(0.02 g/mL)，幾乎均提高了柴胡各部位中含柴胡皂苷a的量，但對根中柴胡皂苷c的累積負(fù)向影響較大.施加高量的P肥(0.04 g/mL)對于柴胡主莖中柴胡皂苷的積累正向影響最大，大幅提高了柴胡主莖中含柴胡皂苷a、c和d的量.但對于柴胡根中柴胡皂苷d的積累有負(fù)面調(diào)節(jié).

5 結(jié) 語

本研究建立的HPLC法同時(shí)測定柴胡各部位中含柴胡皂苷a、c和d量,分析方法準(zhǔn)確、可靠.本研究比較了柴胡在高P/低P脅迫的影響下，相較于不施加外界影響的自然生長柴胡，柴胡植株中花、次莖、主莖和根四個(gè)部位中含柴胡皂苷a、c和d的量變化情況.本研究關(guān)于柴胡生長過程中柴胡皂苷積累情況的影響規(guī)律，為定向調(diào)控柴胡栽培技術(shù)和提高柴胡藥材栽培質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù).