常建軍，文 英，李 莉

（青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，西寧 810016）

0 引言

轉(zhuǎn)移因子(Transfer Factor,TF)因其具有安全、作用迅速、效果顯著、無藥物殘留、無抗原性、無毒副作用、無種屬差異性等優(yōu)點(diǎn)，而成為學(xué)者們研究的一種理想的動(dòng)物細(xì)胞免疫增強(qiáng)劑。李相安等[1]研究發(fā)現(xiàn)，雞脾TF可顯著提高雛雞免疫器官脾臟和腔上囊的相對(duì)重量。黃建文等[2]試驗(yàn)表明，用雞傳染性喉支氣管炎滅活疫苗免疫雞的同時(shí)，肌肉注射TF，淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率升高，這表明蛋雞的細(xì)胞免疫機(jī)能增強(qiáng)。張廣英[3]報(bào)道豬TF能顯著增加受體豬的外周血T細(xì)胞比值，王建文[4]報(bào)道雞TF除對(duì)仔雞的法氏囊、脾臟等免疫器官增重作用明顯外，還具有促生長發(fā)育作用。馬志勇[5]等報(bào)道犬TF可使小鼠E玫瑰花環(huán)形成細(xì)胞顯著增加。

機(jī)體免疫系統(tǒng)中淋巴細(xì)胞增殖是機(jī)體對(duì)非己抗原刺激發(fā)生免疫應(yīng)答過程中的重要階段，淋巴細(xì)胞的增殖結(jié)果表現(xiàn)為效應(yīng)淋巴細(xì)胞的產(chǎn)生，并發(fā)揮其清除非己抗原的作用，以維持體內(nèi)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，而效應(yīng)淋巴細(xì)胞的數(shù)量，決定了機(jī)體免疫應(yīng)答的強(qiáng)度，在評(píng)價(jià)機(jī)體免疫功能方面具有重要意義[6]。現(xiàn)國內(nèi)外對(duì)動(dòng)物外周血淋巴細(xì)胞自身增殖功能的研究多見于鴨[7]、番鴨[8]、雛雞[9]、犬[10]、大鼠[11]、鱘魚[12]等動(dòng)物。針對(duì)新型免疫增強(qiáng)劑的報(bào)道多見于多糖[13-15]、中藥[16]、植物提取物[17]等制劑，而相關(guān)動(dòng)物TF的報(bào)道不多?？讘c波等[18]研究不同濃度犬、豬轉(zhuǎn)移因子對(duì)犬外周血淋巴細(xì)胞增殖的影響，發(fā)現(xiàn)同源或異源TF對(duì)犬淋巴細(xì)胞增殖均有良好的刺激效果；文英等[19]研究報(bào)道，用牦牛TF單獨(dú)或協(xié)同ConA刺激小鼠淋巴細(xì)胞后，均可提高各種細(xì)胞因子的分泌能力，但尚未見牦牛TF對(duì)藏綿羊外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能的研究報(bào)道。

本試驗(yàn)主要目的是通過研究牦牛TF對(duì)藏綿羊外周血淋巴細(xì)胞體外增殖的影響，進(jìn)而對(duì)其免疫調(diào)節(jié)作用機(jī)制進(jìn)行研究，為增強(qiáng)藏綿羊細(xì)胞免疫功能提供更為準(zhǔn)確的方法和手段。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6～8月齡健康藏綿羊12只，購于青海省大通縣某養(yǎng)殖場(chǎng)。

1.2 主要試劑

RPMI-1640培養(yǎng)基，購自宜興市賽爾生物化工廠；臺(tái)盼藍(lán)、塞唑藍(lán)(MTT)，購自北京中生瑞泰公司；二甲基亞砜(DMSO)、刀豆蛋白(ConA)、犢牛血清(FCS)，均購自北京中生瑞泰公司；淋巴細(xì)胞分離液，購自北京索萊寶科技有限公司；牦牛TF凍干粉，由實(shí)驗(yàn)室自制保存。

1.3 主要儀器設(shè)備

超凈工作臺(tái)(AC2-4S1)，購自北京五洲東方科技發(fā)展有限公司；水平離心機(jī)（LD4-2A型），購自北京醫(yī)用心機(jī)廠；CO2培養(yǎng)箱(Model TC2323)，購自CE公司；酶標(biāo)分析儀(DNM-9602)，購自北京普朗新技術(shù)有限公司。

1.4 主要培養(yǎng)基和溶液

不完全RPM I-1640培養(yǎng)液；無Ca2+、Mg2+PBS液、ConA應(yīng)用液、MTT應(yīng)用液、轉(zhuǎn)移因子應(yīng)用液、臺(tái)盼藍(lán)等。

1.5 藏綿羊淋巴細(xì)胞懸液的制備

無菌采取抗凝血，與等量無Ca2+、Mg2+PBS混勻后，疊加于等體積淋巴細(xì)胞分離液上，2000 rpm離心20 min，輕輕吸取淋巴細(xì)胞層（即中間的云霧層），用無Ca2+、Mg2+PBS洗滌3次，每次1000 rpm離心10 min，用臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，保證活細(xì)胞數(shù)在95%以上。用RPMI-1640培養(yǎng)液將淋巴細(xì)胞分別調(diào)至為1.35×106個(gè)/mL(C1)、2.70×106個(gè)/mL(C2)、5.40×106個(gè)/mL(C3)3個(gè)濃度的細(xì)胞懸液。

1.6 藏綿羊淋巴細(xì)胞體外轉(zhuǎn)化增殖最優(yōu)條件確定

設(shè)計(jì)FCS含量、淋巴細(xì)胞濃度、ConA濃度3個(gè)因素。FCS設(shè)3個(gè)水平，分別為5%、8%和10%；淋巴細(xì)胞懸液設(shè)3個(gè)濃度（見淋巴細(xì)胞懸液的制備）；ConA設(shè)3個(gè)濃度，分別為 1 μg/mL(A1)、2 μg/mL(A2)、2.5 μg/mL(A3)，在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上進(jìn)行淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化增殖試驗(yàn)。

試驗(yàn)設(shè)3個(gè)組，1個(gè)試驗(yàn)組，淋巴細(xì)胞+ConA；1個(gè)對(duì)照組，淋巴細(xì)胞；1個(gè)空白組，完全RPMI-1640 200 μL，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)孔。淋巴細(xì)胞加入量為100 μL，ConA 和 TF 加入量為 50 μL，每孔總量為200 μL，不足的用完全RPMI-1640補(bǔ)足。試驗(yàn)結(jié)果用MTT法測(cè)定[11-13]。測(cè)出OD值后，計(jì)算出刺激指數(shù)(SI,stimulate index)，選出各因素最佳值。SI的計(jì)算見公式(1)。

1.7 牦牛TF對(duì)藏綿羊淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化增殖的影響

1.7.1 體外培養(yǎng)淋巴細(xì)胞中加入牦牛TF在最優(yōu)條件下設(shè)3個(gè)TF濃度，分別為0.5 mg/mL(T1)、1.5 mg/mL(T2)、2.5 mg/mL(T3)，尋求牦牛TF的最佳刺激量。試驗(yàn)共設(shè)4個(gè)組，淋巴細(xì)胞+ConA+TF組、淋巴細(xì)+TF組；淋巴細(xì)胞+ConA組、淋巴細(xì)胞組，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)孔。方法同2.2。

1.7.2 牦牛TF體內(nèi)注射 皮下注射牦牛TF，分1 mL、2 mL、3 mL 3個(gè)劑量組，對(duì)照組注射生理鹽水，3只/組，連續(xù)注射3天，并在注射后第3、5、7天采血并分離淋巴細(xì)胞進(jìn)轉(zhuǎn)化增殖試驗(yàn)，方法同體外試驗(yàn)。注射所用TF濃度為體外試驗(yàn)確定的最佳刺激濃度。

1.8 統(tǒng)計(jì)結(jié)果

用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果

2.1 藏綿羊淋巴細(xì)胞體外轉(zhuǎn)化增殖最佳濃度確定

試驗(yàn)用含5%、8%及10%FCS的完全RPMI-1640，在相同濃度FCS的條件下，確定最佳淋巴細(xì)胞及ConA濃度。按FCS濃度統(tǒng)計(jì)SI值，結(jié)果見表1～3。結(jié)果表明，當(dāng)FCS濃度為8%，淋巴細(xì)胞濃度為5.40×106個(gè)/mL，ConA濃度為1 μg/mL時(shí)促進(jìn)藏綿羊淋巴細(xì)胞增殖的效果顯著優(yōu)于其他2個(gè)濃度組(P＜0.05)。

表1 5%FCS對(duì)羊淋巴細(xì)胞增殖影響的測(cè)定

表2 8%FCS對(duì)羊淋巴細(xì)胞增殖影響的測(cè)定

表3 10%FCS對(duì)羊淋巴細(xì)胞增殖影響的測(cè)定

2.2 牦牛TF對(duì)藏綿羊淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化增殖的影響

2.2.1 體外培養(yǎng)細(xì)胞中加入牦牛TF結(jié)果顯示，在0.5～2.5 mg/mL濃度范圍內(nèi)，TF單獨(dú)或協(xié)同絲裂原均可刺激藏綿羊外周血淋巴細(xì)胞的增殖，且濃度為1.5 mg/mL時(shí)，對(duì)淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化增殖的效果明顯，差異顯著(P＜0.05)。結(jié)果見表4。

表4 不同濃度TF協(xié)同絲裂原對(duì)羊淋巴細(xì)胞增殖的影響

2.2.2 牦牛TF體內(nèi)注射 結(jié)果顯示，各劑量組在注射TF第3天時(shí)，淋巴細(xì)胞再次受到TF單獨(dú)或協(xié)同ConA刺激時(shí)，其增殖效果與細(xì)胞組單獨(dú)增殖效果比較，差異不顯著(P＞0.05)，至第5～7天時(shí)，淋巴細(xì)胞再次受到TF單獨(dú)或協(xié)同ConA刺激時(shí)，淋巴細(xì)胞增殖效果明顯高于細(xì)胞組，差異顯著(P＜0.05)。注射2 mL劑量組其轉(zhuǎn)化增殖效果優(yōu)于1 mL劑量組和3 mL劑量組，差異顯著(P＜0.05)。測(cè)定結(jié)果見表5～7。

表5 注射1 mL TF對(duì)羊淋巴細(xì)胞增殖的影響

表6 注射2 mL TF對(duì)羊淋巴細(xì)胞增殖的影響

表7 注射3 mL TF對(duì)羊淋巴細(xì)胞增殖的影響

3 討論

3.1 MTT法確定羊外周血淋巴細(xì)胞增殖條件

淋巴細(xì)胞增殖反映的是機(jī)體免疫應(yīng)答的過程，增殖效果越好，說明機(jī)體的免疫狀態(tài)越好。一般淋巴細(xì)胞的增殖能力就是通過測(cè)定淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化增殖指數(shù)來說明。淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)方法有形態(tài)學(xué)檢查法、同位素標(biāo)記物摻入轉(zhuǎn)化法(3H-TdR摻入轉(zhuǎn)化法)、MTT法等。MTT法具有快速、簡便、準(zhǔn)確、靈敏等優(yōu)點(diǎn)，可用于分析體外培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞受特異性刺激時(shí)增殖能力的變化情況從而反映出機(jī)體細(xì)胞免疫功能的狀態(tài)[20-22]。故本試驗(yàn)選擇MTT法。但由于MTT法的高靈敏度，也決定其在試驗(yàn)中會(huì)受到很多因素的影響，所以要嚴(yán)格把握試驗(yàn)條件[23]。淋巴細(xì)胞存活率和濃度是影響MTT法的主要因素[24]，當(dāng)培養(yǎng)條件如血清、培養(yǎng)液、MTT等不能滿足增殖需要時(shí)細(xì)胞間將會(huì)相互拮抗；相反，過少或存活力較低的細(xì)胞會(huì)因死亡和沉積，影響其他活細(xì)胞的增殖和干擾比色，因此試驗(yàn)應(yīng)嚴(yán)格控制細(xì)胞密度，以保證細(xì)胞的存活率在95%以上。其次,要控制血清濃度，血清濃度不足時(shí)細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)性代謝抑制；而過量的血清與細(xì)胞碎片混合會(huì)出現(xiàn)渾濁。再者，在評(píng)價(jià)淋巴細(xì)胞免疫功能時(shí)，培養(yǎng)時(shí)間不宜過長，因細(xì)胞存活力、增殖力等與其也有直接關(guān)系。因此對(duì)這些因素進(jìn)行摸索并找出其在淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化增殖試驗(yàn)中的最佳值，可保證試驗(yàn)結(jié)果充分反映機(jī)體的細(xì)胞免疫狀態(tài)。

本次試驗(yàn)摸索出最佳條件為，F(xiàn)CS濃度為8%，淋巴細(xì)胞濃度為5×106個(gè)/mL，ConA濃度為1μg/mL，此時(shí)所得到的SI值結(jié)果最理想，促進(jìn)藏綿羊淋巴細(xì)胞增殖的效果優(yōu)于其他2個(gè)濃度組，差異顯著(P＜0.05)。試驗(yàn)確定的ConA濃度(1 μg/mL)與孔慶波[25]所用ConA濃度(2.5 μg/mL)及金擴(kuò)世等[26]所用ConA濃度(20 μg/mL)有一定差別，是否與使用的產(chǎn)品和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物不同有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。

3.2 牦牛TF對(duì)藏綿羊淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化增殖的影響

細(xì)胞免疫主要通過T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)，而TF具有活化T淋巴細(xì)胞，刺激并促進(jìn)干擾素和白細(xì)胞介素產(chǎn)生，進(jìn)而活化巨噬細(xì)胞的效應(yīng)[27-28]。吳德華等[29]在犬口服或注射TF后用酯酶染色法檢測(cè)了犬外周血T細(xì)胞比值變化，檢測(cè)結(jié)果表明犬T細(xì)胞數(shù)量明顯升高。何孟蓮等[30]研究了不同動(dòng)物來源TF對(duì)肉仔雞T細(xì)胞免疫功能及免疫器官指數(shù)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同來源的TF對(duì)T細(xì)胞轉(zhuǎn)化增殖作用顯著，促免疫器官生長發(fā)育作用也顯著，TF通過促T細(xì)胞轉(zhuǎn)化增殖作用和促免疫器官生長發(fā)育，可顯著提高肉仔雞免疫功能。文英等[19]研究報(bào)道，用牦牛TF刺激小鼠淋巴細(xì)胞后，IL-12、IL-1、IL-4、IFN-γ等細(xì)胞因子的分泌能力均有提高。除了增強(qiáng)細(xì)胞免疫外，羅俊崇等[31]也報(bào)道羊胎盤轉(zhuǎn)移因子能夠在一定時(shí)間內(nèi)提高仔豬血清中IgM和IgG的含量，對(duì)仔豬的體液免疫能力有增強(qiáng)作用。全炳昭等[32]發(fā)現(xiàn)犬TF能夠犬淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率，且TF促進(jìn)犬淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化效應(yīng)的大小與TF濃度密切相關(guān)。濃度高或低時(shí)，均可影響淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。

試驗(yàn)結(jié)果顯示，牦牛TF在0.5～2.5 mg/mL濃度范圍內(nèi)，牦牛TF單獨(dú)或協(xié)同絲裂原均可刺激藏綿羊外周血淋巴細(xì)胞的增殖，且濃度為1.5 mg/mL時(shí)，對(duì)淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化增殖的效果明顯。各劑量組體內(nèi)注射牦牛TF后，在7天內(nèi)淋巴細(xì)胞再次受到TF單獨(dú)或協(xié)同ConA刺激時(shí)其增殖能力呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，與孔慶波[33]“注射豬TF的犬淋巴細(xì)胞增值能力早期（4～6天）呈下降趨勢(shì)，6天后受到抑制”的結(jié)果不同，這或與TF種類不同有關(guān)。牦牛TF對(duì)藏綿羊而言屬于非特異性免疫增強(qiáng)劑，能夠促進(jìn)藏綿羊非特異性淋巴細(xì)胞的增殖，從而改善藏綿羊的非特異性細(xì)胞免疫功能。藏綿羊注射異種TF后，在一定時(shí)間內(nèi)，淋巴細(xì)胞增殖能力呈增強(qiáng)的特點(diǎn)，體現(xiàn)了免疫增強(qiáng)劑的本質(zhì)，這為非特異性TF在藏綿羊疾病防治的臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。至于牦牛TF作用于藏綿羊外周血淋巴細(xì)胞時(shí)其增殖能力何時(shí)下降或受到抑制，有待進(jìn)一步研究。不同劑量組間比較發(fā)現(xiàn)，注射2 mL劑量組其轉(zhuǎn)化增殖效果優(yōu)于注射1 mL組和3 mL組，差異顯著(P＜0.05)。此結(jié)果可為臨床治療提供一定的理論依據(jù)。

4 結(jié)論

從試驗(yàn)結(jié)果可知，當(dāng)FCS濃度為8%、藏綿羊淋巴細(xì)胞濃度為5×106個(gè)/mL、ConA濃度為1 μg/mL時(shí)，所得SI值結(jié)果最理想，即藏綿羊淋巴細(xì)胞的增殖效果最佳，因此該條件可做為MTT法檢測(cè)藏綿羊外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的最佳條件，可用于實(shí)踐中對(duì)藏綿羊免疫功能的檢查。

在0.5～2.5 mg/mL濃度范圍內(nèi)，牦牛TF單獨(dú)或協(xié)同絲裂原均可刺激藏綿羊外周血淋巴細(xì)胞的增殖，且濃度為1.5 mg/mL時(shí)，對(duì)淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化增殖的效果明顯，差異顯著(P＜0.05)。各劑量組體內(nèi)注射牦牛TF后，在7天內(nèi)淋巴細(xì)胞再次受到TF單獨(dú)或協(xié)同ConA刺激時(shí)其增殖能力呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，不同劑量組間比較發(fā)現(xiàn)，注射2 mL劑量組其轉(zhuǎn)化增殖效果優(yōu)于注射1 mL組和3 mL組，差異顯著(P＜0.05)。說明牦牛TF能較好的增強(qiáng)機(jī)體免疫功能。