付 筱，宋瑤瑤，陳 紅，徐全樂*

(1 河南省濟源市林業(yè)工作站，河南濟源 459000；2 西北農(nóng)林科技大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西楊陵 712100)

山黧豆(LathyrussativusL.)富含蛋白、具有優(yōu)良而廣譜的抗逆性[1-2]，是中國定西等西部干旱、半干旱地區(qū)的重要農(nóng)作物選擇[3]，也是對抗亞太地區(qū)等存在的“隱性饑餓”、豐富農(nóng)作物系統(tǒng)等的優(yōu)良種質(zhì)資源[4]。然而，山黧豆的過量攝入會導(dǎo)致抗?fàn)I養(yǎng)因子β-N-草酰-L-α,β-二氨基丙酸(β-N-oxalyl-L-α,β-diaminopropionic acid，β-ODAP)通過α-氨基-3羥基-5甲基-4異惡唑丙酸(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionate，AMPA)型谷氨酸受體作用于大腦皮層神經(jīng)系統(tǒng)，造成人畜運動神經(jīng)元損傷性疾病[5]。該病多見于以山黧豆為主要食物來源超過3～4個月，被稱為神經(jīng)性山黧豆中毒[1,6]。孟加拉(1980s)、印度(1980s)、埃塞俄比亞(1980s、1990s)和中國甘肅(1970s)等均曾發(fā)生過大規(guī)模的山黧豆中毒事件[3]。在國內(nèi)外山黧豆科研工作者的不懈努力下，低毒山黧豆品種培育已成為利用鄉(xiāng)土植物資源的成功范例[7]。

除了β-ODAP的生物合成調(diào)控與毒理學(xué)研究之外，蛋白酶抑制劑等其他類型抗?fàn)I養(yǎng)因子的調(diào)控機理研究也是山黧豆品質(zhì)改良和遺傳育種研究的主要方面[8]。而且，在將山黧豆作為動物飼料時，蛋白酶抑制劑等的負(fù)面影響遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于β-ODAP[9]。在山黧豆中，蛋白酶抑制劑KTi(Kunitz trypsin inhibitor)和BBi(Bowman-Birk inhibitor)均已被分離和鑒定[10-11]，且氨基酸序列與其他豆科作物的KTi和BBi序列高度保守[12-13]。Xu等[13]檢測了51種山黧豆的KTi和BBi活性表明，山黧豆KTi具有胰蛋白酶抑制劑活性(trypsin inhibitor activity，TIA)，BBi同時具有TIA和胰凝乳蛋白酶抑制劑活性(chymotrypsin inhibitor activity，CIA)；并從中篩選到了一個巴西山黧豆品種具有較低的KTi和BBi活性，為進一步的品種選育奠定了基礎(chǔ)。

KTi中的Cys含量較低，但山黧豆BBi僅110個氨基酸的序列中含有14個Cys殘基，可以做為胞內(nèi)硫的儲存形式[13-14]。由于β-ODAP的生物合成與Cys代謝、硫代謝等密切相關(guān)[8, 15-16]，并和Cys的合成競爭共同底物O-乙酰絲氨酸[16]，半胱氨酸合成酶作用導(dǎo)致的O-乙酰絲氨酸消耗和Cys積累可能限制β-ODAP的合成，并促進BBi等含硫氨基酸豐富的下游產(chǎn)物積累。實際上，半胱氨酸合成酶基因在大豆中的過表達確實引起了BBi積累水平的增加[17]。這為研究β-ODAP與KTi、BBi生物合成，硫代謝平衡之間的關(guān)系及調(diào)控，對山黧豆的品質(zhì)改良研究及進一步篩選低抗?fàn)I養(yǎng)因子種質(zhì)提供了重要依據(jù)。本研究分析了家山黧豆(L.sativus)、扁莢山黧豆(L.cicera)等6種山黧豆種子的TIA和CIA，β-ODAP含量及相關(guān)酶活等，通過相關(guān)性分析等解析了山黧豆抗?fàn)I養(yǎng)因子β-ODAP與KTi、BBi活性之間的關(guān)系，為山黧豆品質(zhì)形成調(diào)控機制研究、種質(zhì)資源深度評價以及優(yōu)良品系的篩選奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材 料

家山黧豆(LathyrussativusL.)、扁莢山黧豆(L.ciceraL.)、阿富汗山黧豆、保加利亞山黧豆、埃塞俄比亞山黧豆、土耳其山黧豆種子由西北農(nóng)林科技大學(xué)山黧豆課題組保存并提供，按順序分別編號為1～6。

1.2 方 法

1.2.1 不同山黧豆種子蛋白的SDS-PAGE分析取不同山黧豆種子干粉15 mg，用1 mL 1×TBS緩沖液在室溫下浸提15 min。6 000 r/min離心10 min后取上清200 μL，添加200 μL 2×SDS緩沖液和3% β-巰基乙醇煮沸5 min，利用12.5% SDS-PAGE進行可溶性蛋白分析。

取不同山黧豆種子干粉50 mg，用800 μL 30%乙醇室溫下浸提30 min。6 000 r/min離心10 min后取上清500 μL，加3倍體積丙酮在-20 ℃過液沉淀。14 000 r/min離心10 min后，取沉淀加200 μL 1×SDS 緩沖液和3% β-巰基乙醇，煮沸5 min后利用12.5% SDS-PAGE進行醇溶蛋白分析。

1.2.2 胰蛋白酶抑制劑和胰凝乳蛋白酶抑制劑活性檢測參考Xu等[13]方法進行胰蛋白酶抑制劑和胰凝乳蛋白酶抑制劑活性檢測。稱50 mg山黧豆種子粉末，用1 mL Tris-HCl(50 mmol/L，pH8.0)在室溫下提取10 min；15 000×g離心10 min后取上清備用，利用考馬斯亮藍法檢測蛋白含量[18]。

胰蛋白酶抑制劑活性檢測反應(yīng)體系包含50 mmol/L Tris-HCl(含20 mmol/L CaCl2-2H2O)940 μL，胰蛋白酶(1 mg/mL)和種子提取液各20 μL。將反應(yīng)體系置于37 ℃水浴15 min后添加1 mmol/L的N-苯甲?；?DL-精氨酰對硝基苯胺鹽酸鹽(α-N-benzoyl-DL-arginine-p-nitroanilide hydrochloride，BAPNA)20 μL繼續(xù)反應(yīng)10 min，用500 μL 30%乙酸終止反應(yīng)，在410 nm下檢測吸光度值。

胰凝乳蛋白酶抑制劑活性檢測反應(yīng)體系包含50 mmol/L Tris-HCl(含20 mmol/L CaCl2-2H2O)890 μL，胰凝乳蛋白酶(2 mg/mL)40 μL，種子提取液 50 μL。反應(yīng)體系置于37 ℃水浴15 min后再添加1 mmol/L戊二酰-L-苯丙氨酰-對硝基苯胺(N-glutaryl-L-phenylalanine-4-nitroanilide，GLUPHEPA)20 μL繼續(xù)反應(yīng)45 min，用500 μL 30% 乙酸終止反應(yīng)，在410 nm下檢測吸光度值。

胰蛋白酶抑制劑活性和胰凝乳蛋白酶抑制劑活性用每毫克蛋白的抑制劑單位(inhibitor units，IU)表示，分別表示為TIU和CIU。抑制劑單位定義為吸光度值減小的100倍。抑制劑活性表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，利用SPSS 16.0軟件中的LSD法進行差異顯著性分析。

1.2.3 β-ODAP含量分析參考Jiao等[19]方法進行β-ODAP含量分析。分別取山黧豆種子0.5 g，用5 mL NaHCO3(0.5 mol/L，pH 9.0)充分研磨。12 000 r/min、4 ℃離心后，取上清100 μL，加等體積2,4-二硝基氟苯于65 ℃衍生化30 min。室溫冷卻后加入800 μL磷酸緩沖液(1/15 mol/L，pH 6.89)，于12 000 r/min離心5 min。取上清經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，利用Waters Alliance全自動高效液相色譜儀(Symmetry C18色譜柱)進行β-ODAP含量檢測。檢測柱溫40 ℃，流速1 mL/min，檢測波長360 nm，流動相為17%乙腈。以β-ODAP標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma)系列濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 絲氨酸乙?；D(zhuǎn)移酶和β-腈基丙氨酸合成酶活性檢測參考Song等[20]方法進行絲氨酸乙?；D(zhuǎn)移酶(serine acetyltransferase，SAT)和β-腈基丙氨酸合成酶(β-cyanoalanine synthase，CAS)活性檢測。

SAT活性檢測反應(yīng)體系包含50 mmol/L Tris-HCl，5 mmol/L MgCl2，0.4 mmol/L乙酰輔酶A，2 mmol/L絲氨酸，0.1 mL酶液。反應(yīng)體系置于37 ℃反應(yīng)20 min后，用50 μL的6 mol/L鹽酸胍終止反應(yīng)。利用5,5′-二硫雙硝基苯甲酸(50 μL)顯色10 min后于412 nm處檢測吸光值。以系列已知濃度的輔酶A為標(biāo)準(zhǔn)曲線。酶活力單位(U)定義為：37 ℃下，每毫克蛋白在上述反應(yīng)條件下每分鐘催化反應(yīng)生成CoA的含量。

CAS活性檢測反應(yīng)體系包含70 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L Cys，0.75 mmol/L KCN，0.1 mL酶液。反應(yīng)體系置于30 ℃反應(yīng)30 min，繼續(xù)加入甲基蘭前體染色液Ⅰ和Ⅱ各0.2 mL反應(yīng)20 min，并于665 nm處檢測吸光值。以系列已知濃度梯度的Na2S為標(biāo)準(zhǔn)曲線。酶活力單位(U)定義為：30 ℃下，每毫克蛋白在上述反應(yīng)條件下每分鐘催化反應(yīng)生成S2-的含量。

1.2.5 本地轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中幾種抗?fàn)I養(yǎng)因子相關(guān)基因表達水平的相關(guān)性分析從本實驗室前期所測的家山黧豆不同組織[播種后2 d(days after sowing，DAS)種子、6 DAS幼苗、25 DAS葉片]的轉(zhuǎn)錄組分析數(shù)據(jù)庫(SRP145030)[21]中獲得山黧豆抗?fàn)I養(yǎng)因子KTi、BBi基因及β-ODAP合成關(guān)鍵基因SAT和CAS表達量，利用SPSS 16.0計算各基因表達水平的皮爾遜相關(guān)系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 6個山黧豆品種的種子蛋白特征

6個山黧豆品種的種子在色澤、大小等方面表現(xiàn)出顯著的形態(tài)差異(圖1)。其中，家山黧豆和保加利亞山黧豆的種子呈白灰色，其余種子呈褐色；在種子大小方面，以扁莢山黧豆的種子最小，其余山黧豆品種的種子大小相當(dāng)。考馬斯亮藍G250染色法檢測顯示，6種山黧豆種子(1～6號)的可溶性蛋白含量依次為23.04%、22.76%、19.16%、28.46%、30.93%和23.52%。

為了研究不同山黧豆種子的蛋白質(zhì)組成差異，分別進行了醇溶蛋白和可溶性蛋白的提取及SDS-PAGE分析。在30%乙醇提取的蛋白組分中，表觀分子量為14～18 kD的蛋白豐度最高，其次為110、50、42和30 kD蛋白(圖2，A)。在不同的山黧豆品種之間，42 kD蛋白廣泛存在，但醇溶蛋白的豐度和大小也呈現(xiàn)明顯的差異。例如扁莢山黧豆種子蛋白在50、30 kD與家山黧豆呈現(xiàn)顯著差異，保加利亞山黧豆在50 kD呈現(xiàn)特征條帶(圖2，A)。

對可溶性蛋白組分的SDS-PAGE分析顯示，表觀分子量在35～66 kD之間以及20 kD的蛋白豐度較高(圖2，B)。其中，山黧豆47 kD蛋白β-lathyrin廣泛存在于6個山黧豆品種中，在扁莢山黧豆的積累水平明顯較高，在其余山黧豆品種中的表達量基本一致(圖2，B)。此外，扁莢山黧豆缺乏42和56 kD蛋白等，且在25 kD處具有特征條帶(圖2，B)。這些結(jié)果表明，山黧豆種子蛋白的SDS-PAGE分析可能是作為山黧豆不同品種遺傳多樣性研究的有效方法。

2.2 6種山黧豆種子的蛋白酶抑制劑活性特征

為了分析不同山黧豆種子中的蛋白酶抑制劑活性差異，利用Tris-HCl緩沖液提取物檢測了胰蛋白酶抑制劑和胰凝乳蛋白酶抑制劑活性。結(jié)果表明，不同山黧豆種子的胰蛋白酶抑制劑活性介于100～190 TIU之間(圖3，A)，胰凝乳蛋白酶抑制劑活性介于5～9 CIU之間(圖3，B)。說明山黧豆中的蛋白酶抑制劑以胰蛋白酶抑制劑為主。

此外，家山黧豆、土耳其山黧豆表現(xiàn)出較高的胰蛋白酶抑制劑活性，扁莢山黧豆、阿富汗山黧豆和埃塞俄比亞山黧豆表現(xiàn)出較低的胰蛋白酶抑制劑活性(圖3，A)。家山黧豆、保加利亞山黧豆表現(xiàn)出較低的胰凝乳蛋白酶抑制劑活性，土耳其山黧豆表現(xiàn)出較高的胰凝乳蛋白酶抑制劑活性(圖3，B)。

2.3 6種山黧豆種子的β-ODAP含量分析及相關(guān)酶活性檢測

利用HPLC分析表明，扁莢山黧豆的β-ODAP含量最低，其次為家山黧豆；土耳其山黧豆的β-ODAP含量最高(圖4)。進一步檢測β-ODAP生物合成關(guān)鍵酶活性表明，家山黧豆具有較高的CAS和SAT活性；其他山黧豆的CAS活性基本相當(dāng)，沒有顯著差異。令人感興趣的是β-ODAP含量最高的土耳其山黧豆也具有最高的SAT活性，β-ODAP含量最低的扁莢山黧豆具有最低的SAT活性(圖4)。這暗示了SAT活性與β-ODAP含量之間的相關(guān)性。6種山黧豆SAT活性與β-ODAP含量的相關(guān)性分析表明，二者呈弱相關(guān)(r=0.29)。但是在除去家山黧豆之后，SAT活性與β-ODAP含量之間的相關(guān)系數(shù)增加到0.76，呈顯著正相關(guān)。這可能是由于家山黧豆SAT主要分布于細(xì)胞質(zhì)，參與Cys而不是β-ODAP的生物合成，導(dǎo)致家山黧豆在表現(xiàn)為較高的總SAT活性情況下，具有較低的β-ODAP含量。

聚類分析顯示，家山黧豆和扁莢山黧豆聚在一支，阿富汗山黧豆和埃塞俄比亞山黧豆聚在一支，與土耳其山黧豆的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.4 山黧豆蛋白酶抑制劑和β-ODAP合成關(guān)鍵基因的相關(guān)性分析

KTi和BBi是山黧豆中的2種重要的蛋白酶抑制劑。在山黧豆種子萌發(fā)期不同組織的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析數(shù)據(jù)庫(SRP145030)中比對到2條KTi基因(KTi1、KTi2)、1條BBi基因(BBi1)，以及β-ODAP合成關(guān)鍵基因SAT基因(SAT1、SAT2、SAT3)3條、CAS基因1條。這些基因在山黧豆種子萌發(fā)過程中均有表達(圖5，A)。皮爾遜相關(guān)性分析表明：KTi2與BBi1基因的表達水平具有強正相關(guān)性(r=0.97)；KTi1與SAT1、SAT2基因的表達水平具有強負(fù)相關(guān)性(KTi1-SAT1：r=-0.99；KTi1-SAT2：r=-0.99)，KTi2、BBi1與SAT3基因的表達水平具有強負(fù)相關(guān)性(KTi2-SAT3：r=-0.90；BBi1-SAT3：r=-0.97)；SAT1、SAT2與CAS基因的表達水平具有強負(fù)相關(guān)性(SAT1-CAS：r=-0.89；SAT2-CAS：r=-0.89)。

3 討 論

通過種質(zhì)資源評價與篩選，獲得具有較高含硫氨基酸含量、較低β-ODAP含量與蛋白酶抑制劑活性品種是山黧豆品質(zhì)相關(guān)基礎(chǔ)研究的重要方面[3,8]。研究表明，β-ODAP的生物合成途徑和Cys代謝、硫代謝等基礎(chǔ)代謝途徑密切相關(guān)[8, 15-16]，可通過沉默或敲除β-ODAP生物合成關(guān)鍵酶基因，在降低β-ODAP含量的同時提升Cys等含硫氨基酸含量，進而改善山黧豆?fàn)I養(yǎng)品質(zhì)[8, 22-23]。Xu等[13]對來自阿富汗、埃塞俄比亞、巴西、印度等全球24個國家的51個山黧豆不同品種進行了TIA和CIA活性檢測，從中篩選到了一個巴西山黧豆品種具有較低的KTi和BBi活性，為進一步的品種選育奠定了基礎(chǔ)。然而，大部分相關(guān)研究僅聚焦于β-ODAP代謝或蛋白酶抑制劑活性等。因此，針對抗?fàn)I養(yǎng)因子β-ODAP與蛋白酶抑制劑活性、硫代謝平衡之間的關(guān)系及調(diào)控研究將對山黧豆品質(zhì)的全面改良研究及進一步篩選低抗?fàn)I養(yǎng)因子種質(zhì)提供重要依據(jù)。

通常，山黧豆種質(zhì)資源評價與篩選采用形態(tài)、產(chǎn)量、品質(zhì)等性狀指標(biāo)[24-27]。擴增片段長度多態(tài)性(AFLPs)、隨機擴增多態(tài)性DNA(RAPD)和限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)、單核苷酸多態(tài)性(SNP)等分子標(biāo)記手段也被用于山黧豆屬內(nèi)的遺傳變異研究[28]。此外，Przybylska等[29-30]利用SDS-PAGE分析了種子清蛋白和球蛋白的種內(nèi)變異情況，Yunus等[31]利用淀粉凝膠電泳檢測了6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶、蘋果酸脫氫酶、過氧化物酶等6種酶在52個山黧豆品種中的多態(tài)性。本研究通過對山黧豆醇溶蛋白和可溶蛋白電泳條帶特征的分析進一步證實，SDS-PAGE是山黧豆品種遺傳多樣性研究的重要手段[13]。而且，47 kD過敏原蛋白[32]等已鑒定的山黧豆品質(zhì)相關(guān)蛋白質(zhì)條帶的分布特征，可能作為山黧豆種質(zhì)資源鑒定與深度評價的重要方法。

山黧豆的TIA活性低于大豆，但高于其他食用豆[33-35]。本研究結(jié)果表明，山黧豆的胰蛋白酶活性介于100～190 TIU、胰凝乳蛋白酶活性介于5～9 CIU，與Xu等[13]報道基本相符。β-ODAP合成關(guān)鍵酶活檢測表明，SAT與β-ODAP含量呈顯著正相關(guān)，是β-ODAP生物合成的限速酶[20]。進一步利用本地轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析β-ODAP生物合成關(guān)鍵基因與蛋白酶抑制劑相關(guān)基因表達量關(guān)系表明，二者呈顯著負(fù)相關(guān)。但是，β-ODAP含量和蛋白酶抑制劑活性的相關(guān)性較小(β-ODAP-KTi：r=0.09；β-ODAP-BBi：r=0.31)，這可能是在β-ODAP含量和蛋白酶抑制劑活性調(diào)控及平衡中存在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控方式。例如，SAT與CAS形成半胱氨酸合成酶復(fù)合物調(diào)控二者酶活是β-ODAP生物合成調(diào)控的典型特征[20]，磷酸化修飾也會影響SAT酶活[36]。在山黧豆中，β-ODAP和Cys的生物合成需要競爭O-乙酰絲氨酸[16]。在半胱氨酸合成酶基因作用下，O-乙酰絲氨酸的利用和Cys積累對于SAT的反饋抑制限制了β-ODAP的合成[3, 20]，并可能促進BBi等含硫氨基酸豐富的下游產(chǎn)物積累。因此，在轉(zhuǎn)錄水平阻斷β-ODAP和BBi生物合成的同時，有望改善山黧豆的含硫氨基酸水平，全面提升山黧豆?fàn)I養(yǎng)品質(zhì)。

綜上所述，本研究利用SDS-PAGE、酶活檢測和相關(guān)性分析等方法對家山黧豆、扁莢山黧豆等6個山黧豆品種的蛋白酶抑制劑活性、β-ODAP含量及二者之間的關(guān)系進行了分析，結(jié)果表明β-ODAP與BBi生物合成之間呈顯著負(fù)相關(guān)。這為進一步研究山黧豆中β-ODAP和BBi生物合成調(diào)控，改善山黧豆的含硫氨基酸水平等奠定了基礎(chǔ)。