喬緒強(qiáng)，郭婷婷，楊炳松，李建召，梁美霞

（魯東大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264025）

0 引言

中國(guó)是蘋果生產(chǎn)和銷售大國(guó)，2018年中國(guó)蘋果種植面積和產(chǎn)量均居世界首位[1]。蘋果在長(zhǎng)期的營(yíng)養(yǎng)繁殖過程中，普遍受病毒侵染。采用蘋果莖尖進(jìn)行離體快繁和脫毒已獲得成功[2-5]。近年來，通過基因工程進(jìn)行蘋果品種改良成為國(guó)內(nèi)外育種專家共同關(guān)注的重要話題[6-9]。蘋果莖尖離體培養(yǎng)可以保持高的遺傳穩(wěn)定性[7]，基因工程可以明顯縮短蘋果的育種周期，但離體培養(yǎng)獲得的脫毒或轉(zhuǎn)基因植株在移栽過程中成活率很低，這嚴(yán)重制約了蘋果脫毒苗產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)和基因工程進(jìn)行遺傳改良的應(yīng)用。在馴化移栽過程中，一品紅、葡萄、咖啡、槐樹和無花果等植物葉片解剖結(jié)構(gòu)或表皮特征變化已有報(bào)道[10-16]，而有關(guān)組培苗根莖的相應(yīng)變化未見報(bào)道。筆者以‘嘎啦’蘋果組培苗為試材，研究其移栽過程中根莖葉的微觀形態(tài)變化，試圖從微觀形態(tài)上揭示組培苗移栽過程中死亡的原因，以便為今后的組培苗移栽提供一定的理論依據(jù)和技術(shù)支持，提高蘋果組培苗的移栽成活率。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間、地點(diǎn)

研究田間試驗(yàn)于2016年在魯東大學(xué)農(nóng)學(xué)院農(nóng)林遺傳改良中心試驗(yàn)田進(jìn)行，室內(nèi)試驗(yàn)在農(nóng)學(xué)院農(nóng)林遺傳改良中心實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)材料

蘋果品種為‘嘎拉’。

1.3 試驗(yàn)方法

4月中旬—5月中旬取‘嘎拉’蘋果剛萌動(dòng)的新梢，剝?nèi)∏o尖，用75%的酒精消毒30 s后，再用0.1%的升汞消毒3～4 min，然后用無菌水沖洗干凈，接種于MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+30 g/L蔗糖+8 g/L瓊脂的培養(yǎng)基上。培養(yǎng)條件為每天光照16 h，光照強(qiáng)度2000 lx，培養(yǎng)溫度為(26±2)℃。生根培養(yǎng)基為MS+NAA 0.2 mg/L。培養(yǎng)6周后，獲得‘嘎啦’蘋果的再生植株。當(dāng)再生植株高達(dá)10 cm左右時(shí)，在培養(yǎng)室打開封口膜進(jìn)行煉苗，然后取出小苗，洗去根部殘存培養(yǎng)基，移栽到蛭石、珍珠巖和草炭土混合體積比為3:3:4的營(yíng)養(yǎng)缽中。

馴化移栽過程中蘋果組培苗根莖葉的取樣時(shí)期，‘嘎啦’蘋果組培苗移栽初期即0周（蘋果組培苗由培養(yǎng)瓶中移到營(yíng)養(yǎng)缽之時(shí)），移栽后1、2和3周。選取靠近根莖連接處并且生長(zhǎng)粗壯的根，在根的中間部位切取0.5 cm大小的根段。位于莖中部切取0.5 cm長(zhǎng)的莖段。從組培苗頂端向下取第4片葉片，在葉中部靠近主脈處剪取0.5 cm×0.5 cm葉塊。蘋果組培苗根莖葉分別取樣后，用FAA固定液固定，常規(guī)制作石蠟切片。切片厚度為8 μm，番紅-固綠二重染色，中性膠封片。在Nikon顯微鏡下觀察各樣品解剖結(jié)構(gòu)并拍照。切取葉塊后立即放入2%戊二醛中，固定24 h，乙醇梯度脫水，臨界點(diǎn)干燥后置于觀察臺(tái)上金屬鍍膜，在KYKY-2800B掃描電鏡下觀察和拍照。

1.4 精密儀器和藥品規(guī)格

KYKY-2800B掃描電鏡，Nikon顯微鏡，MS培養(yǎng)基，NAA，6-BA，F(xiàn)AA固定液，2%戊二醛。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

原始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化或歸一化處理，采用Microsoft Excel 2010處理數(shù)據(jù)，用SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘋果組培苗馴化移栽過程中根解剖結(jié)構(gòu)的變化

‘嘎啦’蘋果組培苗在馴化移栽過程中根的解剖結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯的變化（圖1）。馴化移栽初期，根的外皮層由多層較大的薄壁細(xì)胞組成，細(xì)胞排列疏松，細(xì)胞間隙大；內(nèi)皮層細(xì)胞排列整齊緊密，細(xì)胞壁加厚明顯。隨著移栽時(shí)間的延長(zhǎng)，外皮層的薄壁細(xì)胞變得排列緊密整齊，內(nèi)皮層細(xì)胞排列整齊呈環(huán)狀結(jié)構(gòu)，根的維管柱不斷分化發(fā)育。移栽初期（0周），根的木質(zhì)部和韌皮部等組織分化不明顯。1周后，根的木質(zhì)部和韌皮部開始分化發(fā)育。3周后，根的輸導(dǎo)組織木質(zhì)部和韌皮部已經(jīng)完全形成，在維管柱中央的木質(zhì)部上清晰可見被染成紅色的大量導(dǎo)管，導(dǎo)管的管孔直徑較大，管壁較厚，一串相毗鄰的單管孔徑向地排列成鏈狀，形成管孔鏈。

圖1 蘋果組培苗馴化移栽過程中不同時(shí)期根的解剖結(jié)構(gòu)

2.2 蘋果組培苗馴化移栽過程中莖解剖結(jié)構(gòu)的變化

馴化移栽過程中，‘嘎啦’蘋果組培苗莖的解剖結(jié)構(gòu)均由表皮、皮層和中柱3個(gè)部分構(gòu)成，但不同時(shí)期各部分組織內(nèi)部的形態(tài)結(jié)構(gòu)存在明顯差異（圖2）。隨著馴化移栽時(shí)間的延長(zhǎng)，皮層的厚角組織和薄壁組織分化發(fā)育逐漸完善。移栽2周后，厚角組織的細(xì)胞層數(shù)為3～4層，細(xì)胞層數(shù)明顯高于移栽初期，并且細(xì)胞排列變得整齊有序。移栽初期，皮層薄壁細(xì)胞大小不等、形狀不規(guī)則；1周后，皮層薄壁細(xì)胞變得大小均等，形狀近圓形。隨著移栽時(shí)間的延長(zhǎng)，中柱的維管束和髓等組織也發(fā)生明顯的變化。移栽初期，蘋果組培苗維管束已經(jīng)少量形成，若干個(gè)維管束像圓球形相擁在一起而形成的簇狀結(jié)構(gòu)，沒有形成清晰可見的環(huán)狀條帶。隨著移栽時(shí)間的延長(zhǎng)，維管束逐漸形成環(huán)狀條帶，且條帶的厚度逐漸增加，新形成的維管束不斷增加，導(dǎo)致髓射線不斷減少。移栽初期，髓細(xì)胞占整個(gè)莖半徑的比例較大。移栽后，隨著薄壁細(xì)胞和維管束的不斷發(fā)育，導(dǎo)致皮層和維管束在莖半徑中所占的比例逐漸增大，而髓細(xì)胞所占的比例相對(duì)下降。

圖2 蘋果組培苗馴化移栽過程中不同時(shí)期莖的解剖結(jié)構(gòu)

2.3 蘋果組培苗移栽過程中葉片解剖結(jié)構(gòu)和表皮特征的變化

蘋果試管苗移栽初期，蘋果葉片的柵欄組織發(fā)育不完全，海綿組織細(xì)胞間隙大，柵欄組織和海綿組織細(xì)胞厚度比很低，僅為0.41。隨著移栽時(shí)間的延長(zhǎng)，葉片柵欄組織厚度逐漸增大，移栽1周后不同時(shí)期的柵欄組織厚度差異顯著（表1）。柵欄組織和海綿組織分化發(fā)育不斷完善，柵欄組織的細(xì)胞長(zhǎng)度增加，細(xì)胞體積增大，細(xì)胞的層數(shù)不斷增加。3周后，柵欄組織細(xì)胞層數(shù)變成2層，細(xì)胞排列變得整齊緊密，海綿組織的細(xì)胞間隙逐漸變?。▓D3），柵欄組織與海綿組織的厚度比逐漸變大，移栽3周后柵欄組織和海綿組織厚度比增加到0.74。

表1 蘋果組培苗移栽過程中葉片解剖結(jié)構(gòu)的變化

圖3 蘋果組培苗馴化移栽過程中不同時(shí)期葉的解剖結(jié)構(gòu)

隨著移栽時(shí)間的延長(zhǎng)，蘋果組培苗葉片上的氣孔形態(tài)和氣孔密度均發(fā)生明顯變化。馴化移栽初期，氣孔近圓形，突出于葉片表皮細(xì)胞之上，氣孔的開度較大（圖4）。隨著移栽時(shí)間的延長(zhǎng)，蘋果組培苗葉片下表皮上的氣孔下限程度不斷增加，且氣孔的開度慢慢變小。移栽3周時(shí)，蘋果組培苗葉片下表皮的氣孔凹陷于表皮細(xì)胞之下。移栽過程中，蘋果組培苗的氣孔密度不斷下降。移栽3周時(shí)，蘋果組培苗氣孔密度下降為187個(gè)/mm2，這與移栽初期的氣孔密度252個(gè)/mm2差異顯著（表2）。

表2 蘋果試管苗移栽過程中葉片氣孔形態(tài)特征的變化

圖4 蘋果試管苗移栽過程中葉片表面氣孔形態(tài)特征變化

3 討論

‘嘎啦’蘋果組培苗馴化移栽過程中，根莖微觀形態(tài)的主要變化是輸導(dǎo)組織木質(zhì)部和韌皮部的形成和發(fā)育。木質(zhì)部和韌皮部組織的充分發(fā)育是蘋果組培苗適應(yīng)外界環(huán)境的積極響應(yīng)。其次，厚角組織是植物生長(zhǎng)發(fā)育重要的機(jī)械組織。馴化移栽過程中，厚角組織分化發(fā)育逐漸完善。植物在缺水條件下能促使機(jī)械組織發(fā)達(dá)。馴化移栽過程中外界環(huán)境的濕度明顯低于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，這可能是導(dǎo)致蘋果組培苗厚角組織細(xì)胞層數(shù)增加的主要原因。植物承受越多的機(jī)械壓力，厚角組織細(xì)胞壁開始變厚越早，發(fā)生變化的細(xì)胞數(shù)也越多[17-18]。培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)沒有空氣流通或空氣流通較少，移栽后隨著空氣流通的增加，厚角組織細(xì)胞壁加厚和細(xì)胞層數(shù)明顯增加，有助于移栽后蘋果組培苗抗倒伏性能的提高。

葉片是植物對(duì)環(huán)境變化最為敏感的器官，葉片柵欄組織與海綿組織的分化程度可間接反映環(huán)境中的水分狀態(tài)[19]。在直射陽(yáng)光下發(fā)育的葉有更多的柵欄組織分化[20]。在一定環(huán)境條件下，存在著一個(gè)最佳的柵欄組織和海綿組織厚度比值，這是葉片對(duì)環(huán)境光強(qiáng)和葉片內(nèi)光分布的適應(yīng)[21]。馴化移栽初期，蘋果組培苗葉片柵欄組織和海綿組織均不發(fā)達(dá)，這說明組培苗的光合自養(yǎng)能力較低，這主要與培養(yǎng)容器內(nèi)光照強(qiáng)度相對(duì)較弱和培養(yǎng)基中糖含量高等有關(guān)[22-24]。移栽3周，葉片的柵海比變大，葉片柵欄組織的顯著變化既可提高光合作用速率和對(duì)水分的利用率，又能保持細(xì)胞的膨壓和有效維持氣孔開度，防止失水造成的機(jī)械損傷，是組培苗葉片適應(yīng)外界環(huán)境的表現(xiàn)，也是蘋果組培苗由半自養(yǎng)半異養(yǎng)向完全自養(yǎng)轉(zhuǎn)變的過程。

移栽初期，蘋果組培苗葉片上的氣孔突出于表皮之上，有利于水分散失，類似于水生植物的氣孔形態(tài)，這種氣孔結(jié)構(gòu)顯然有利于氣體交換，又不會(huì)因?yàn)榕囵B(yǎng)瓶?jī)?nèi)的高濕而引起植株失水。蘋果組培苗移栽初期氣孔密度較大，可能與組培條件下充足的水分、光照強(qiáng)度弱或培養(yǎng)基中的蔗糖濃度密切相關(guān)，培養(yǎng)基中添加蔗糖能明顯增加葡萄試管苗的氣孔密度[12]，2～3周時(shí)氣孔密度不斷變小，氣孔密度的下降有利于葉片對(duì)水分的保持，同時(shí)隨著移栽時(shí)間的延長(zhǎng)，葉片下表皮上的氣孔器下陷程度不斷增加，氣孔開口變小。氣孔密度的變小和氣孔下陷的形態(tài)變化均有利于組培苗葉片對(duì)水分的保持，防止水分過度蒸發(fā)，是組培苗葉片微觀結(jié)構(gòu)對(duì)外界環(huán)境的適應(yīng)性表現(xiàn)[14,23]。

在馴化移栽過程中，蘋果組培苗根莖葉結(jié)構(gòu)的微觀結(jié)構(gòu)變化是其適應(yīng)外界環(huán)境而進(jìn)行自我調(diào)節(jié)的一種表現(xiàn)。根莖微觀形態(tài)的變化主要是輸導(dǎo)組織和機(jī)械組織的形成和發(fā)育，葉片柵欄組織的顯著變化是組培苗光合能力提高的主要原因，氣孔逐漸下陷于表皮細(xì)胞之下說明葉片的保水能力逐漸提高，能有效防止水分過度散失。根莖葉的微觀形態(tài)變化是組培苗由半自養(yǎng)半異養(yǎng)向自養(yǎng)轉(zhuǎn)變的過程。因此，前期適當(dāng)?shù)恼诠獗窈瓦x擇保濕能力強(qiáng)的基質(zhì)是提高移栽成活率的關(guān)鍵技術(shù)措施。