李曉菲 張燁 劉婷婷 苗天紅 許志遠(yuǎn)

截至2021年2月國際輸血協(xié)會(huì)（ISBT）已經(jīng)確認(rèn)了43個(gè)紅細(xì)胞血型系統(tǒng)。ABO血型系統(tǒng)是最早發(fā)現(xiàn)且臨床最重要的紅細(xì)胞血型系統(tǒng)。ABO血型抗原是糖鏈結(jié)構(gòu)，血型基因通過控制不同的糖基轉(zhuǎn)移酶合成不同的糖蛋白，形成A、B、O、AB四種表型。由于ABO血型基因的多態(tài)性，堿基突變、缺失、插入、重組以及拼接錯(cuò)誤，都會(huì)影響糖基轉(zhuǎn)移酶的活性和特異性，從而影響A、B抗原的表達(dá)，這就是ABO亞型形成的原因[1]。Ael亞型是比較稀有的ABO亞型，血清學(xué)僅能通過吸收放散試驗(yàn)檢測[2]。利用分子生物學(xué)的方法，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)Ael亞型有多種不同的基因型。本中心收集并鑒定了9例Ael/AelB亞型血液樣本，發(fā)現(xiàn)了4種Ael基因型，現(xiàn)報(bào)道如下。

材料與方法

1 標(biāo)本來源 從2020年11月～2021年9月由醫(yī)院輸血科送至本中心進(jìn)行疑難血型鑒定的血液標(biāo)本中，收集經(jīng)血清學(xué)方法鑒定為Ael/AelB亞型的標(biāo)本，共9例。樣本收集及相關(guān)試驗(yàn)的開展均已通過北京市紅十字血液中心醫(yī)學(xué)倫理審查委員審批（編號(hào)：2020-005-002）。

2 試劑與儀器 抗-A、抗-B血型定型試劑（上海血液生物醫(yī)藥有限公司，20201216），人ABO血型反定型試劑紅細(xì)胞（上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司，20215315），抗-AB（Immucor，301601），抗-H（Sanquin，8000452618），人源抗-A、抗-B（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院輸血研究所，20200816），人類ABO血型基因分型檢測試劑盒-熒光PCR法（江蘇偉禾生物，202104A），MagCore?核酸提取試劑盒（RBC Bioscience，MGB400-03）；MagCore?Super全自動(dòng)核酸提取儀（RBC Bioscience，MCA1602），熒光定量PCR儀（ABI，QuantStudio3），PCR擴(kuò)增儀（ABI，ProFlex PCR System），微量分光光度計(jì)（北京美林恒通儀器有限公司，SMA4000），恒溫震蕩金屬?。ū本┞房祈樃咝录夹g(shù)有限公司，Thermomixer），離心機(jī)（日本久保田，KA-2200）。

3 血清學(xué)試驗(yàn) ABO血型鑒定采用試管法、吸收放散試驗(yàn)，操作流程參考文獻(xiàn)[3]。Ael/AelB亞型的血清學(xué)格局正定型表現(xiàn)為O型/B型，反定型表現(xiàn)抗-A弱或不能檢出抗-A，通過試管法檢測常呈現(xiàn)出正反定不符的現(xiàn)象。產(chǎn)生這種血清學(xué)格局的原因有很多，可通過增加檢測試劑如抗-AB、抗-H以及開展吸收放散試驗(yàn)來輔助血型鑒定。

4 基因檢測 EDTA抗凝全血中提取DNA，將DNA濃度調(diào)整至50 ng/μL，于–40℃保存?zhèn)溆谩＠萌祟惣t細(xì)胞ABO血型基因分型試劑盒檢測A、A205、B、OT、O1、O2等位基因，進(jìn)行基因型初步判定。通過基因測序技術(shù)檢測ABO血型基因第6、第7外顯子，引物序列參考文獻(xiàn)報(bào)道[4]。以A101為參考序列，使用Geneious（11.1.4版本）軟件進(jìn)行序列比對(duì)和分析。

結(jié)果

1 ABO血型血清學(xué)結(jié)果 試管法ABO血型正反定型及吸收放散試驗(yàn)結(jié)果見表1。9例樣本吸收放散試驗(yàn)陽性，表明紅細(xì)胞上有弱A抗原。通過血型血清學(xué)結(jié)果可判斷1～7號(hào)為A亞型，8～9號(hào)為A亞B型。

表1 9例血液樣本血清學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2ABO血型基因檢測結(jié)果 利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測9例標(biāo)本的ABO血型基因型，均檢出A基因，結(jié)果見表2。通過序列比對(duì)與分析，共發(fā)現(xiàn)4種Ael基因型，分別為Ael02（3例）、Ael04（1例）、Ael05（4例）和Ael10（1例），具體發(fā)生突變的堿基位點(diǎn)及氨基酸變化見表3，序列突變位置見圖1。

圖1 Ael亞型測序結(jié)果

表2 9例血樣樣本基因檢測結(jié)果

表3 4種Ael基因型突變位點(diǎn)

討論

Ael亞型是指紅細(xì)胞與抗-A和抗-AB不發(fā)生凝集，僅能通過吸收放散試驗(yàn)檢測到弱A抗原，血清中常能檢測到抗-A1[3]。根據(jù)輸血相容性檢測標(biāo)準(zhǔn)，在無法獲得同型血液時(shí)，Ael亞型患者可選擇O型洗滌紅細(xì)胞，A型或AB型血漿輸注。在本次收集的9例Ael/AelB亞型樣本中，只在9號(hào)標(biāo)本紅細(xì)胞上檢測到了弱的A抗原，其余均不能與抗-A發(fā)生凝集反應(yīng)，經(jīng)鑒定該標(biāo)本基因型為Ael05/B101，有文獻(xiàn)報(bào)道[5]由于等位基因間的增強(qiáng)作用，AelB型人紅細(xì)胞可能與某些單克隆抗-A發(fā)生弱的凝集，類似B（A）血型。在9例Ael/AelB亞型中，部分樣本血漿中存在弱的抗-A，由于檢測試劑的不同以及個(gè)體差異，有些未能檢出抗-A或者抗-A的效價(jià)有微弱差異。另外，9例樣本利用吸收放散試驗(yàn)均檢出弱A抗原，血清學(xué)結(jié)果表明為Ael/AelB亞型。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法對(duì)9例標(biāo)本進(jìn)行初步基因分型，結(jié)果與測序相符。通過序列比對(duì)與分析，進(jìn)一步明確了每種Ael對(duì)應(yīng)的等位基因及突變情況。

現(xiàn)已報(bào)道的Ael亞型等位基因共有12種[6]，具體見表4。同一種Ael亞型血清學(xué)格局，可以由不同的基因突變引起。ABO基因位于第9號(hào)染色體，共包含7個(gè)外顯子，6個(gè)內(nèi)含子，編碼區(qū)全長1062 bp。其中負(fù)責(zé)A型/B型糖基轉(zhuǎn)移酶催化功能的區(qū)域主要集中在第6、第7外顯子，Ael亞型的突變高發(fā)區(qū)多在第7外顯子。

表4 Ael基因多態(tài)性位點(diǎn)比較

在本次收集并鑒定的9例Ael/AelB亞型中，共發(fā)現(xiàn)了4種Ael基因型：Ael02、Ael04、Ael05和Ael10。其突變機(jī)制分別為基因重組、剪切拼接錯(cuò)誤、點(diǎn)突變以及移碼突變。在這9例Ael/AelB亞型中Ael02型檢測到了3例，發(fā)生頻率較高。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[7]Ael02型多發(fā)生在日本人，主要通過A102與O02這兩個(gè)等位基因在第7外顯子發(fā)生基因重組產(chǎn)生，其中堿基位646T＞A的突變是導(dǎo)致酶活性減弱的主要原因。同樣通過基因重組產(chǎn)生的還有Ael07[8]，其重組也是發(fā)生在A102與O02這兩個(gè)等位基因之間，形成A1v-O1v雜交基因，829G＞A處突變導(dǎo)致了A型糖基轉(zhuǎn)移酶活性的減弱，產(chǎn)生了Ael表型。

Ael04型檢測到1例，該基因型最早在中國臺(tái)灣發(fā)現(xiàn)并報(bào)道[9]，其基因突變位點(diǎn)發(fā)生在第6內(nèi)含子+5G＞A。雖然突變位置不在編碼區(qū)，但此處突變導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄過程中剪切拼接發(fā)生錯(cuò)誤，造成第5、第6外顯子缺失，使合成的糖基轉(zhuǎn)移酶在N末端缺失了57個(gè)氨基酸，從而減弱了酶活性，造成了A抗原的弱表達(dá)[10]。

Ael05型最早由中國學(xué)者報(bào)道[11]，主要發(fā)生在中國，在本研究中共檢測到4例，發(fā)生頻率較高。767T＞C的堿基替換導(dǎo)致編碼的氨基酸在256位由異亮氨酸（Ile）突變?yōu)樘K氨酸（Thr），改變了A型糖基轉(zhuǎn)移酶的活性。另外，通過點(diǎn)突變形成Ael亞型的基因型還有Ael06，其在425C＞T發(fā)生突變[12]，以及Ael11在955C＞G處發(fā)生突變[13]。

Ael10型是2019年報(bào)道的一種Ael亞型等位基因[1]，在本文中也檢測到1例，其突變發(fā)生在堿基序列959～963區(qū)間，5個(gè)連續(xù)的堿基C之間插入了一個(gè)C，導(dǎo)致合成的氨基酸序列從322位發(fā)生移碼突變，終止密碼子后移，增加了34個(gè)氨基酸，從而影響了酶的催化活性，導(dǎo)致A基因的弱表達(dá)。同樣通過移碼突變影響酶活性形成Ael亞型的還有Ael01、Ael03、Ael08、Ael12。其中Ael01是1995年由OLSSON等[14]最先報(bào)道的Ael亞型等位基因，突變主要發(fā)生在798～804區(qū)間7個(gè)連續(xù)堿基G之間插入單堿基G，導(dǎo)致合成的氨基酸序列從269位發(fā)生移碼突變，終止密碼子后移，增加了37個(gè)氨基酸，影響了酶活性的表達(dá)，該等位基因多發(fā)生在歐洲人。隨后報(bào)道的Ael08型[15]也發(fā)生了相同的突變，兩種等位基因的區(qū)別在于Ael08同時(shí)存在467C＞T的堿基替代，467C＞T多發(fā)生在A102，該突變對(duì)酶活性幾乎沒有影響，A102在中國人中出現(xiàn)頻率遠(yuǎn)高于A101[16]，而Ael08也多發(fā)生在中國人。另外，Ael03（804delG）以及Ael12（816insG）也分別在不同堿基位點(diǎn)通過缺失或插入單堿基使堿基序列發(fā)生移碼突變[17-18]。

除了上述4類Ael亞型的形成機(jī)制外，還有文獻(xiàn)報(bào)道[19]了Ael09型，其突變發(fā)生在第2外顯子，在52C＞T處發(fā)生堿基替換，導(dǎo)致終止密碼子提前出現(xiàn)，無法翻譯出完整的氨基酸序列。但其在紅細(xì)胞上仍能吸收放散出弱A抗原，原因可能是在突變形成的終止密碼子下游出現(xiàn)的甲硫氨酸仍可作為起始密碼子重新起始翻譯過程，合成活性減弱的糖基轉(zhuǎn)移酶，最終在血清學(xué)上表現(xiàn)為Ael亞型。

不同等位基因產(chǎn)生的Ael亞型可能源于不同的分子機(jī)制，但都催化相同的反應(yīng)，在紅細(xì)胞表面合成痕量的A抗原，在血型血清學(xué)上也都呈現(xiàn)相同的ABO血型表現(xiàn)格局。通過對(duì)ABO血型基因的序列分析，可知Ael亞型具有豐富的基因多樣性，而且突變并不都發(fā)生在酶的活性中心，也可能在非活性位點(diǎn)通過影響糖基轉(zhuǎn)移酶的空間構(gòu)象改變酶的活性。通過對(duì)Ael亞型基因分型的研究，有助于我們了解上游基因水平上的改變?nèi)绾斡绊懴掠蔚鞍踪|(zhì)的合成，進(jìn)而影響酶的活性，這對(duì)后續(xù)探索ABO亞型所引起的糖基轉(zhuǎn)移酶功能的改變具有重要意義。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突