權(quán)軍輝 張明剛 吳姣姣 趙景杰 韓梅寧

CD47單抗是治療腫瘤的一種新型靶向藥物，于2020年9月在中國進入Ⅲ期臨床試驗[1]。TJC4（TJ011133，臨床登記號：NCT 03934814）是一種針對CD47靶點的創(chuàng)新全人單克隆抗體，與其他CD47單抗藥物一樣，同屬IgG4亞型腫瘤治療靶向藥物，不僅與腫瘤細胞上高度表達的CD47抗原結(jié)合，阻止“不要吃我”信號的形成，促進巨噬細胞對腫瘤的吞噬，同時可干擾輸血相容性試驗造成患者血型鑒定或配血困難[1-2]。文獻報道：CD47抗原所有細胞均有表達，但不同Rh表型細胞表達劑量不同，ccdee表達量最高，其次是ccDEE，D-少量或微量表達，Rh null幾乎不表達[3-5]。本研究旨在探索不同Rh表型細胞與TJC4結(jié)合的血清學特征，報道如下。

材料與方法

1 一般資料 西安交通大學第二附屬醫(yī)院常規(guī)就診患者中隨機選取Rh表型分別為CCDee、CcDEe、CcDee、ccDEE、ccDEe、ccdee、Ccdee、CCdee的A型患者（前4種表型各5例，后4種表型各3例）作為研究對象。納入標準：1）非腫瘤且無嚴重基礎(chǔ)疾病；2）所研究各Rh表型抗原均符合血清學檢測“4+”標準；3）CT、核磁等影像學及相關(guān)實驗室檢查結(jié)果均可排除腫瘤相關(guān)疾病。排除標準：1）腫瘤及與腫瘤相關(guān)基礎(chǔ)疾病者；2）Rh表型相關(guān)抗原血清學檢測非標準“4+”者；3）影像及實驗室相關(guān)檢查無法排除腫瘤相關(guān)疾病者等。該研究已通過西安交通大學第二附屬醫(yī)院倫理委員會審批（獲批倫理號：XY2021001-EC-1），所涉及藥物TJC4及相關(guān)試劑的使用權(quán)限均已征得資助方同意。

2 儀器與試劑 37℃恒溫水浴箱（HH-US-A，江蘇新春蘭科學儀器有限公司）、離心機（ID-Centrifuge 12 S Ⅱ，BIO-RAD，達亞美有限責任公司）、保溫箱（ID-Incubator 37 S Ⅰ，BIO-RAD，達亞美有限責任公司）、離心機（KA-2200，日本久保田公司）、EDTA-K25 mL抗凝管（批號：210305，瀏陽市三力醫(yī)用科技發(fā)展有限公司）、低離子抗球蛋白卡（批號：50531.62.12，達亞美有限責任公司）、生理鹽水（批號：M21041102C，四川科倫藥業(yè)股份有限公司）、Anti-A、B（IgM單克隆抗體）（批號：20210406，上海血液生物醫(yī)藥有限責任公司）、Anti-D（IgM單克隆抗體）（批號：20211803，上海血液生物醫(yī)藥有限責任公司）、Anti-D（IgG單克隆抗體）（批號：20200826，上海血液生物醫(yī)藥有限責任公司）、人ABO血型正/反定型和Rh（D）血型檢測卡（柱凝集法）（批號：113210702，天津德祥生物技術(shù)有限公司）、人Rh系統(tǒng)分型檢測卡（柱凝集法）（批號：131G210902，天津德祥生物技術(shù)有限公司）、凝聚胺試劑（批號：A210201，珠海貝索生物技術(shù)有限公司）、抗篩譜細胞（批號：20217022，上海血液生物醫(yī)藥有限責任公司）、TJC4（批號：2120S19Aa，I-Mab公司）、獨特型抗體ID-ab 9F9H11H811（批號：RD210207300，I-Mab公司）、Gamma N-HANCE（批號：335023，IMMUCOR公司）、Immucor AHG（批號：702026-1，IMMUCOR公司）、AHG（批號：20195002，上海血液生物醫(yī)藥有限責任公司）。

3 方法

3.1 不同Rh表型細胞與TJC4結(jié)合的血清學特征研究

3.1.1 試驗樣本 EDTA-K2分別抽取每位研究對象靜脈血5 mL；

3.1.2 體外致敏 每個Rh表型EDTA-K2抗凝全血標本2925（975×3）μL加TJC415（5×3）μL（終濃度200 μL/mL全血）混勻，37℃孵育1 h，分離紅細胞和血漿備用；

3.1.3 對比觀察并分析致敏前后各研究對象ABO血型鑒定及Rh分型相關(guān)檢測指標有無變化；

3.1.4 ID-ab中和取400 μL藥物致敏血漿分別加入兩個獨特型抗體ID-ab管（70 μL ID-ab/管，ID-ab獨特型抗體濃度為1.632 mg/mL），37℃孵育1 h，備用；

3.1.5 微柱凝膠法、鹽水法、聚凝胺法、血型鑒定、DAT、IAT及交叉配血試驗嚴格按第四版《全國臨床檢驗操作規(guī)程》[6]及《臨床輸血技術(shù)規(guī)范》[7]規(guī)范操作；

3.1.6 Immucor AHG去干擾以上海生物AHG為對照，試管法分別取致敏血漿、1%濃度致敏紅細胞每管100 μL做DAT、IAT、交叉配血試驗。對照組各加入100 μL上海生物AHG，試驗組各加入100 μLGamma N-HANCE（LISS增強劑）37℃孵育30 min后洗滌1次棄上清，再各加入Immucor AHG100 μL，3000 r/min離心1 min觀察結(jié)果。

3.2 ccDEe和ccdee表型細胞致敏血漿與獨特型抗體ID-ab中和劑量差異研究。

3.2.1 取ccDEe和ccdee表型細胞致敏血漿各100 μL、100 μL、50 μL分別對應(yīng)加入40 μL、70 μL、70 μL獨特型抗體ID-ab管（規(guī)格同上），37℃孵育1 h，備用；

3.2.2 分別取ccDEe和ccdee表型上述三種比例的ID-ab中和血漿各25 μL×3加入微柱凝膠卡，與1%濃度抗體篩查譜細胞Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各50 μL×337℃保溫箱孵育15 min后，1500 r/min離心10 min觀察結(jié)果。

結(jié)果

1 本研究所納入研究對象EDTA-K2抗凝全血經(jīng)CD47單抗TJC4體外致敏前后ABO血型鑒定及Rh分型檢測相關(guān)指標變化如表1所示：1）致敏前所有研究對象ABO血型鑒定正反一致且均達到血型鑒定標準判定規(guī)格，而致敏后出現(xiàn)正反不符（主要體現(xiàn)在反定型上）；2）Rh分型檢測指標影響不明顯；3）反定型鹽水法與微柱凝膠法檢測結(jié)果略有差別。

表1 致敏前后各研究對象ABO血型鑒定及Rh分型相關(guān)檢測指標

續(xù)表1

2 不同Rh表型細胞與CD47單抗TJC4結(jié)合的血清學特征如表2所示：1）該研究所納入所有Rh表型細胞致敏后DAT、IAT、交叉配血試驗結(jié)果均呈不同凝集強度陽性，且交叉配血主側(cè)凝集均略強于次側(cè)；2）Rh表型為CCDee、CcDEe、CcDee、ccDEE、Ccdee、CCdee時，致敏血漿中的CD47單抗TJC4能夠被獨特型抗體ID-ab所中和，而Rh表型為ccDEe ccdee時，致敏血漿中的CD47單抗TJC4則不能夠被獨特型抗體ID-ab所中和；3）Immucor AHG LISS增強法能夠去除CD47單抗TJC4對所有Rh表型細胞的干擾。

表2 不同Rh表型紅細胞與TJC4結(jié)合的血清學特征

3 ccDEe和ccdee表型細胞致敏血漿與獨特型抗體ID-ab中和存在劑量差異，即在同種濃度[致敏血漿：ID-ab=10:4（100:40）、10:7（100:70）、10:14（50:70）]下加大獨特型抗體ID-ab中和劑量可達到消除CD47單抗TJC4對ccDEe 和ccdee表型細胞的干擾。

討論

文獻報道[8]：CD47又稱整合素相關(guān)蛋白（integrin-associated protein，IAP），本質(zhì)跨膜糖蛋白，廣泛存在于各種細胞膜表面且以非共價鍵連接，是重要的紅細胞表面標記，能與巨噬細胞表面抑制受體蛋白（singal-regulatory protein alpha， SIRPa）結(jié)合并激活SIRPa胞內(nèi)受體酪氨酸抑制膜序（immunoreceptor tyrosine inhibitory motif，ITIM）使其磷酸化，從而阻止巨噬細胞對靶細胞的吞噬，即巨噬細胞對靶細胞的吞噬作用與細胞膜表面CD47表達與否及其表達劑量均相關(guān)，不表達不影響，表達且表達劑量越多抑制作用越明顯。巨噬細胞屬免疫細胞，源自單核細胞，由骨髓前體細胞發(fā)育而來，通過免疫應(yīng)答既可阻止機體免受各種侵害，亦可因防御過度而使機體發(fā)生炎性反應(yīng)，一般機體免疫多處于自穩(wěn)狀態(tài)，倘若細胞表面CD47抗原過度表達，機體就會因巨噬細胞結(jié)合靶細胞功能降低而發(fā)生各種腫瘤樣難治性疾病。

表3 ccDEe和ccdee表型致敏血漿與ID-ab中和劑量

TJC4具有差異化特質(zhì)，擁有獨特結(jié)合表位，為IgG4亞類抗體，通過阻斷CD47通路使腫瘤得以被巨噬細胞吞噬，可最小程度與正常紅細胞結(jié)合且不產(chǎn)生凝聚作用，屬Ⅰ類治療用生物制品，適用于復發(fā)或難治性急性髓系白血病（AML）或骨髓增生異常綜合征（MDS），2019年4月26日獲得國家藥品監(jiān)督管理局（NMPA）默示許可，2019年6月24日被宣布已在美國完成臨床研究首例患者給藥，2019年7月31日在中國醫(yī)學科學院血液病醫(yī)院首次通過倫理委員會審查，2020年3月25日國內(nèi)臨床研究第一例招募患者簽署知情同意書并于2020年4月2日入組，目前仍在臨床研究階段[9-10]。

正常機體雖無腫瘤樣惡性疾病發(fā)生，但不同Rh表型細胞表面CD47抗原表達存在劑量差異，當其分別與一定量CD47單抗結(jié)合時，必然存在抗體不足、等量、過量三種情況?？乖^量抗體不足或抗原抗體等量時，致敏血清中不會有游離抗體檢出，抗原不足抗體過量時，致敏血清中則會有游離抗體檢出。本研究即證實：1）使用CD47單抗TJC4后，可因患者血清中游離抗體的存在而致ABO血型鑒定時正反不符；2）所有Rh表型細胞與CD47單抗TJC4結(jié)合后同一試驗不同方法間存在明顯差異，這與不同試驗方法間本身差異性相關(guān)；3）不同Rh表型細胞與CD47單抗TJC4結(jié)合后經(jīng)同等濃度不同劑量獨特型抗體ID-ab中和后亦存在明顯差異，即獨特型抗體ID-ab中和試驗ccDEe、ccdee表型與CCDee、CcDEe、CcDee、ccDEE、Ccdee、CCdee表型達到相同的血清學試驗結(jié)果所需獨特型抗體ID-ab中和劑量存在差異，說明獨特型抗體ID-ab中和試驗可消除CD47單抗對輸血相容性試驗的干擾，但不同Rh表型間所需其中和劑量不同；4）缺乏IgG4檢測功能的Immucor AHG試劑LISS增強劑法能夠消除本研究中TJC4對所有Rh表型細胞所造成的血清學干擾，這與CD47單抗本身屬IgG4亞類抗體的特性相關(guān)[11]。

綜上所述，該研究的臨床意義在于明確：1）所有Rh表型細胞與TJC4結(jié)合后均存在ABO血型鑒定正反不符（TJC4干擾反定型）、交叉配血主次不合（主側(cè)明顯）、DAT和IAT陽性等特征，且不同實驗方法間存在明顯差異；2）消除TJC4對輸血相容性試驗的干擾，不同Rh表型細胞患者處理方法略有不同，主要體現(xiàn)在ccDEe和ccdee表型ID-ab中和試驗需加大獨特型抗體ID-ab劑量。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突