陳 鵬，趙 超，胡 珍，陳繼明

(1.江西省都昌縣中醫(yī)院，江西 九江 332600；2.江西省都昌縣人民醫(yī)院，江西 九江 332600)

膝骨關(guān)節(jié)炎(KOA)是最常見的骨關(guān)節(jié)退行性病變，主要病理表現(xiàn)為軟骨退變、滑膜炎性反應(yīng)及軟骨下硬化和骨贅形成[1-3]。據(jù)報道全球約有2.4億人患有KOA[4]。軟骨損傷被認(rèn)為是導(dǎo)致KOA進(jìn)展的關(guān)鍵病理因素[5]。但是，隨著醫(yī)學(xué)的飛速發(fā)展，人們越來越認(rèn)識到滑膜炎性反應(yīng)在KOA發(fā)病中的關(guān)鍵作用[6-8]。 Mancarella等[7]提出滑膜炎性反應(yīng)驅(qū)動了KOA病理過程中的軟骨損傷。同時，許多臨床研究表明，滑膜炎性反應(yīng)與KOA癥狀如關(guān)節(jié)疼痛、僵硬和軟骨損傷顯著相關(guān)[9-10]。因此，了解滑膜炎性反應(yīng)的病理過程在KOA的治療中有重要作用。

隨著現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)的發(fā)展，越來越多的證據(jù)表明KOA的發(fā)生和發(fā)展是由多種基因和信號通路介導(dǎo)的。在過去的十年中，高通量技術(shù)已經(jīng)報道了有關(guān)KOA基因表達(dá)譜研究的大量數(shù)據(jù)，并揭示了許多差異表達(dá)基因(DEG)涉及不同的途徑，生物過程(BP)或分子功能(MF)[11]。生物信息學(xué)方法可以整合多個基因表達(dá)譜的數(shù)據(jù)，使人們能夠研究KOA中mRNA表達(dá)的變化以及DEG之間的相互作用，從而為進(jìn)一步的KOA研究提供了新的見識。因此，本研究旨在通過生物信息學(xué)分析法鑒定KOA滑膜組織中涉及的生物標(biāo)志物和通路，在分子水平上為KOA進(jìn)展提供新的見解。

1 資料與方法

1.1數(shù)據(jù)集下載：在Gene Expression Omnibus(GEO)數(shù)據(jù)庫中以'knee osteoarthritis'為檢索詞檢索KOA滑膜組織的測序數(shù)據(jù)集，得到GSE55235和GSE55457兩個基因表達(dá)數(shù)據(jù)集，兩個數(shù)據(jù)集均使用GPL96平臺處理。GSE55235和GSE55457共含有40個滑膜組織，包括健康關(guān)節(jié)的20個滑膜組織和KOA關(guān)節(jié)的20個滑膜組織。兩個數(shù)據(jù)集的詳細(xì)信息可見表1。

1.2DEG的篩選和鑒定：使用R軟件中的RPA[12]和sva軟件包[13]避免批次效應(yīng)，通過ggpolt2軟件包[14]進(jìn)行箱形圖驗證了兩個數(shù)據(jù)集的規(guī)范化。使用limma軟件包[15]分析確定DEG，以| log2(倍數(shù)變化)|>1和P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義的DEG。使用火山圖和熱圖顯示具有統(tǒng)計學(xué)意義的DEG。 使用R軟件中的ggplot2和pheatmap軟件包[16]生成火山圖和熱圖，顯示具有統(tǒng)計學(xué)意義的DEG。

1.3功能和途徑富集分析：GO富集分析[17]從三個方面來描述基因功能和關(guān)系的概念，即BP，細(xì)胞組分(CC)和MF。使用DAVID數(shù)據(jù)庫[18]對DEG進(jìn)行GO和KEGG通路富集分析，然后使用R軟件進(jìn)行可視化。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.4蛋白-蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和模塊分析：使用STRING數(shù)據(jù)庫[19]構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)。選擇相互作用評分>0.4的DEG在Cytoscape軟件中進(jìn)行可視化。使用MCODE插件進(jìn)行子模塊分析，以鑒定更多連接的基因組[20]。標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置如下：MCODE分值>5，節(jié)點數(shù)>6。并同時對子模塊進(jìn)行功能和通路富集分析。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。本次研究經(jīng)過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會同意。

2 結(jié)果

2.1數(shù)據(jù)集的歸一化：GSE55235和GSE55457均從GEO數(shù)據(jù)庫下載的，并使用RPA和sva軟件包用于規(guī)范化數(shù)據(jù)并避免批處理效應(yīng)。見圖1A所示，方框圖顯示的黑線基本處于同一水平；主成分分析(PCA)顯示，對照組和OA組存在明顯的聚類，各組之間存在顯著差異。見圖1B。

注：A為對DEG進(jìn)行歸一化后的箱線圖，黑線所示的箱線圖基本處于同一水平，這表明兩個數(shù)據(jù)集的患者是統(tǒng)一且可比的，兩者之間的偏差很?。籅為所有納入樣本的主成分分析(PCA)，在對照組和OA組中均顯示出明顯的簇，兩組之間存在顯著差異

2.2鑒定具有統(tǒng)計意義的DEG：使用limma軟件包對比正常組與OA組滑膜組織中的DEG。見圖2所示，總共觀察到279個DEG，包括133個基因被上調(diào)和146個基因被下調(diào)。圖3顯示了所有上調(diào)和下調(diào)的DEG的熱圖。

注：紅點表示上調(diào)的基因，藍(lán)點表示下調(diào)的基因，黑點表示無統(tǒng)計學(xué)差異的基因

注：紅色表示較高的基因表達(dá)，藍(lán)色表示較低的基因表達(dá)

2.3DEG的GO和KEGG通路富集分析：見圖4所示，GO富集分析結(jié)果顯示，在生物學(xué)過程(GO-BP)上，DEGs主要富集在“免疫反應(yīng)”，“細(xì)胞黏附”和“炎性反應(yīng)”等；在分子功能(GO-MF)上，DEG主要通過調(diào)節(jié)“肝素結(jié)合”，“絲氨酸型內(nèi)肽酶活性”和“抗原結(jié)合”發(fā)揮分子功能；在細(xì)胞組分上，DEG主要在“細(xì)胞外囊泡”，“細(xì)胞外區(qū)域”和“細(xì)胞外空間”中顯著富集。

圖4 DEG的前10個GO富集結(jié)果

DEG的KEGG通路富集分析結(jié)果見圖5所示，提示DEGs主要通過“類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎”，“TNF信號傳導(dǎo)途徑”，“破骨細(xì)胞分化”和“ECM-受體相互作用”等途徑發(fā)揮重要作用。

圖5 DEG的前20條KEGG通路富集分析結(jié)果

2.4PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和hub基因篩選：使用STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)PPI網(wǎng)絡(luò)，并選擇相互作用評分>0.4的具有統(tǒng)計學(xué)意義的DEG在Cytoscape軟件中進(jìn)行可視化處理，見圖6。排名前20位的hub基因包括細(xì)胞白介素(IL)-6，原始原癌基因(JUN)，CXC基序趨化因子配8(CXCL8)，血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)，核因子κB抑制劑α(NFKBIA)，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)1，MMP9等。表1列出了前20個hub基因的詳細(xì)信息。在這些基因中，IL-6，JUN和VEGFA具有最高的節(jié)點度，表明其在滑膜炎性反應(yīng)過程中起關(guān)鍵作用。

表1 前20個hub基因的詳細(xì)信息

紅色表示較高程度的基因，黃色表示較低程度的基因

2.5子模塊分析:在PPI網(wǎng)絡(luò)中共鑒定出兩個MCODE分值>5且節(jié)點數(shù)>6的模塊。模塊1(MCODE分?jǐn)?shù)=6.438)包括33個節(jié)點，模塊2(MCODE分?jǐn)?shù)=5.111)包括10個節(jié)點。KEGG通路分析結(jié)果如圖7A和B所示，結(jié)果表明模塊中的DEG在“IL-17信號通路”，“ECM-受體相互作用”，“破骨細(xì)胞分化”，“NF-κB信號通路”中顯著富集。IL-17信號通路在兩個模塊中均顯著富集，提示其可能在OA發(fā)展過程中起關(guān)鍵作用。

圖7 DEG的子模塊的通路富集分析。

3 討論

隨著醫(yī)療技術(shù)的飛速發(fā)展，已將許多方法用于治療KOA，包括物理療法、非甾體類抗炎藥、關(guān)節(jié)鏡和關(guān)節(jié)置換術(shù)等。不幸的是，目前沒有辦法有效地逆轉(zhuǎn)或阻止KOA的進(jìn)展[21]。全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)(TKA)被認(rèn)為是治療終末期KOA的最后選擇，但TKA也存在諸如感染、翻修、功能不滿意等并發(fā)癥[22-23]。因此，研究骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機理并尋找治療KOA的有效方法一直是研究的重點。過去一般認(rèn)為滑膜炎性反應(yīng)被認(rèn)為是由軟骨磨損導(dǎo)致的碎片引起的[24]。但是，最近的研究[25]顯示，滑膜炎性反應(yīng)可以被認(rèn)為是骨關(guān)節(jié)炎的先兆，在放射學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)軟骨損傷之前就已經(jīng)存在。此外，有學(xué)者認(rèn)為滑膜和脂肪膜下墊可被視為解剖功能單元，在KOA發(fā)生過程中加速軟骨損傷并引起疼痛[26]。因此，探索滑膜炎性反應(yīng)的發(fā)病機制可能為KOA的治療提供新的視角。

本文納入了兩個GEO數(shù)據(jù)集，并使用生物信息學(xué)方法分析了279個DEG，包括133個上調(diào)基因和146個下調(diào)基因，并進(jìn)行了GO和KEGG通路富集分析，以探索DEG在KOA進(jìn)展過程中的生物學(xué)機制。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示DEG主要在“類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎”，“TNF信號途徑”，“PI3K-Akt信號途徑”和“破骨細(xì)胞分化”等通路富集，這與先前發(fā)表的文章相似[27-29]。GO富集結(jié)果顯示DEG主要富集在了“免疫反應(yīng)”，“細(xì)胞黏附”和“炎性反應(yīng)”等生物學(xué)過程。先前的研究表明，先天和后天免疫系統(tǒng)在OA過程中起關(guān)鍵作用[30]，并表明骨關(guān)節(jié)炎是一種炎性反應(yīng)性疾病[31]。有趣的是，GO-CC分析結(jié)果顯示DEG主要富集在“細(xì)胞外囊泡”，“細(xì)胞外區(qū)域”和“細(xì)胞外空間”。外泌體是30-150 nm大小的細(xì)胞外囊泡，帶有脂質(zhì)雙層膜，其中包含許多生物活性物質(zhì)，如非編碼RNA、蛋白質(zhì)和mRNA，在細(xì)胞間通訊中起重要作用[32-34]。這些DEG可以通過滑膜分泌到外泌體中，并被關(guān)節(jié)周圍的組織(如軟骨和脂肪墊)吸收，然后放大炎性反應(yīng)并加重軟骨損傷，這進(jìn)一步解釋了滑膜炎性反應(yīng)在OA中的關(guān)鍵作用。

此外，本文構(gòu)建了DEG的PPI網(wǎng)絡(luò)，并使用Cytoscape軟件進(jìn)行可視化并根據(jù)自由度鑒定hub基因，結(jié)果顯示 IL-6，JUN和VEGFA具有最高的自由度。IL-6是一種炎性細(xì)胞因子，參與各種生物過程，包括炎性反應(yīng)、免疫反應(yīng)以及癌癥[35]。IL-6啟動子區(qū)的多態(tài)性引起歐洲人對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的易感性[36]，并與老年人骨關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度和功能狀態(tài)有關(guān)[37]。托珠單抗是一種IL-6抑制劑，可減輕OA引起的中樞敏化和慢性疼痛，并保留關(guān)節(jié)軟骨并增加骨量[38-39]。JUN是另一個hub基因，AP-1是JUN的激活蛋白，可以通過多種刺激調(diào)節(jié)，包括炎性細(xì)胞因子，氧化應(yīng)激等[40]。許多MMPs啟動子包含潛在的AP-1結(jié)合位點，并且被細(xì)胞因子激活的AP-1也可以調(diào)節(jié)MMP表達(dá)。Tang等[41]提出c-JUN/AP-1信號通路調(diào)節(jié)人滑膜成纖維細(xì)胞中IL-6的表達(dá)。VEGFA是VEGF家族的創(chuàng)始成員，通常被稱為VEGF[42]。VEGF在骨骼發(fā)育和骨重構(gòu)中起著調(diào)節(jié)血管生成的關(guān)鍵作用，并被懷疑在OA的發(fā)病機理中起著關(guān)鍵作用[43]。膝關(guān)節(jié)內(nèi)注射VEGF可誘導(dǎo)OA樣變化，如關(guān)節(jié)軟骨降解、蛋白聚糖丟失、滑膜炎性反應(yīng)以及軟骨下硬化[44]。臨床證據(jù)表明VEGF水平升高與OA進(jìn)展有關(guān)[42,45]。最近的臨床前研究也顯示抑制VEGF可有效預(yù)防OA的關(guān)節(jié)破壞并減輕相關(guān)疼痛[42]。

最后，PPI網(wǎng)絡(luò)的子模塊分析表明，OA的發(fā)展與“IL-17信號通路”，“ECM-受體相互作用”，“破骨細(xì)胞分化”，“NF-κB信號通路”等相關(guān)。IL-17信號通路在這兩個模塊中都顯著富集，提示其可能在OA過程中起關(guān)鍵作用。IL-17主要由Th17細(xì)胞產(chǎn)生，Th17細(xì)胞是CD4+T細(xì)胞的一個亞群，主要參與誘導(dǎo)自身免疫和炎性疾病[46]。Liu等[47]發(fā)現(xiàn)與對照組相比，IL-17在OA中的表達(dá)明顯更高患者，并阻斷IL-17信號通路可延遲與OA相關(guān)的疼痛。同時，IL-17信號通路可以激活NF-kB和MAPK通路，而這些通路與OA的發(fā)展密切相關(guān)[48]?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是一種促進(jìn)軟骨分解，降解細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)成分并在OA中起重要病理作用的酶家族[49]。許多文章使用MMPs的表達(dá)水平來反映OA中軟骨損傷的程度，尤其是MMP-1、-3和-9[50-52]。PTGS2是與炎性反應(yīng)相關(guān)的基因，在骨關(guān)節(jié)炎中高度相關(guān)[53]。NFKBIA、FOSB和JUND都與NF-kB和MAPK信號通路密切相關(guān)，它們在OA的病理過程中起著至關(guān)重要的作用[54-55]。

綜上所述，本研究在OA滑膜炎性反應(yīng)過程中鑒定出279個DEG，這些DEG顯著富集在“風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎”，“TNF信號傳導(dǎo)途徑”，“PI3K-Akt信號傳導(dǎo)途徑”和“破骨細(xì)胞分化”等通路。GO-CC的結(jié)果提示滑膜將DEGs釋放至外泌體，在KOA的信號傳遞中起關(guān)鍵作用，并加劇KOA進(jìn)展。IL-17信號通路可能是治療KOA的重要靶標(biāo)。