王發(fā)輝，鄧青春，林佳佳，陳春妃

（海南醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院婦科，?？?570311）

子宮內(nèi)膜癌（uterine corpus endometrial carcinoma，UCEC）是一種常見的婦科惡性腫瘤，其發(fā)病率僅次于卵巢癌和宮頸癌，是第三大威脅女性生命的腫瘤[1]。炎癥和免疫系統(tǒng)與腫瘤的發(fā)生和進展密切相關(guān)。炎性微環(huán)境是腫瘤微環(huán)境中影響腫瘤復發(fā)轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素之一[2-3]。目前已有大量研究表明中性粒細胞具有促癌作用[4-5]。腫瘤相關(guān)中性粒細胞通過促進腫瘤生長、轉(zhuǎn)移、血管生成及免疫抑制等途徑影響腫瘤發(fā)展[6]。

磷酸肌醇3 激酶的p110α 催化亞基（P110 catalytic α subunit of phosphoinositol 3 kinase，PIK3CA）已被證明是UCEC 的預后生物標志物之一[7]。UCEC 中PIK3CA 的表達變化可以改變腫瘤相關(guān)中性粒細胞的比例[8]。癌胚抗原家族的跨膜糖蛋白癌胚抗原細胞黏附分子1（carcinoembryonic antigen cell adhesion molecule 1，CEACAM1）在腫瘤發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，其表達于粒細胞，能延長中性粒細胞壽命，促進腫瘤細胞凋亡[9-10]。本研究將中性粒細胞與PIK3CA 過表達的UCEC 細胞共培養(yǎng)，旨在探討PIK3CA過表達對中性粒細胞抗UCEC增殖的影響及其對CEACAM1/β-catenin 信號通路的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 細胞與主要試劑 白血病細胞（HL-60 細胞）和UCEC 細胞系MFE-296 均購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏中心。胎牛血清（FBS）、DMEM 培養(yǎng)基、IMEM 培養(yǎng)基均購自美國Gibco 公司。兔抗PIK3CA 抗體、兔抗CEACAM1 抗體、兔抗β-catenin抗體、小鼠抗CEACAM1 抗體和辣根過氧化物酶（HRP）偶聯(lián)的山羊抗兔IgG二抗均購自英國Abcam公司。anti-CEACAM1 購自美國LifeSpan BioSciences公司，用于阻斷CEACAM1的活性[11]。異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標記的抗小鼠二抗和FITC 標記的抗兔二抗均購于北京中杉金橋生物技術(shù)公司。BCA蛋白檢測試劑盒和RIPA裂解緩沖液購自上海碧云天公司。

1.2 細胞培養(yǎng) MFE-296 細胞用含10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基；HL-60 細胞用含10% FBS、無內(nèi)毒素的IMEM培養(yǎng)基，均置于37°C、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在IMEM培養(yǎng)基中加入1 μmol/L全反式視黃酸，繼續(xù)培養(yǎng)3 d，誘導HL-60 細胞分化為中性粒細胞樣細胞，即dHL-60細胞。

1.3 MFE-296 細胞轉(zhuǎn)染 分別將PIK3CA 過表達載體（pcDNA-PIK3CA）、空載體（pcDNA-ctrl）（均由上海吉瑪公司進行構(gòu)建）轉(zhuǎn)染至MFE-296 細胞，即pcDNA-PIK3CA組、pcDNA-ctrl組。

1.4 細胞共培養(yǎng)與處理 MFE-296 細胞以2×104個/mL 密度接種于96 孔的共培養(yǎng)板下室中，以1∶5（MFE-296∶dHL-60）的比例在上室加入dHL-60 細胞，共培養(yǎng)24 h。將MFE-296 細胞分為空白組（常規(guī)單獨培養(yǎng)的MFE-296細胞，不予任何處理）、dHL-60 組（MFE-296 細胞與dHL-60 細胞共培養(yǎng)24 h）、pcDNA-ctrl+dHL-60 組（pcDNA-ctrl 組MFE-296 細胞與dHL-60 細胞共培養(yǎng)24 h）、pcDNA-PIK3CA+dHL-60 組（pcDNA-PIK3CA 組MFE-296 細胞 與dHL-60細胞共培養(yǎng)24 h）、anti-CEACAM1+pcDNAPIK3CA+dHL-60 組（在pcDNA-PIK3CA 組MFE-296細胞中加入20 μL 20μg/mL的anti-CEACAM1，并與dHL-60 細胞共培養(yǎng)24 h）、PBS+pcDNAPIK3CA+dHL-60 組（在pcDNA-PIK3CA 組MFE-296 細胞中加入20 μL PBS，并與dHL-60 細胞共培養(yǎng)24 h）。

1.5 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（RT-qPCR）檢測基因表達 用胰酶消化以收集細胞，離心后棄去上清液，每孔加入1 mL Trizol 裂解細胞5 min 后放置在-80 ℃冰箱。提取各組MFE-296 細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，取稀釋后cDNA 按實時定量PCR試劑盒說明書步驟檢測細胞內(nèi)β-catenin、血管內(nèi)皮生長因子A（VEGF-A）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）、白細胞介素-8（IL-8）和CEACAM1mRNA 表達。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，序列見表1。每組設(shè)置3 個復孔，采用2-△△CT法分析結(jié)果。實驗重復進行3次。

表1 PCR引物序列

1.6 Western blotting 法檢測蛋白表達 胰酶消化收集細胞，離心后棄去上清液，加入合適體積的RIAP 裂解液在冰上裂解30 min，離心后提取各組MFE-296 細胞總蛋白，BCA 法檢測總蛋白濃度；行SDS-PAGE 電泳分離蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入一抗：PIK3CA（1∶1 000）、CEACAM1（1∶800）、β-catenin、GAPDH（1∶2 500）4 ℃孵育過夜；洗膜，加入HRP 偶聯(lián)的山羊抗兔IgG（1∶2 000）室溫孵育1 h。ECL 顯影，曝光，以GAPDH 為內(nèi)參，Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值。實驗重復進行3次。

1.7 CCK-8法檢測細胞活力 細胞共培養(yǎng)24 h后，取下室MFE-296細胞。更換新的完全培養(yǎng)基150 μL，每孔加入20 μL CCK-8溶液（5 mg/mL），孵育4 h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min。用酶標儀檢測490 nm波長處各孔的吸光度（OD）值。

1.8 免疫組織化學染色法檢測PIK3CA和CEACAM1表達 收集2017—2020 年在本院接受手術(shù)的74 例UCEC患者的UCEC組織標本。所有患者術(shù)前均未接受化療或放療。用雙免疫熒光組織化學評估CEACAM1和PIK3CA蛋白在UCEC組織中的共定位。制作組織石蠟切片，Tris-EDTA 緩沖液進行脫蠟、再水化和表位修復后，3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，含5% BSA 的TBST 封閉異源抗原，加入小鼠抗CEACAM1抗體（1∶50）、兔抗PIK3CA抗體（1∶100）4°C 孵育過夜；PBST 清洗，加入FITC標記的抗小鼠/抗兔二抗室溫孵育1 h。加入封固劑后在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。計算陽性細胞百分率，＜1%為0 分，1%～10%為1 分，11%～40%為2 分，41%～60%為3 分，61%～100%為4 分。其中0 分和1分為低表達，2分和3分為中表達，4分為高表達。

1.9 癌癥基因組圖譜（TCGA）UCEC 患者mRNAseq 數(shù)據(jù)的獲取 在TCGA 數(shù)據(jù)庫中檢索UCEC 患者的mRNA-seq 數(shù)據(jù)，于在線數(shù)據(jù)庫中直接生成包括548 例UCEC 組織和35 例UCEC 正常組織中PIK3CA 的表達差異結(jié)果以及高表達PIK3CA 或低表達PIK3CA 與UCEC 生存率的Kaplan-Meier 曲線結(jié)果。

1.10 統(tǒng)計學方法 使用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；使用Kaplan-Meier分析PIK3CA表達與UCEC 臨床結(jié)局的相關(guān)性；Spearman 法分析UCEC組織中PIK3CA 表達與CEACAM1 表達的相關(guān)性，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 dHL-60 細胞與過表達PI3KCA 的MFE-296 細胞共培養(yǎng)對MFE-296 細胞VEGF-A、MMP9和IL-8表達的影響 與pcDNA-ctrl組比較，pcDNA-PIK3CA組MFE-296 細胞PIK3CA mRNA 及蛋白表達水平升高（P＜0.05）；在共培養(yǎng)體系的MFE-296 細胞中，與dHL-60 組比較，pcDNA-PI3KCA+dHL-60 組中VEGF-A、MMP9和IL-8mRNA表達上調(diào)（P＜0.05），而pcDNA-ctrl+dHL-60組與dHL-60組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖1。

圖1 dHL-60細胞與過表達PI3KCA的MFE-296細胞共培養(yǎng)對MFE-296細胞IL-8、VEGF-A、MMP-9表達的影響

2.2 共培養(yǎng)體系中MFE-296 的增殖率 與空白組[（95.45±3.43）%]比較，dHL-60 組MFE-296 細胞增殖率[（42.16±1.22）%]降低（P＜0.05），表明dHL-60細胞對MFE-296細胞增殖具有抑制作用；而分別與dHL-60 組[（42.16±1.22）%]和pcDNA-ctrl+dHL-60組[（42.16±3.05）%]比較，pcDNA-PIK3CA+dHL-60組MFE-296 細胞增殖率[（67.24±6.55）%]升高（P＜0.05）。表明過表達PIK3CA 減弱dHL-60 細胞對MFE-296細胞的增殖抑制作用。

2.3 過表達PIK3CA 對MFE-296 中CEACAM1/βcatenin 信號通路蛋白表達的影響 分別與dHL-60組（1.00±0.05、1.00±0.04）和pcDNA-ctrl+dHL-60 組（1.03±0.03、1.07±0.03）比較，pcDNA-PI3KCA+dHL-60 組中MFE-296 細胞內(nèi)CEACAM1 蛋白表達上調(diào)（2.66±0.04），β-catenin 蛋白表達亦明顯上調(diào)（4.41±0.22）（均P＜0.05），見圖3。

圖3 Western blotting檢測MFE-296細胞中CEACAM1和βcatenin蛋白表達

2.4 共培養(yǎng)體系中抑制CEACAM1對過表達PIK3CA的MFE-296細胞增殖及IL-8、VEGF-A、MMP-9表達的影響 加入anti-CEACAM1 后，與PBS+pcDNAPIK3CA+dHL-60 組比較，anti-CEACAM1+pcDNAPIK3CA+dHL-60 組MFE-296 細胞中CEACAM1、β-catenin、VEGF-A、MMP-9、IL-8mRNA 表達下調(diào)（均P＜0.05），MFE-296 細胞增殖率降低（P＜0.05），見圖4。

圖4 PIK3CA的表達通過調(diào)控CEACAM1/β-catenin信號通路抑制dHL-60抗腫瘤作用

2.5 PIK3CA表達水平與UCEC的相關(guān)性 TCGA數(shù)據(jù)庫分析顯示：PIK3CA在UCEC組織中的表達水平低于正常組織（P＜0.0001），見圖5A。Kaplan-Meier生存分析顯示：PIK3CA高表達組生存率低于PIK3CA低表達組（P＜0.05），見圖5B。

圖5 UCEC中PIK3CA表達水平的TCGA數(shù)據(jù)庫預測

2.6 CEACAM1表達與PIK3CA表達的相關(guān)性

UCEC中CEACAM1（綠色熒光）和PIK3CA（紅色熒光）均有明顯表達，且可見大量紅色與綠色熒光重合的橙黃色區(qū)域，表明UCEC 組織中CEACAM1與PIK3CA 可共表達，見圖6。UCEC 中PIK3CA 表達與CEACAM1 表達呈正相關(guān)關(guān)系（r=0.662，P=0.013），見表2。

表2 74例UCEC組織中PIK3CA與CEACAM1表達的相關(guān)性

圖6 UCEC組織中CEACAM1和PIK3CA的共定位（左：×100；右：×200）

3 討論

UCEC 中存在大量的中性粒細胞浸潤，這些中性粒細胞主要通過促進腫瘤侵襲和血管生成來加速腫瘤進展。研究表明，腫瘤微環(huán)境中的中性粒細胞是MMP-9 的重要誘導因素，而MMP-9 高表達可以促進腫瘤細胞外基質(zhì)的降解和重塑，進一步促進腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程，并驅(qū)動腫瘤組織的血管的生成[12]。VEGF-A是一個可促進腫瘤組織血管生長的細胞生長因子，IL-8則是一種強大的趨化因子，可將中性粒細胞募集到腫瘤組織中[13-14]。本研究將UCEC 細胞與中性粒細胞進行共培養(yǎng)，檢測了MMP-9、VEGF-A、IL-8 的表達變化。結(jié)果表明，在dHL-60存在的情況下，過表達PIK3CA可以顯著提高UCEC 細胞VEGF-A、MMP9和IL-8mRNA 表達水平。這表明PIK3CA 可能在細胞外基質(zhì)降解、血管生成以及中性粒細胞募集方面加速了UCEC細胞的惡性進展。

中性粒細胞類似于M1和M2型巨噬細胞，可以根據(jù)腫瘤微環(huán)境誘導從抗腫瘤型（N1）中性粒細胞轉(zhuǎn)變?yōu)榇倌[瘤型（N2）中性粒細胞[15]。同樣，本研究結(jié)果表明，dHL-60 與正常的UCEC 細胞共培養(yǎng)時，UCEC 細胞的增殖率明顯降低，而UCEC 細胞中的PIK3CA 過表達削弱了dHL-60 細胞在共培養(yǎng)系統(tǒng)中的細胞毒性能力，這一結(jié)果與Yan 等[16]在肺癌中的研究結(jié)果一致。表明當腫瘤細胞表達PIK3CA時，UCEC的中性粒細胞可能被誘導從N1型轉(zhuǎn)化為N2 型。盡管本研究未直接觀察N1 型和N2 型中性粒細胞的比例變化，但本研究觀察到中性粒細胞與未過表達PIK3CA 的UCEC 細胞共培養(yǎng)時，UCEC細胞的增殖率與正常的UCEC細胞增殖率無明顯差異，間接證明了未過表達PIK3CA 的UCEC 細胞對于中性粒細胞的N2 型誘導不足，但直接的實驗結(jié)果仍需后續(xù)體內(nèi)和體外實驗進行驗證。

研究表明，CEACAM1 直接調(diào)控β-catenin 并能影響T 細胞的存活，其機制是CEACAM1 阻止了βcatenin 的降解導致β-catenin 的表達增加，從而形成CEACAM1/β-catenin 信號通路，而CEACAM1/βcatenin信號通路的激活也可誘導N2 型中性粒細胞中趨化因子受體4、VEGF 和MMP-9 表達增加[17]。本研究中，UCEC 細胞中PIK3CA 過表達明顯上調(diào)CEACAM1 和β-catenin 蛋白表達。這說明PIK3CA的過表達可能激活了CEACAM1/β-catenin 信號通路，從而發(fā)揮促癌效應(yīng)。為了進一步驗證結(jié)果，本研究在共培養(yǎng)系統(tǒng)中使用CEACAM1 的單克隆抗體anti-CEACAM1，此抗體可以中和CEACAM1 的活性結(jié)構(gòu)，實驗結(jié)果觀察到PIK3CA 過表達存在情況下，anti-CEACAM1 顯著下調(diào)了共培養(yǎng)體系中VEGF-A、MMP-9 和IL-8 的表達。此外，anti-CEACAM1 處理后，PIK3CA 過表達激活的中性粒細胞的促癌作用明顯減弱，導致MFE-296細胞增殖率受到顯著抑制，即CEACAM1/β-catenin 信號通路被阻斷后，即使存在PIK3CA過表達的效果，中性粒細胞的細胞毒性作用也有明顯恢復。以上研究表明PIK3CA可通過激活CEACAM1/β-catenin信號通路抑制中性粒細胞的抗腫瘤作用。

通過TCGA 數(shù)據(jù)庫挖掘的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PIK3CA在UCEC 組織中的表達水平低于正常組織，且Kaplan-Meier 生存分析顯示PIK3CA 高表達組的生存率明顯低于PIK3CA 低表達組，表明PIK3CA 高表達與患者預后差相關(guān)。此外，本研究免疫熒光結(jié)果顯示，CEACAM1 與PIK3CA 在UCEC 中存在共定位，且PIK3CA 表達與CEACAM1 表達呈正相關(guān)關(guān)系，該實驗結(jié)果在胃癌的研究[18]中也得到證實。

綜上所述，PIK3CA 通過激活CEACAM1/βcatenin通路減弱中性粒細胞對UCEC細胞增殖的抑制作用。本研究為UCEC的免疫治療提供了新的思路。