劉亮亮， 安曉麗， 王 淼， 葉瑋琦， 于 碩， 樸炫春

(延邊大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002)

芽孢桿菌屬于食品中難以殺滅的一類微生物，特別是枯草芽孢桿菌，需要極高溫度才能將其殺滅，目前已作為食品殺菌的微生物衡量標(biāo)準(zhǔn)[1-2]。枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)屬于一種革蘭氏陽性菌，常在土壤中或者空氣中腐生，可用于克隆載體或生產(chǎn)α-淀粉酶以及蛋白酶，被認(rèn)為是有益菌[3-5]；但同時(shí)它也是一種條件致病菌，在人體免疫力低下時(shí)會引起各種疾病，如咽喉膿腫、敗血癥等；在新生兒機(jī)會菌敗血癥中，約20%由枯草桿菌引起，甚至其中有約40%引發(fā)了并發(fā)化膿性腦膜炎[6]；并且在眼球受到穿通傷時(shí)會引發(fā)嚴(yán)重的外傷性枯草桿菌性眼內(nèi)炎[7]。

細(xì)菌呼吸代謝是指菌細(xì)胞在呼吸作用中將體內(nèi)糖類、脂類氧化代謝產(chǎn)生的能量供給自身生命活動的過程[8]。細(xì)菌細(xì)胞主要通過糖酵解途徑(EMP)、三羧酸循環(huán)途徑(TCA)、戊糖磷酸途徑(HMP)等進(jìn)行呼吸代謝[9-10]。若菌細(xì)胞呼吸代謝過程受抑制，菌細(xì)胞的新陳代謝過程也將受到抑制，最終導(dǎo)致菌體死亡。因此，通過抑制菌體的呼吸代謝過程，可以有效達(dá)到抑菌效果。另外，細(xì)菌可通過分泌胞外聚合物形成生物膜的方式保護(hù)菌體并黏附在物體表面，當(dāng)細(xì)菌形成完整的生物膜后，抗生素等抗菌藥物無法起到有效的殺菌作用，并且還會不斷地有細(xì)菌從生物膜中逸出導(dǎo)致長期的感染[11-12]。目前普遍應(yīng)用于抑菌、殺菌的物質(zhì)是抗生素，然而由于抗生素的長期使用及濫用促使細(xì)菌對抗生素產(chǎn)生耐藥性[13-15]。大量研究表明，植物源抑菌物質(zhì)具有較強(qiáng)的抑菌、殺菌、抗生物膜效果，可以解決耐藥問題，且具有無毒無害、對環(huán)境友好、無副作用等優(yōu)勢[16-18]。

東革阿里(EurycomalongifoliaJack)為苦木科東革阿里屬的多年生木本植物，又稱馬來參、鄉(xiāng)土人參，主要分布在東南亞國家，如馬來西亞、印度尼西亞、柬埔寨、緬甸等，生長在潮濕的環(huán)境中，喜酸性砂質(zhì)土壤[19]。東革阿里有多年的藥用歷史，根部為主要的應(yīng)用部分，含有多種生物活性物質(zhì)，如苦木素類、生物堿類、類固醇化合物等，有緩解疲勞、抗瘧疾、抗腫瘤、抗菌、改善男性性功能障礙等功效[20]。有研究表明，東革阿里不定根提取物可通過影響枯草芽孢桿菌的細(xì)胞通透性起到抑菌作用[21]，但其影響菌呼吸代謝的抑菌機(jī)制尚未報(bào)道；同時(shí)，東革阿里不定根提取物對枯草芽孢桿菌抑制生物膜的作用也不清晰。因此，該試驗(yàn)用東革阿里不定根粗提物對枯草芽孢桿菌的呼吸抑制作用及其所影響的呼吸代謝途徑，以及清除枯草芽孢桿菌生物膜的作用進(jìn)行了研究，為今后相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)奠定基礎(chǔ)[22]。

1 材料與方法

1.1 植物材料及提取

參照Fan等[23]方法對東革阿里不定根進(jìn)行培養(yǎng)，將培養(yǎng)40 d后的不定根收獲、洗凈、烘干。取烘干后的不定根干品，加入70%乙醇溶液，以20 mL/g的液料比，于60 ℃條件下進(jìn)行超聲提取，經(jīng)過濾烘干獲得的粗提物用于該研究的試驗(yàn)。

1.2 供試菌種及培養(yǎng)

試驗(yàn)所應(yīng)用的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis，CGMCC 1.3358)，購自中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，將供試菌種在無菌條件下用無菌接種環(huán)將其接種于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基(牛肉膏3 g/L+蛋白胨10 g/L+氯化鈉5 g/L+瓊脂15～20 g，pH值調(diào)節(jié)至7.0～7.2)，于37 ℃下培養(yǎng)。

1.3 方法

1.3.1 東革阿里粗提物對枯草芽孢桿菌呼吸抑制率的測定

參照Liu等[24]的方式進(jìn)行試驗(yàn)，通過測定溶氧計(jì)算菌體呼吸速率。取2 mL菌液以及10 mL PBS于15 mL離心管，靜置5 min后，將溶氧電極(DO 30，上海振脈儀器設(shè)備有限公司)插入離心管中，將離心管管口密封，靜置1 min后測定其溶氧量，從而獲得初始呼吸速率R0。另取15 mL離心管，加入2 mL菌液以及10 mL PBS，各加入1 mL呼吸抑制劑作為對照組，加入粗提物使其濃度達(dá)到1 mg/L作為試驗(yàn)組，呼吸抑制劑分別為碘乙酸(IDA)、丙二酸(MAL)、十二水合磷酸三鈉(SOP)，最終濃度為500 mg/L。將溶氧電極插入離心管后，密封離心管管口，測定其溶氧量，獲得呼吸速率R1，測定呼吸抑制率IR。

式中，IR表示呼吸抑制劑以及提取物對枯草芽孢桿菌的呼吸抑制率；R0表示枯草芽孢桿菌的初始呼吸速率；R1表示經(jīng)過呼吸抑制劑以及粗提物處理后的呼吸速率。

1.3.2 粗提物對枯草芽孢桿菌呼吸疊加率的測定

為了明確提取物抑制菌呼吸代謝的具體途徑，測定菌呼吸代謝的疊加率。取2 mL菌液和10 mL PBS于15 mL離心管中，加入1 mL粗提物使其濃度達(dá)到1 mg/L，再加入3種不同的典型呼吸抑制劑0.5 mL并測定其溶氧量R2。計(jì)算疊加率SR。

式中，SR表示粗提物與典型呼吸抑制劑的疊加率；R1表示粗提物處理后的菌呼吸速率；R2表示經(jīng)過粗提物和呼吸抑制劑處理后的菌呼吸速率。

1.3.3 呼吸代謝途徑關(guān)鍵酶活性的測定

首先將1 mL菌密度為109CFU/mL和1 mL提取物加入到盛有98 mL菌培養(yǎng)液的錐形瓶中，菌液最終濃度107CFU/mL。提取物最終濃度1 mg/L。將上述菌液于37 ℃以轉(zhuǎn)速130 r/min震蕩培養(yǎng)4 h，離心機(jī)離心4 min轉(zhuǎn)速調(diào)節(jié)至5 000 r/min，棄上清液，用無菌PBS洗滌3次，進(jìn)行冰水浴超聲10 min，再于離心機(jī)以5 000 r/min離心4 min，取上清液待測。

三羧酸循環(huán)(TCA)途徑關(guān)鍵酶主要有α-酮戊二酸脫氫酶(α-KGDH)、檸檬酸合酶(CS)和胞漿異檸檬酸脫氫酶(ICDHc)。通過試劑盒測定3種酶活性，酶活性測定試劑盒購自上海源葉生物科技有限公司(中國)。根據(jù)酶活性測定試劑盒操作步驟進(jìn)行操作后測定其吸光值，通過測定412 nm處吸光值確定CS的酶活性，測定340 nm處吸光值確定α-KGDH和ICDHc的酶活性。公式如下：

α-KGDH酶活性/[nmol·min-1(104cell)-1] =△A/min× 0.65

CS酶活性/[nmol·min-1(104cell)-1]=△A/min× 0.047 5

ICDHc酶活性/[nmol·min-1(104cell)-1]=△A/min× 4.285

己糖二磷酸(EMP)途徑關(guān)鍵酶主要有磷酸果糖激酶(PFK)、己糖激酶(HK)和丙酮酸激酶(PK)3種。通過酶活性測定試劑盒測定3種酶活性，酶活性測定試劑盒購自上海源葉生物科技有限公司(中國)。根據(jù)酶活性試劑盒操作，測定340 nm處吸光值，公式如下：

PFK酶活性/[nmol·min-1(104cell)-1]=△A/min×0.225

HK酶活性/[nmol·min-1(104cell)-1]=△A/min×2.226

PK酶活性/[nmol·min-1(104cell)-1]=△A/min×5.226

1.3.4 東革阿里粗提物對枯草芽孢桿菌生物膜清除能力的測定

通過結(jié)晶紫染色法測定粗提物對枯草芽孢桿菌生物膜的清除作用，參照李小寧等[25]方法并稍作改動。具體步驟如下：將濃度為108CFU/mL的菌液200 μL加入96孔板中，于37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，形成生物膜后，在每孔加入提取物，使其在孔內(nèi)最終濃度為0.5～8 mg/mL，另有3孔中加入100 μL無菌培養(yǎng)液作為對照組，最終每孔內(nèi)含有300 μL液體。于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，棄培養(yǎng)液以及游離細(xì)菌，用PBS進(jìn)行3次洗滌，再用100 μL無水甲醇進(jìn)行固定。棄掉多余甲醇后，用100 μL 1%的結(jié)晶紫染液進(jìn)行染色，15 min后棄上層結(jié)晶紫染液，用無菌水清洗去浮色，待其干燥后用30%醋酸溶液脫色，取孔中液體于550 nm處測其吸光值，所得結(jié)果用于計(jì)算粗提物對生物膜的清除率。公式為：

式中，OD對照為未加粗提物的對照組經(jīng)染色后測定的吸光值；OD處理為經(jīng)粗提物處理后經(jīng)染色后測定的吸光值。

1.3.5 枯草芽孢桿菌生物膜內(nèi)蛋白質(zhì)以及多糖含量的測定

根據(jù)Liu等[26]的方法測定生物膜內(nèi)蛋白質(zhì)及多糖含量，通過BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白質(zhì)含量，并通過苯酚硫酸法測定多糖含量。首先在96孔板中加入200 μL濃度為108CFU/mL的菌液，于37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，待其形成生物膜后，加入100 μL粗提物，使總濃度為清除生物膜最低濃度，對照組加入100 μL無菌培養(yǎng)液。將96孔板于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。棄掉上層培養(yǎng)液，用PBS洗滌3次，再加1 mL PBS打散，經(jīng)4 ℃離心20 min后，棄上層液體，將沉淀加入1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.85%氯化鈉，于80 ℃加熱30 min，再于4 ℃離心30 min，取上清液，根據(jù)BCA蛋白定量試劑盒步驟操作測得蛋白質(zhì)含量，通過苯酚硫酸法在波長490 nm處測定多糖含量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)均進(jìn)行6次重復(fù)，數(shù)據(jù)分析使用GraphPad Prism 8軟件，SPSS 25.0軟件，鄧肯氏新復(fù)極差測驗(yàn)和Studentt檢驗(yàn)，顯著水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 東革阿里粗提物對枯草芽孢桿菌呼吸抑制率

細(xì)菌通過呼吸代謝過程產(chǎn)生能量，抑制細(xì)菌的呼吸代謝過程，會使細(xì)菌迅速凋亡，從而達(dá)到抑菌的目的。IDA、MAL、SOP是典型的呼吸抑制劑，IDA是TCA途徑的典型呼吸抑制劑，MAL為EMP途徑的典型呼吸抑制劑，十二水合磷酸為HMP途徑的典型呼吸抑制劑[27]。圖1為粗提物和3種典型呼吸抑制劑對枯草芽孢桿菌呼吸抑制率，由圖1可以看出，MAL、SOP以及粗提物均具有較高的呼吸抑制率，說明粗提物可以抑制枯草芽孢桿菌細(xì)胞的呼吸代謝作用，從而起到抑菌作用。

圖1 東革阿里不定根粗提物以及3種典型呼吸抑制劑對枯草芽孢桿菌的呼吸抑制率

2.2 東革阿里粗提物與典型呼吸抑制劑抑制枯草芽孢桿菌呼吸作用的疊加率

疊加率是衡量藥物參與細(xì)菌呼吸代謝抑制途徑重要指標(biāo)，為探明粗提物抑制枯草芽孢桿菌呼吸作用的具體途徑，測定了粗提物與典型呼吸抑制劑共同對枯草芽孢桿菌呼吸抑制作用，疊加率越低，表明其與對應(yīng)的典型呼吸抑制劑在抑制枯草芽孢桿菌的呼吸代謝的途徑越相似[28]。結(jié)果表明，粗提物與IDA和MAL的疊加率最低，可以確定粗提物是通過TCA和EMP途徑抑制枯草芽孢桿菌的呼吸代謝(圖2)。

圖2 東革阿里不定根粗提物與3種典型呼吸抑制劑對枯草芽孢桿菌的呼吸抑制的疊加率

2.3 粗提物對呼吸代謝途徑關(guān)鍵酶活性的影響

2.3.1 粗提物對TCA途徑關(guān)鍵酶活性的影響

為進(jìn)一步確定粗提物抑制枯草芽孢桿菌TCA途徑的具體關(guān)鍵酶，測定了不同關(guān)鍵酶在經(jīng)粗提物處理4 h后的酶活性。與對照組相比，CS和α-KGDH兩種酶活性沒有顯著變化，而對于ICDHc來說，粗提物處理后導(dǎo)致其酶活性降低為0，粗提物使其完全失活。由此可以說明在TCA途徑中，粗提物主要是作用于ICDHc導(dǎo)致其失活，從而影響TCA途徑的呼吸代謝過程(表1)。

表1 粗提物對TCA途徑關(guān)鍵酶的酶活性影響

2.3.2 粗提物對EMP途徑關(guān)鍵酶活性的影響

為明確粗提物影響EMP途徑的關(guān)鍵酶活性，測定了該途徑不同關(guān)鍵酶經(jīng)處理前后的酶活性。結(jié)果表明，與對照組相比，3種酶活性都有不同程度的降低，證明該粗提物可以顯著抑制這3種關(guān)鍵酶活性，從而抑制EMP途徑的呼吸代謝作用(表2)。

表2 粗提物對EMP途徑關(guān)鍵酶的酶活性影響

2.4 粗提物對枯草芽孢桿菌生物膜的清除作用

2.4.1 粗提物對枯草芽孢桿菌生物膜的清除能力

為探究東革阿里不定根粗提物對枯草芽孢桿菌生物膜的清除作用，通過結(jié)晶紫染色法測定了粗提物對枯草芽孢桿菌的清除能力。由圖3可以看出，粗提物濃度為4 mg/mL時(shí)，粗提物對枯草芽孢桿菌生物膜的清除能力達(dá)到最強(qiáng)。

圖3 東革阿里不定根粗提物對枯草芽孢桿菌生物膜的清除能力

2.4.2 東革阿里粗提物對枯草芽孢桿菌生物膜內(nèi)蛋白質(zhì)以及多糖濃度的影響

為探究粗提物對枯草芽孢桿菌生物膜內(nèi)物質(zhì)的影響，該試驗(yàn)測定了生物膜中蛋白質(zhì)以及多糖在經(jīng)粗提物處理與未經(jīng)粗提物處理的含量。結(jié)果表明，無論是蛋白質(zhì)還是多糖，在經(jīng)過粗提物處理后的濃度水平顯著低于未處理的濃度水平，由此可以得出，粗提物可以減少生物膜內(nèi)細(xì)菌分泌蛋白質(zhì)以及多糖類物質(zhì)，從而減少生物膜(圖4)。

圖4 東革阿里不定根粗提物對枯草芽孢桿菌生物膜內(nèi)蛋白質(zhì)及多糖含量影響

3 討論與結(jié)論

東革阿里中含苦木素類、生物堿類等多種活性物質(zhì)，可以緩解疲勞、抗瘧疾、抗腫瘤、抗菌等[29]，在東北亞民間常被用作藥材以及滋補(bǔ)品。目前有研究發(fā)現(xiàn)，東革阿里具有良好的抑菌效果，范明智等[21]研究發(fā)現(xiàn)，生物反應(yīng)器培養(yǎng)的東革阿里不定根能夠通過破壞細(xì)菌生物膜的完整性，從而對包括枯草芽孢桿菌在內(nèi)的多種細(xì)菌起到有效的抑制作用，在此基礎(chǔ)上，該試驗(yàn)從呼吸代謝角度探究東革阿里不定根對枯草芽孢桿菌的呼吸代謝方面的影響。試驗(yàn)結(jié)果顯示，東革阿里不定根對枯草芽孢桿菌呼吸抑制作用較強(qiáng)，主要通過TCA和EMP途徑抑制枯草芽孢桿菌的呼吸作用，并且對兩種通路的大部分關(guān)鍵酶都有明顯的抑制作用，甚至使TCA途徑的關(guān)鍵酶ICDHc完全失活。

據(jù)統(tǒng)計(jì)，有超過6成的細(xì)菌感染與生物膜相關(guān)，生物膜治理已成為醫(yī)療衛(wèi)生領(lǐng)域的重中之重，相較于傳統(tǒng)的物理清除及生物清除法，以植物源為材料的抗生物膜技術(shù)如今頗受關(guān)注，張恩恩等[30]發(fā)現(xiàn)土荊芥提取物對于幽門螺旋桿菌的生物膜形成具有抑制作用；Liu等[23]探究東革阿里不定根對金黃色葡萄球菌的抑制作用發(fā)現(xiàn)，東革阿里對金黃色葡萄球菌預(yù)先形成的生物膜有較好的清除作用。該試驗(yàn)在探究東革阿里不定根對枯草芽孢桿菌生物膜也具有較強(qiáng)的清除作用，并且探究其抑菌機(jī)制發(fā)現(xiàn)，東革阿里不定根粗提物處理后，顯著降低了生物膜中的蛋白質(zhì)以及多糖含量。

在抑菌研究中，東革阿里粗提物對東革阿里的呼吸代謝具有較強(qiáng)的抑制作用，抑制率達(dá)53.85%，通過測定粗提物與3種代謝途徑典型抑制劑的疊加率發(fā)現(xiàn)，粗提物通過TCA和EMP途徑抑制枯草芽孢桿菌的呼吸作用，通過測定這兩種通路關(guān)鍵酶活性，發(fā)現(xiàn)在TCA途徑中，粗提物主要是作用于ICDHc導(dǎo)致其活性降至0，影響TCA途徑的呼吸代謝過程；在EMP途徑中，粗提物對PFK、PK、HK 3種關(guān)鍵酶均有顯著的抑制作用。在抗生物膜研究中，東革阿里不定根粗提物對枯草芽孢桿菌生物膜的清除能力較強(qiáng)，在4 mg/mL時(shí)，生物膜清除率達(dá)到了約67%的效果。通過對其抗生物膜的機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)，粗提物可以有效減少生物膜中的蛋白質(zhì)以及多糖的濃度，從而破壞生物膜的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。

綜上所述，東革阿里不定根可以廣泛地用作一種良好的抑菌及抗生物膜藥物，為東革阿里的資源合理開發(fā)利用提供新途徑，具有廣泛研究和開發(fā)的價(jià)值。