冉艷瓊,曹 陽(yáng),黃 蕓，鮮文婷,熊 杰

(四川省生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)總站,成都 610091)

前 言

二噁英實(shí)際上是二噁英類(lèi)(Dioxins)一個(gè)簡(jiǎn)稱(chēng)，是一種在環(huán)境中可持久性存在的有機(jī)污染物(POPs)，其化學(xué)、物理、生物學(xué)降解周期較長(zhǎng)，通常需要幾十年或更長(zhǎng)時(shí)間。二噁英類(lèi)的毒性因氯原子的取代數(shù)量和取代位置不同而有差異，含有1～3個(gè)氯原子的被認(rèn)為無(wú)明顯毒性；含4～8個(gè)氯原子的有毒，其中2,3,7,8-T4CDD毒性最大(其毒性相當(dāng)于人們熟知的劇毒物質(zhì)氰化物的130倍、砒霜的900倍)[1]。再隨著氯原子取代數(shù)量的增加，其毒性又將會(huì)有所減弱。對(duì)二噁英類(lèi)的毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)時(shí)，國(guó)際上常把各同類(lèi)物折算成相當(dāng)于2,3,7,8-T4CDD的量來(lái)表示，稱(chēng)為毒性當(dāng)量(Toxic Equivalent Quantity，簡(jiǎn)稱(chēng)TEQ)。二噁英不易溶于水，極易溶于脂肪組織，可通過(guò)母乳和動(dòng)植物吸收而直接侵害人體[2]，且二噁英具有致畸、致癌、致突變效應(yīng)和生殖毒性[3]。在《斯德哥爾摩公約》已經(jīng)控制的 20 多種 POPs 中，二噁英是公認(rèn)毒性最強(qiáng)的污染物，是公約首批控制的12 種污染物之一。二噁英同時(shí)存在含量低(痕量與超痕量分析)、多組分分析、異構(gòu)體繁多，分析技術(shù)特異性高、難度大等因素[4]，全世界都急需高效的檢測(cè)手段來(lái)監(jiān)測(cè)和控制環(huán)境中的二噁英含量。

目前環(huán)境樣品中的二噁英類(lèi)檢測(cè)方法主要分為化學(xué)檢測(cè)法、生物檢測(cè)法、免疫法[5]。國(guó)際公認(rèn)的二噁英檢測(cè)方法高分辨氣相色譜-高分辨質(zhì)譜法(HRGC -HRMS)因分辨率高、檢出限低、精密度好應(yīng)用廣泛，其中美國(guó)的 EPA1613 法現(xiàn)為各國(guó)公認(rèn)的仲裁方法[6]。高分辨氣相色譜-高分辨質(zhì)譜法的主要步驟為：提取-濃縮-凈化-濃縮-定容-上機(jī)測(cè)試[7]，而這其中提取和凈化這兩步是極為關(guān)鍵，對(duì)二噁英類(lèi)物質(zhì)分析的準(zhǔn)確性起至關(guān)作用，同時(shí)不同的前處理方法，分析準(zhǔn)確度，分析周期，耗費(fèi)人力都不盡相同。而現(xiàn)階段二噁英的分析普遍存在分析前處理過(guò)程中技術(shù)難度大、周期長(zhǎng)、試劑用量大、操作安全性等相關(guān)問(wèn)題。本文主要針對(duì)高分辨氣相色譜-質(zhì)譜法分析二噁英類(lèi)物質(zhì)的前處理技術(shù)中最為關(guān)鍵的提取、凈化的不同方法進(jìn)行了綜合比較試驗(yàn)，提出更加簡(jiǎn)便、高效、準(zhǔn)確、安全的前處理技術(shù)方案，為二噁英類(lèi)物質(zhì)分析提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

本實(shí)驗(yàn)采用高分辨氣相色譜-高分辨質(zhì)譜法(HRGC/HRMS)對(duì)前處理后的樣品進(jìn)行分析。所需儀器設(shè)備有： Thermo DFS高分辨氣相色譜-質(zhì)譜儀、索式提取裝置、ASE350快速溶劑萃取儀(Thermo)、全自動(dòng)凈化儀(德國(guó)LCTech)、半自動(dòng)凈化儀、氮吹濃縮儀(Organomation)。所需試劑耗材有：多層硅膠柱(德國(guó)LCTech)、氟羅里硅土柱(德國(guó)LCTech)、活性炭柱(德國(guó)LCTech)、二氯甲烷(農(nóng)殘級(jí))、正己烷(農(nóng)殘級(jí))、甲苯(農(nóng)殘級(jí))、丙酮(農(nóng)殘級(jí))、壬烷(農(nóng)殘級(jí))、濃硫酸(優(yōu)級(jí)純)、硅藻土、中性硅膠(CNW)、活性炭、EPA1613 ISS混合標(biāo)準(zhǔn)樣品(13C-1,2,3,4-TCDD 和13C-1,2,3,7,8,9-HxCDD進(jìn)樣內(nèi)標(biāo))、EPA1613 LCS混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(含15個(gè)13C標(biāo)記的2,3,7,8-氯取代PCDD/Fs提取內(nèi)標(biāo))、EPA 1613 CS1-CS5校正標(biāo)準(zhǔn)溶液、儀器參考標(biāo)樣全氟三丁胺(FC43)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

目前環(huán)境樣品中二噁英分析的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中二噁英前處理方法方式單一和繁瑣且存在周期長(zhǎng)、試劑用量大、操作安全性等相關(guān)問(wèn)題。其具體步驟為在樣品中加入EPA1613 LCS混合標(biāo)液，使提取內(nèi)標(biāo)的加標(biāo)量為：四氯～七氯代化合物0.5ng，八氯代化合物1.0ng進(jìn)行提取，經(jīng)提取后的樣品需通過(guò)凈化去除基體干擾，將凈化后的樣品濃縮至近干，加入30μL正壬烷和5μL進(jìn)樣內(nèi)標(biāo)EPA1613 ISS(1.0ng)定容至35μL，最后采用高分辨氣相色譜-質(zhì)譜儀進(jìn)行上機(jī)分析。目前環(huán)境分析實(shí)驗(yàn)室常用提取樣品方法選用美國(guó)賽默飛DionexASE350快速溶劑萃取儀和索式提取儀兩種方式進(jìn)行提取，本實(shí)驗(yàn)采用兩種提取方法分別測(cè)定8個(gè)土壤標(biāo)準(zhǔn)樣品，比較17種二噁英類(lèi)化合物結(jié)果準(zhǔn)確度及15種二噁英類(lèi)提取內(nèi)標(biāo)回收率，綜合提出更優(yōu)的樣品提取方法。常用的凈化樣品方法有三種：一種是采用LcTech的全自動(dòng)凈化儀和成品柱，一種是采用手工填充的手動(dòng)凈化，還有一種為半自動(dòng)凈化。本實(shí)驗(yàn)室采用某垃圾焚燒廠(chǎng)周邊實(shí)際土壤樣品，經(jīng)加壓流體萃取后，采用三種凈化方法進(jìn)行比對(duì)試驗(yàn)。

快速溶劑萃取條件：二噁英快速溶劑萃條件為：萃取池壓力：1500psi、加熱溫度：150℃、預(yù)加熱平衡時(shí)間：7min、靜態(tài)萃取時(shí)間：7min、溶劑淋洗體積：100%池體積、氮?dú)獯祾邥r(shí)間：200s、靜態(tài)萃取次數(shù)：3次，萃取溶劑為甲苯約,80mL，單個(gè)萃取時(shí)間為35min以?xún)?nèi)。

索式提取條件：稱(chēng)取一定量的土壤樣品至于濾筒中，放入索氏提取管，在平底燒瓶中加入350mL甲苯溶劑，采用電爐加熱試劑循環(huán)浸提的方式，回流18～24h。

LCTech全自動(dòng)凈化條件：根據(jù)凈化柱數(shù)量可分為三柱式、四柱式凈化，以常見(jiàn)的四柱式凈化為例，第一段為多層硅膠柱，含有堿性硅膠、中性硅膠、酸性硅膠等，其中酸性硅膠柱能夠有效地吸附樣品中強(qiáng)極性化合物，多環(huán)芳香族化合物、有色物質(zhì)等，而經(jīng)過(guò)多層硅膠柱的樣品中的二噁英類(lèi)、呋喃類(lèi)化合物以及PCBs等通過(guò)正己烷將分離樣品中的PCB并吸附在第一活性炭柱上；第二段為弗羅里硅土柱，樣品經(jīng)過(guò)弗羅里硅土柱并在二氯甲烷/正己烷(1∶1,V/V)混合溶劑的作用下將PCDD/PCDF附著在第二活性炭柱上；第三段為第一活性炭柱，用二氯甲烷/正己烷(1∶1,V/V)混合溶劑洗脫部分PCB化合物，并用甲苯溶劑反沖第一活性炭柱再次分離PCB化合物，第四段為第二活性炭小柱，用甲苯溶劑反沖第二活性碳小柱洗脫P(yáng)CDD/PCDF，并收集洗脫液。整個(gè)過(guò)程全部自動(dòng)化，并由儀器精準(zhǔn)控制流量，每?jī)艋粋€(gè)樣品僅需要60～70min。

半自動(dòng)凈化條件：半自動(dòng)凈化采用成品柱，不需要手工填充凈化柱。第一步用40mL正己烷預(yù)淋洗酸性硅膠層析柱，將預(yù)淋洗好的酸性硅膠層析柱與活性炭柱串聯(lián)，并用10mL正己烷淋洗，第二步將樣品用正己烷轉(zhuǎn)移至串聯(lián)酸性硅膠層析柱/活性炭柱，每次用2mL正己烷洗滌容器(3～4次)，并將洗滌液轉(zhuǎn)移至串聯(lián)酸性硅膠層析柱/活性炭柱上，再用15mL正己烷淋洗串聯(lián)酸性硅膠層析柱/活性炭柱(棄去過(guò)柱正己烷)后，用15mL正己烷洗脫DL-PCBS和PBDES，第三步將活性炭柱與酸性硅膠層析柱分離，連接在另一空玻璃柱下方(活性炭平整面向上)，用6mL甲苯/正己烷(1∶1)洗脫DL-PCBS和PBDES，最后再將活性炭柱翻轉(zhuǎn)與空玻璃柱連接，用30mL甲苯洗脫P(yáng)CDDS/FS，收集洗脫液。全過(guò)程也需要實(shí)驗(yàn)人員把控好每一步，每批樣品凈化需要8h左右。

手工填充的手動(dòng)凈化條件：目前應(yīng)用也比較廣泛，手動(dòng)凈化需要在實(shí)驗(yàn)室自行制作填料，裝填凈化柱。各實(shí)驗(yàn)室裝填方式大致相同。本實(shí)驗(yàn)手動(dòng)凈化填充凈化分為兩大部分組成，一部分為多層硅膠柱，另一部分為活性炭柱，見(jiàn)圖1。凈化步驟為先用150mL正己烷以每秒1～2滴的速度活化多層硅膠柱，再用150mL正己烷以相同的速度進(jìn)行洗脫。洗脫以后的樣品經(jīng)濃縮待用。再30ml正己烷以每秒1～2滴的速度活化活性炭柱，用二氯甲烷/正己烷(1∶1,V/V)混合溶劑將多層硅膠洗脫濃縮后的樣品進(jìn)行再次洗脫，翻轉(zhuǎn)活性炭柱后再用50mL甲苯洗脫二噁英。全程均需要實(shí)驗(yàn)人員把控好每一步，每批樣品凈化需要8h左右。

圖1 手動(dòng)填充凈化柱示例Fig.1 Example of manually filled purification column

2 結(jié)果與討論

2.1 快速溶劑萃和索式提取兩種樣品提取方法的綜合比較

按照快速溶劑萃取條件和索式提取條件，對(duì)土壤標(biāo)準(zhǔn)樣品分別測(cè)定8次，用分析結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)樣品的相對(duì)誤差值來(lái)評(píng)價(jià)提取方法的正確度，如圖2；用15種二噁英類(lèi)提取內(nèi)標(biāo)回收率來(lái)評(píng)價(jià)提取方法的提取效率，如圖3。

圖2 兩種提取方式正確度比較Fig.2 The accuracy comparison of the two extraction methods

圖3 兩種提取方式二噁英類(lèi)物質(zhì)提取內(nèi)標(biāo)回收率比較Fig.3 Comparison of internal standard recovery of dioxins by two extraction methods

由圖2可見(jiàn)，采用快速溶解萃取或索氏提取兩種提取方法對(duì)二噁英類(lèi)土壤標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行測(cè)定準(zhǔn)確度分別在-0.8～4.5和-9.6～19.3之間，均在±20%以?xún)?nèi)。由圖3可見(jiàn)，提取內(nèi)標(biāo)的回收率大小并無(wú)明顯區(qū)別且均在72%以上。但是采用美國(guó)賽默飛DionexASE350快速溶劑萃取儀，試劑用量少(小于80mL)，可連續(xù)提取幾十個(gè)樣品，且單個(gè)樣品萃取時(shí)間短(35min以?xún)?nèi))。

綜上所述，加壓流體萃取和索式提取兩種方式的提取效率基本一致，但加壓流體萃取相比索氏提取試劑用量更少，前處理周期更短，實(shí)驗(yàn)室安全性能更高。

2.2 LCTech全自動(dòng)凈化方法、手工填充的手動(dòng)凈化方法、半自動(dòng)凈化方法的綜合比較

以實(shí)際土壤樣品為例經(jīng)提取后的樣品按照全自動(dòng)凈化、手動(dòng)凈化及半自動(dòng)凈化分別測(cè)定8個(gè)平行樣品，以15種二噁英提取內(nèi)標(biāo)回收率測(cè)定均值來(lái)評(píng)價(jià)凈化方法的準(zhǔn)確度，如圖4；以質(zhì)譜圖和FC43提取離子圖的評(píng)價(jià)凈化方法的凈化效果，三種凈化方法的質(zhì)譜圖和FC43提取離子圖均如圖5、圖6。

圖4 三種凈化方式15種同位數(shù)標(biāo)記二噁英內(nèi)標(biāo)回收率對(duì)比Fig.4 The internal recovery comparison of 15 isotopes labelling dioxin by three purification methods

由圖4可見(jiàn)：采用全自動(dòng)凈化時(shí)15種同位數(shù)標(biāo)記二噁英提取內(nèi)標(biāo)回收率在79%～107%之間，五氯代二苯并-對(duì)-二噁英和六氯代二苯并-對(duì)-二噁英的回收率要優(yōu)于其他物質(zhì)；采用手動(dòng)凈化

1—2,3,7,8-T4CDF、13C122,3,7,8-T4CDF；2—13C121,2,3,4-T4CDF；3—2,3,7,8-T4CDD、 13C12-2,3,7,8-T4CDD；4—1,2,3,7,8-P5CDF、13C121,2,3,7,8-P5CDF；5—2,3,4,7,8-P5CDF、13C122,3,4,7,8-P5CDF；6—1,2,3,7,8-P5CDD、13C121,2,3,7,8-P5CDD；7— 1,2,3,4,7,8-H6CDF、13C12-1,2,3,4,7,8-H6CDF；8—1,2,3,6,7,8-H6CDF、13C12-1,2,3,6,7,8- H6CDF；9—2,3,4,6,7,8- H6CDF、13C12-2,3,4,6,7,8- H6CDF；10—1,2,3,4,7,8-H6CDD、13C12-1,2,3,4,7,8-H6CDD；11—1,2,3,6,7,8-H6CDD、13C12-1,2,3,6,7,8-H6CDD；12—1,2,3,7,8,9-H6CDD、13C12-1,2,3,7,8,9-H6CDD；13—1,2,3,7,8,9-H6CDF、13C12-1,2,3,7,8,9-H6CDF；14—1,2,3,4,6,7,8-H7CDF、13C12-1,2,3,4,6,7,8-H7CDF；15—1,2,3,4,6,7,8-H7CDD、13C12-1,2,3,4,6,7,8-H7CDD；16—1,2,3,4,7,8,9-H7CDF、13C12-1,2,3,4,7,8,9-H7CDF；17—OCDD、13C12-OCDD；18—OCDF圖5 高分辨氣相色譜-高分辨質(zhì)譜法(HRGC-HRMS)測(cè)定質(zhì)譜圖Fig.5 The mass spectrum by HRGC-HRMS

圖6 高分辨氣相色譜-高分辨質(zhì)譜法(HRGC -HRMS)測(cè)定FC43提取離子圖Fig.6 FC43 Extracted ion diagram by HRGC-HRMS

時(shí)同位數(shù)標(biāo)記二噁英內(nèi)標(biāo)回收率在63%～96%之間，五氯代二苯并-對(duì)-二噁英的回收率要優(yōu)于其他物質(zhì)；采用半自動(dòng)凈化時(shí)二噁英類(lèi)提取內(nèi)標(biāo)回收率在63%～83%之間。因此采用圖5可見(jiàn)，通過(guò)三種凈化方式后的樣品分析后均物質(zhì)峰分離度好，無(wú)拖尾峰；由圖6可見(jiàn)，提取離子圖基線(xiàn)平順、無(wú)負(fù)峰、無(wú)突出峰、雜質(zhì)較少。

綜上所訴三種凈化方式的凈化效果程度一致，但全自動(dòng)凈化方式的回收率整體上優(yōu)于手動(dòng)凈化和半自動(dòng)凈化，且全自動(dòng)凈化耗時(shí)較短，不需要過(guò)多的人工操作，對(duì)于經(jīng)費(fèi)預(yù)算足且分析技術(shù)員缺乏的單位是較好的一種前處理方式，而手動(dòng)凈化和半自動(dòng)凈化的回收率基本接近，原因可能是全自動(dòng)凈化是采用儀器精準(zhǔn)控制活化及洗脫的流速和壓力，成品填充柱的填充松緊度也相對(duì)緊實(shí)及均勻。而手動(dòng)凈化和半自動(dòng)凈化均由操作人員自行調(diào)節(jié)活化及控制洗脫的流速和壓力，會(huì)因?yàn)椴煌僮髡呤炀毘潭榷a(chǎn)生的較大的系統(tǒng)誤差，同時(shí)實(shí)驗(yàn)室自行填充的凈化柱也會(huì)受不同操作者的影響較大。

3 結(jié) 論

本文通過(guò)對(duì)用高分辨氣相色譜-高分辨質(zhì)譜法(HRGC/HRMS)分析環(huán)境樣品中實(shí)驗(yàn)室常用的幾種前處理方法進(jìn)行充分的比對(duì)試驗(yàn)，試驗(yàn)表明采用快速溶解萃取和全自動(dòng)凈化方法相結(jié)合的方式進(jìn)行前處理，操作簡(jiǎn)單、前處理效率高、數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性高，能夠更簡(jiǎn)便、高效、準(zhǔn)確、安全的進(jìn)行環(huán)境樣品中二噁英類(lèi)物質(zhì)的前處理。為環(huán)境類(lèi)樣品二噁英分析的前處理提供技術(shù)方案，極大的彌補(bǔ)了行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中前處理方式單一的缺陷，為廣泛的開(kāi)展二噁英分析工作，推進(jìn)二噁英技術(shù)研發(fā)，改進(jìn)二噁英類(lèi)污染監(jiān)測(cè)技術(shù)起到重要的支撐作用，從而為進(jìn)一步的二噁英綜合防治奠定更加堅(jiān)實(shí)的技術(shù)基礎(chǔ)。