宋艷華， 胡 波， 范志宇， 魏后軍， 陳萌萌， 仇汝龍， 徐為中， 王 芳

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用生物制品工程重點(diǎn)實驗室，江蘇南京 210014)

兔出血癥病毒(rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV)屬于杯狀病毒科兔病毒屬。該病毒引起的兔出血癥以高感染率和死亡率為特征，嚴(yán)重阻礙養(yǎng)兔業(yè)發(fā)展，并對公共衛(wèi)生安全存在潛在威脅。RHDV分為經(jīng)典毒株GI.1(RHDV1)和變異毒株GI.2(RHDV2)2種基因型，GI.1又分為GI.1a、GI.1b、GI.1c和GI.1d等4種亞型。2010年 GI.2 首先在法國暴發(fā)，隨后在歐洲、非洲、澳大利亞和美洲流行，且RHDV2有逐漸替代經(jīng)典RHDV毒株成為主要流行毒株的趨勢。OIE認(rèn)定RHDV2型毒株為兔出血癥病毒的第二個血清型。2020年筆者所在團(tuán)隊首先發(fā)現(xiàn)并報道了GI.2(RHDV2)在我國暴發(fā)，該毒株與中國GI.1型RHDV毒株的同源性低于85%，在致病性方面，與RHDV1相比，RHDV2更具危害性，不僅能夠感染不同日齡的家兔，還能感染不同品種的野兔，感染兔病死率可達(dá)90%。在遺傳特性及抗原性方面，RHDV2與RHDV1也存在較大差異，傳統(tǒng)毒株的疫苗對新型RHDV2毒株的交叉保護(hù)作用較弱，自2020年至今，RHDV2已在我國廣泛流行，嚴(yán)重危害養(yǎng)兔業(yè)。本研究獲得表達(dá)我國RHDV2 SC毒株VP60蛋白的重組桿狀病毒，并以該毒種為疫苗毒種研制獲得RHDV2 SC株基因工程疫苗。

1 材料與方法

1.1 菌毒種

兔出血癥病毒2型SC株(GenBank No. MT383749)和兔出血癥病毒1型WF株，由筆者所在實驗室鑒定、保存；大腸桿菌DH10Bac、Sf9昆蟲細(xì)胞由筆者所在實驗室保存。

1.2 主要試劑

總RNA提取試劑RNAiso Regent、AMV反轉(zhuǎn)錄酶、RⅠ酶、dⅢ酶購自大連寶生物工程有限公司；培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基IB905；RHDV單克隆抗體6B3由筆者所在實驗室保存。

1.3 RHDV2 VP60基因的擴(kuò)增

根據(jù)兔出血癥病毒2型SC株(GenBank No. MT383749)的基因序列，設(shè)計引物序列：設(shè)計合成上游引物P1：5′-A T A G A A T T C A T G G A G G G C A A A G C C C G C-3′；下游引物P2：5′-G C A A G C T T T C A G A C A T A A G A A A A A C-3′。上游引物引入RⅠ酶切位點(diǎn)，下游引物引入dⅢ酶切位點(diǎn)。抽提RHDV2的病毒RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，并以cDNA為模板，利用上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的基因，最終利用核酸電泳鑒定目的條帶。

1.4 重組轉(zhuǎn)移載體pFastBacTM1-RHDV2-VP60的構(gòu)建及鑒定

利用RⅠ和dⅢ分別酶切pFastBac1和 目的基因，T連接酶將載體與目的基因進(jìn)行連接，連接后產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α，涂布平板，挑取單菌落，抽提重組質(zhì)粒，并對其進(jìn)行雙酶切鑒定，最終獲得含有目的基因的重組轉(zhuǎn)移載體，命名為：pFastBac1-RHDV2-VP60。

1.5 重組穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

將上述獲得的重組轉(zhuǎn)移載體轉(zhuǎn)化至DH10Bac中，取適量培養(yǎng)菌液涂于含有卡那霉素、慶大霉素、四環(huán)素以及-和IPTG的平板上，培養(yǎng)2 d后，挑取白色的單菌落，再次接種相同條件平板上進(jìn)行菌落純化，再次挑取白色單菌落，接種于含卡那霉素、慶大霉素和四環(huán)素的液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 振搖培養(yǎng)24 h，抽提重組桿狀病毒穿梭質(zhì)粒，并以通用pUC/M13上、下游引物對質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定，命名為Bacmid-RHDV2-。

1.6 重組RHDV2 VP60桿狀病毒的獲得

利用轉(zhuǎn)染試劑將Bacmid-RHDV2-VP60轉(zhuǎn)染生長狀態(tài)約80%的單層昆蟲細(xì)胞，培養(yǎng)3 d，逐日觀察病變情況，待細(xì)胞出現(xiàn)典型病變后，收獲細(xì)胞培養(yǎng)物，獲得重組桿狀病毒原液。

1.7 重組RHDV2 VP60蛋白的表達(dá)及鑒定

1.7.1 Western blot鑒定 對制備獲得的重組蛋白表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)印和免疫印跡分析，并以接種野生型桿狀病毒的細(xì)胞培養(yǎng)物為空白對照，利用抗RHDV2特異性單抗6B3為一抗，羊抗鼠HRP-IgG為二抗，對表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行Western blot鑒定。

1.7.2 血凝效價檢測 對制備獲得的重組蛋白表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行血凝效價檢測，按照紅細(xì)胞凝集試驗96孔試驗操作測定重組蛋白的血凝效價。

1.7.3 電鏡觀察 對制備獲得的重組蛋白表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化，將樣品置于銅網(wǎng)靜置2 min，再加入2%磷鎢酸染液進(jìn)行固定，最后利用透射電鏡觀察和拍照。

1.8 RHDV2 SC株VP60基因工程疫苗的制備

利用懸浮培養(yǎng)的昆蟲細(xì)胞，待細(xì)胞生長為對數(shù)生長期時，接種重組桿狀病毒，觀察細(xì)胞生長狀態(tài)和病變進(jìn)程，病變細(xì)胞數(shù)量達(dá)約85%時取樣，利用凝集試驗和Western blot方法對重組蛋白進(jìn)行鑒定。根據(jù)血凝效價水平，取適量重組蛋白，并按照抗原 ∶氫氧化鋁膠質(zhì)量比9 ∶1配制疫苗，最終獲得RHDV2 SC株基因工程疫苗。用同樣的方法制備抗原含量相同的傳統(tǒng)RHDV WF株基因工程疫苗，用于評價交叉保護(hù)作用。

1.9 疫苗的免疫效力評價

選用兔出血癥病毒抗原、抗體均為陰性的2～3月齡家兔60只，設(shè)置免疫4組，對照2組，10只/組。取免疫組2組，對照組1組，分別接種RHDV2 SC株基因工程疫苗1.0 mL/只，傳統(tǒng)RHDV WF株基因工程疫苗1.0 mL/只，對照接種生理鹽水1.0 mL/只，分別于免疫后21 d，頸部皮下注射兔出血癥病毒2型SC株1.0 mL(含病毒1 000 LD)，觀察7 d。另取免疫組2組，對照組1組，分別接種RHDV2 SC株基因工程疫苗 1.0 mL/只，傳統(tǒng)RHDV WF株基因工程疫苗1.0 mL/只，對照接種生理鹽水1.0 mL/只，分別于免疫后21 d，頸部皮下注射兔出血癥病毒1型WF株1.0 mL(含病毒 1 000 LD)，觀察7 d。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組轉(zhuǎn)移載體的酶切鑒定

利用PCR擴(kuò)增獲得RHDV2-基因(圖1)，并成功克隆至pFastBac1質(zhì)粒中。構(gòu)建成功重組質(zhì)粒pFastBac1-SC-VP60，雙酶切鑒定結(jié)果顯示，分別以RⅠ和dⅢ進(jìn)行酶切，結(jié)果顯示，酶切后出現(xiàn)4 800 bp和1 740 bp左右的2個片段(圖2)，說明重組轉(zhuǎn)移載體構(gòu)建成功。

2.2 重組穿梭質(zhì)粒的PCR鑒定

利用重組Bacmid DNA為模板，利用pUC/M13上、下游引物對重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示擴(kuò)增產(chǎn)物大小約為4 300 bp (陽性大小為2 560 bp+目的基因)，證明轉(zhuǎn)座成功，重組穿梭質(zhì)粒Bacmid-SC-VP60構(gòu)建成功(圖3)。

2.3 重組兔出血癥病毒2型VP60桿病毒的獲得

將重組穿梭質(zhì)粒Bacmid-SC-VP60轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞，培養(yǎng)3 d后，逐日觀察病變情況，直至細(xì)胞出現(xiàn)典型變大變圓的病變特征，同時對照細(xì)胞正常生長時，收獲重組兔出血癥病毒2型VP60桿狀病毒，命名為rBAC-RHDV2-VP60株。

2.4 重組兔出血癥病毒2型VP60桿狀病毒的鑒定

2.4.1 Western blot鑒定 以抗RHDV2 特異性單抗6B3為一抗，結(jié)果提示重組桿狀病毒接種昆蟲細(xì)胞后，表達(dá)獲得了特異性重組蛋白VP60，大小為 60 ku(圖4)。同時，接種野生型桿狀病毒的細(xì)胞產(chǎn)物無特異性條帶，結(jié)果提示VP60蛋白獲得有效表達(dá)。

2.4.2 紅細(xì)胞凝集效價測定 接種重組兔出血癥病毒2型VP60桿狀病毒后收獲細(xì)胞培養(yǎng)物，測定紅細(xì)胞凝集效價，結(jié)果顯示，表達(dá)獲得的重組蛋白對人的紅細(xì)胞凝集效價結(jié)果為1 ∶4 096。

2.4.3 電鏡觀察 重組桿狀病毒接種昆蟲細(xì)胞后，表達(dá)獲得高水平的重組蛋白，該蛋白可形成大小約36 nm、形態(tài)和結(jié)構(gòu)類似天然病毒RHDV2的病毒樣顆粒(圖5)。

2.5 RHDV2 SC株VP60基因工程疫苗的免疫效力檢測

利用RHDV2 SC株基因工程疫苗和傳統(tǒng)RHDV WF株基因工程疫苗分別免疫實驗兔，免疫后21 d，攻毒兔出血癥病毒2型SC株1.0 mL(含病毒1 000 LD)，結(jié)果(表1)顯示，對照組兔全部死亡，免疫RHDV2 SC株基因工程疫苗兔全部健康存活，免疫傳統(tǒng)RHDV WF株基因工程疫苗兔死亡6只，保護(hù)率僅為40%。

表1 疫苗免疫保護(hù)效果檢測(SC株攻毒)

免疫后21 d，攻毒兔出血癥病毒1型WF株 1.0 mL(含病毒1 000 LD)，結(jié)果(表2)顯示，免疫傳統(tǒng)RHDV WF株基因工程疫苗兔全部健康存活，對照組兔全部死亡；免疫RHDV2 SC株基因工程疫苗兔死亡7只，保護(hù)率僅為30%。 結(jié)果說明RHDV2 SC株基因工程疫苗能夠有效保護(hù)兔出血癥病毒2型SC株的攻擊，而傳統(tǒng)RHDV型WF株疫苗不能對國內(nèi)流行毒株RHDV2 SC毒株產(chǎn)生有效的免疫保護(hù)，RHDV2 SC株基因工程疫苗也不能對國內(nèi)傳統(tǒng)RHDV毒株產(chǎn)生有效的免疫保護(hù)，兩型毒株間交叉保護(hù)作用較低。

表2 疫苗免疫保護(hù)效果檢測(WF株攻毒)

3 討論與結(jié)論

當(dāng)前新型RHDV2毒株已經(jīng)在全國多地流行和暴發(fā)，變異毒株與RHDV傳統(tǒng)毒株在遺傳特性、免疫保護(hù)相關(guān)基因、對宿主的易感性等方面均發(fā)生了高度的變異，新型毒株能夠逃逸傳統(tǒng)毒株誘導(dǎo)的宿主免疫應(yīng)答，且與RHDV傳統(tǒng)毒株相比，新型毒株感染宿主譜更廣，并出現(xiàn)了跨宿主傳播的現(xiàn)象。RHDV具有高度變異的特點(diǎn)，同時也具有毒株間高頻的基因重組特性，因此，該病毒對公共衛(wèi)生安全存在重大的潛在威脅，加強(qiáng)病毒的監(jiān)測對維護(hù)養(yǎng)兔生產(chǎn)和公共衛(wèi)生安全具有重要的意義。

兔出血癥以高發(fā)病率高死亡率為特征，死亡率高達(dá)90%。自2010年RHDV2首次在法國報道后，研究已證實經(jīng)典型RHDV的疫苗不能夠?qū)HDV2毒株提供有效的交叉保護(hù)作用，因此急需研制高效的針對我國流行毒株RHDV2型的疫苗。研究構(gòu)建重組RHDV2 SC毒株VP60桿狀病毒，并以此重組桿狀病毒為疫苗毒種，制備獲得到了兔RHDV2 SC株基因工程疫苗。疫苗的免疫效力實驗結(jié)果顯示，RHDV2 SC株基因工程疫苗對RHDV2的保護(hù)效力為100%，具有良好的免疫效力。然而免疫傳統(tǒng)RHDV WF株基因工程疫苗的保護(hù)率僅為40%，本研究研制的基因工程疫苗對防控我國目前流行的RHDV2型毒株方面具有重要的意義，能夠保證我國家兔產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。