吳 濤，楊 柳，聶山茂，張 楊，張 鑫

（瀘州市人民醫(yī)院肝膽外科，四川瀘州 646000）

肝細(xì)胞癌所具有的病變進(jìn)展快、預(yù)后差等特點(diǎn)，主要與腫瘤的高增殖活性、高轉(zhuǎn)移率及復(fù)發(fā)率有關(guān)[1]。從基因調(diào)控角度研究肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，對其基礎(chǔ)研究和臨床防治均有重要價(jià)值[2]。微小RNA（microRNAs,miRNAs）作為表觀遺傳因子可在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控靶基因調(diào)節(jié)腫瘤的形成和進(jìn)展[3]。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA, lncRNA）是指超過200bp單核苷酸序列的統(tǒng)稱，不具有編碼蛋白的功能，可作為miRNAs的上游調(diào)控因子[4]。本研究應(yīng)用生物信息分析篩選出可能在肝細(xì)胞癌中異常表達(dá)的長鏈非編碼RNA小核仁RNA宿主基因16（small nucleolar RNA host gene 16，SNHG16）作為研究對象，篩選出其下游有結(jié)合位點(diǎn)的miR-141-3p進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，關(guān)注SNHG16介導(dǎo)miR-141-3p/FOXJ3對肝細(xì)胞癌細(xì)胞增殖的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料

人肝細(xì)胞癌細(xì)胞株（Hep-3B、Huh7）和人正常肝細(xì)胞株（HL-7702）均購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，RPMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清均購自美國Gibico公司，Lipofectaminie2000和TRIzol均購自美國Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自廣州復(fù)能基因有限公司，CCK-8試劑盒購自上海漢恒生物科技有限公司，總蛋白提取試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)公司，F(xiàn)OXJ3、β-Actin購自蘇州睿瀛生物技術(shù)公司，二抗和DAB購自武漢博士德生物技術(shù)公司，Dual Luciferase Reporter基因?qū)嶒?yàn)試劑盒購天北京普洛麥格生物技術(shù)有限公司。PCR儀為美國伯樂公司生產(chǎn)。

1.2 臨床資料

選擇2019年1月~2020年12月在瀘州市人民醫(yī)院確診為肝細(xì)胞癌并行手術(shù)治療的患者作為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）經(jīng)病理醫(yī)師確診，并符合WHO中的病理診斷標(biāo)準(zhǔn)；（2）臨床隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）雙原發(fā)癌或多原發(fā)癌；（2）伴有風(fēng)濕免疫性疾??；（3）病理形態(tài)中伴有其它類型惡性腫瘤成份者。共選擇49例，其中男26例，女23例，年齡34~79歲，中位年齡56歲，其中高分化14例，中分化19例，低分化16例。留取術(shù)后腫瘤組織和距腫物邊緣＞3cm的癌旁肝組織（-80℃冰箱中凍存）。研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) Hep-3B、Huh7和HL-7702細(xì)胞株復(fù)蘇后，在37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中應(yīng)用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，在細(xì)胞密度約70%~90%時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)。

1.3.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染分組 選擇生長狀態(tài)好的Hep-3B、Huh7細(xì)胞作為空白對照組（未行轉(zhuǎn)染的細(xì)胞）。轉(zhuǎn)染pc-DNA3.1建立空載體轉(zhuǎn)染組，轉(zhuǎn)染pc-DNA3.1-SNHG16建立pc-DNA3.1-SNHG16組、轉(zhuǎn)染pc-DNA3.1-SNHG16-siRNA建立si-SNHG16組、轉(zhuǎn)染 miR-141-3p inhibitor建立miR-141-3p inhibitor組、轉(zhuǎn)染miR-141-3p mimic建立miR-141-3p mimic組、轉(zhuǎn)染pc-DNA3.1-FOXJ3-siRNA建立si-FOXJ3組。實(shí)驗(yàn)均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）法檢測SNHG16和miR-141-3p的表達(dá)。TRIzol提取總RNA，檢測其純度。逆轉(zhuǎn)錄法獲得總的cDNA。SNHG16引物上游：5'-GCTAACGTGTAC TAAACGAGTTCCGCT-3'，下游：5'-CCAGTGTACT GCCCAAAGACTTAAAACG-3'。miR-141-3p引物上游：5'-GTGAACATTCATGTTGCCGTCGG-3'，下游：5'-GGTGCAACGGTCCGACGTTATTG-3'。以U6為內(nèi)參，上游：5'-CTCGTTCTTCGCACATATACACA-3'，下游：5'-AACGGTGCAGCCGAGGTATCGT-3'。程序設(shè)定：95℃預(yù)變性30s；變性95℃ 30s，退火60℃ 10s，延伸72℃ 30s，共35個(gè)循環(huán)，72℃延伸5min。結(jié)果以2-ΔΔCt表示。

1.3.4 CCK-8實(shí)驗(yàn) 取對數(shù)生長期的細(xì)胞，洗滌后用0.25%的胰蛋白酶水化，吹打混勻，調(diào)整細(xì)胞密度至3.0×104個(gè)/ml。應(yīng)用96孔板（板的最外圍不加細(xì)胞懸液），孔內(nèi)接種約5000個(gè)細(xì)胞（各3個(gè)復(fù)孔）。進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，在24h、48h、72h和96h時(shí)分別加入10μl 的CCK-8試劑，1h后用酶標(biāo)儀測定于450nm處的吸光度值（OD值），繪制細(xì)胞活力曲線。

1.3.5 Western blot實(shí)驗(yàn) 提取總蛋白后測定蛋白濃度，SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，加一抗、二抗、ECL化學(xué)發(fā)光法顯示蛋白條帶，以β-Actin為內(nèi)參，應(yīng)用Image J軟件測量蛋白條帶灰度值。

1.3.6 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 構(gòu)建含有野生型SNHG16的質(zhì)粒（WT-SNHG16）和突變型SNHG16的質(zhì)粒（MT-SNHG16），分別同miR-141-3p mimic、miR-141-3p NC進(jìn)行共轉(zhuǎn)染；構(gòu)建含有野生型FOXJ3的質(zhì)粒（WT-FOXJ3）和突變型FOXJ3（MT-FOXJ3）的質(zhì)粒，分別同miR-141-3p mimic、miR-141-3p NC進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，觀察熒火蟲發(fā)光值和海腎發(fā)光值（對照）。相對熒光素酶活性=熒火蟲發(fā)光值/海腎發(fā)光值。

1.3.7 免疫組化實(shí)驗(yàn) 肝細(xì)胞癌組織和癌旁肝組織均經(jīng)常規(guī)福爾馬林固定、脫水、石蠟包埋、切片后應(yīng)用免疫組化二步法檢測組織中FOXJ3的表達(dá)，DAB顯色。FOXJ3的表達(dá)定位于細(xì)胞核，棕黃色為陽性，選擇5個(gè)高倍視野（400倍）計(jì)算百分率，取平均值，以≥25%為陽性，以＜25%為陰性，計(jì)算陽性率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SAS 6.12軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，定量資料應(yīng)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較行t檢驗(yàn)，多組間比較行方差分析（SNK法行兩兩比較），率的比較行卡方檢驗(yàn)，應(yīng)用Spearman相關(guān)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 生物信息分析結(jié)果

生物信息分析顯示,SNHG16和miR-141-3p、miR-141-3p和FOXJ3具有可能結(jié)合的堿基序列。見圖1、2。

圖1 SNHG16和miR-141-3p可能結(jié)合的位點(diǎn)(Starbase)

圖2 miR-141-3p和FOXJ3可能結(jié)合的位點(diǎn)(TargetScan)

2.2 肝癌細(xì)胞株與正常肝細(xì)胞株中SNHG16、miR-141-3p和FOXJ3表達(dá)的比較

qRT-PCR法檢測SNHG16和miR-141-3p的表達(dá)，Western blot法檢測FOXJ3的表達(dá)。結(jié)果顯示，肝癌Hep-3B細(xì)胞株中SNHG16（1.45±0.19vs1.01±0.21，t=3.54，P=0.012）和FOXJ3（1.26±0.21vs0.85±0.02，t=3.98，P=0.009）的表達(dá)量明顯高于正常肝細(xì)胞株，miR-141-3p的表達(dá)量明顯低于正常肝細(xì)胞株（0.89±0.13vs1.03±0.04，t=2.57，P=0.030）。肝癌Huh7細(xì)胞株中，SNHG16（1.56±0.25vs1.04±0.26，t=3.59，P=0.011）和FOXJ3（1.19±0.16vs0.77±0.09，t=2.15，P=0.043）的表達(dá)量明顯高于正常肝細(xì)胞株，miR-141-3p的表達(dá)明顯低于正常肝細(xì)胞株（0.81±0.15vs1.06±0.12，t=2.34，P=0.039）。見圖3。

圖3 Western blot檢測不同細(xì)胞系中FOXJ3的表達(dá)

2.3 CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Hep-3B細(xì)胞株：與空白對照組和空載體轉(zhuǎn)染組比較，pc-DNA3.1-SNHG16組細(xì)胞活性在48h明顯升高（0.59±0.10vs0.45±0.03vs0.42±0.09，F(xiàn)=3.11，P=0.039），si-SNHG16組細(xì)胞增殖活性在48h時(shí)明顯降低（0.32±0.03vs0.45±0.03vs0.42±0.09，F(xiàn)=3.46，P=0.031），均持續(xù)至96h（P＜0.05）。Huh7細(xì)胞株：與空白對照組和空載體轉(zhuǎn)染組比較，pc-DNA3.1-SNHG16組細(xì)胞活性在48h明顯升高（0.56±0.11vs0.44±0.06vs0.43±0.11，F(xiàn)=3.47，P=0.027），si-SNHG16組細(xì)胞增殖活性在48h時(shí)明顯降低（0.33±0.05vs0.44±0.06vs0.43±0.11，F(xiàn)=3.21，P=0.037），均持續(xù)至96h（P＜0.05）。見圖4。

圖4 CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示SNHG16和miR-141-3p、miR-141-3p和FOXJ3具有靶向關(guān)系。見圖5。

圖5 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

2.5 挽救實(shí)驗(yàn)

為了證實(shí)SNHG16通過miR-141-3p/FOXJ3影響肝細(xì)胞癌的增殖，對肝癌Hep-3B細(xì)胞株進(jìn)行了沉默miR-141-3p的挽救實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示miR-141-3p inhibitor與si-SNGH16、si-FOXJ3與miR-141-3p inhibitor細(xì)胞增殖活性均明顯高于轉(zhuǎn)染si-SNHG16或si-FOXJ3（P＜0.05），即沉默miR-141-3p可部分逆轉(zhuǎn)沉默SNHG16和FOXJ3對細(xì)胞增殖的抑制作用。見圖6。

圖6 挽救實(shí)驗(yàn)（Hep-3B細(xì)胞株）

2.6 肝細(xì)胞癌和癌旁肝組織中SNHG16和miR-141-3p表達(dá)量的比較

肝細(xì)胞癌組織中SNHG16的表達(dá)量明顯高于癌旁肝組織，miR-141-3p的表達(dá)量明顯低于癌旁肝組織。見表1。

表1 肝細(xì)胞癌和癌旁肝組織中SNHG16和miR-141-3p表達(dá)量的比較

2.7 肝細(xì)胞癌和癌旁肝組織中FOXJ3陽性率的比較

肝細(xì)胞癌中FOXJ3表達(dá)的陽性率明顯高于癌旁肝組織中表達(dá)的陽性率。見表2、圖7。2.8 肝細(xì)胞癌中SNHG16、miR-141-3p、SNHG16、FOXJ3和Ki67指數(shù)表達(dá)的相關(guān)性

表2 肝細(xì)胞癌和癌旁肝組織中FOXJ3陽性率的比較

圖7 肝細(xì)胞癌和癌旁肝組織中FOXJ3的表達(dá)

FOXJ3在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)范圍是20%~80%，平均值為47%，Ki67在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)范圍是10%~70%，平均值為42%。Spearman相關(guān)分析顯示肝細(xì)胞癌中SNHG16與miR-141-3p（r=-0.67，P=0.032）、miR-141-3p 與FOXJ3（r=-0.69，P=0.030）均呈負(fù)相關(guān)性，SNHG16與FOXJ3（r=0.62，P=0.039）、FOXJ3與Ki67（r=0.74，P=0.002）均呈正相關(guān)性。Ki67的表達(dá)見圖8，相關(guān)分析見圖9。

圖8 Ki67的表達(dá)（IHC×200）

圖9 相關(guān)分析圖

3 討論

LncRNA由對應(yīng)的基因轉(zhuǎn)錄形成，具有5’帽子和ploy尾巴，通過剪切形成的成熟體，參與劑量補(bǔ)償效應(yīng)、表觀遺傳學(xué)調(diào)控、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)和細(xì)胞分化調(diào)控[5]。ceRNA機(jī)制中，LncRNA通過競爭性結(jié)合miRNAs調(diào)控其對應(yīng)的靶基因[6,7]。FOXJ3是miR-141-3p下游的靶基因，其高表達(dá)與肝細(xì)胞癌的增殖有關(guān)[8]。FOXJ3蛋白與目標(biāo)啟動(dòng)子有互補(bǔ)基序，其結(jié)合后它們的C末端反式激活結(jié)構(gòu)域就會(huì)啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄，根據(jù)被招募相關(guān)輔助因子的范圍發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活或抑制作用，是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖的基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)充分利用生物信息技術(shù)，經(jīng)篩選、分析發(fā)現(xiàn)，SNHG16在肝細(xì)胞癌中可能有促進(jìn)作用，并發(fā)現(xiàn)SNHG16和miR-141-3p、miR-141-3p和FOXJ3具有可能結(jié)合的堿基序列。本實(shí)驗(yàn)檢測到SNHG16和FOXJ3在人肝癌細(xì)胞株和人肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)均升高，miR-141-3p的表達(dá)下調(diào)，提示3者異常表達(dá)在肝細(xì)胞癌形成中有重要價(jià)值。細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染pc-DNA3.1-SNHG16細(xì)胞的增殖活性在48h時(shí)明顯升高，轉(zhuǎn)染si-SNHG16細(xì)胞的增殖活性明顯降低，提示SNHG16是調(diào)節(jié)肝細(xì)胞癌細(xì)胞增殖的重要促進(jìn)因子，此結(jié)果經(jīng)組織學(xué)實(shí)驗(yàn)中檢測到SNHG16與Ki67正相關(guān)性得到間接證實(shí)。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)直接證實(shí)了SNHG16和miR-141-3p、miR-141-3p和FOXJ3具有靶向關(guān)系，亦證實(shí)了生信分析的結(jié)果，提示SNHG16可能與miR-141-3p/FOXJ3通路具有調(diào)控關(guān)系。FOXJ3高表達(dá)與肝細(xì)胞癌的增殖有關(guān)，是重要的調(diào)控細(xì)胞分裂的轉(zhuǎn)錄因子[9,10]。挽救實(shí)驗(yàn)顯示，沉默miR-141-3p可部分逆轉(zhuǎn)沉默SNHG16和FOXJ3對細(xì)胞增殖的抑制作用，直接證實(shí)了SNHG16通過miR-141-3p/FOXJ3通路調(diào)控肝細(xì)胞癌的增殖作用，此結(jié)論在組織學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測SNHG16與miR-141-3p、miR-141-3p與FOXJ3、FOXJ3與Ki67的相關(guān)性中得到間接證實(shí)。SNHG16是一種原癌基因，其下游具有多種miRNAs等相關(guān)基因[11,12]，其對腫瘤增殖的調(diào)控作用強(qiáng)，但是SNHG16與miR-141-3p之間是否通過海綿吸附的方式進(jìn)行調(diào)控尚需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)[13]。miR-141-3p是SNHG16調(diào)控中最重要的miRNAs之一，miR-141-3p具有抑癌基因樣的作用，下游受控基因眾多，功能復(fù)雜[14-16]。SNHG16發(fā)揮作用時(shí)與誘導(dǎo)下游的多種因子有關(guān)，如調(diào)節(jié)miR-200a-3p[17]、miR-98-5p[13]等，這使SNHG16的功能及機(jī)制更復(fù)雜[18,19]。miR-141-3p/FOXJ3是本研究關(guān)注的調(diào)控通路，其中的FOXJ3是主要的細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)基因。FOXJ3能誘導(dǎo)多個(gè)通路調(diào)節(jié)增殖，如啟動(dòng)周期素或增殖細(xì)胞核抗原途徑等[20]，也有學(xué)者認(rèn)為FOXJ3可通過負(fù)反饋抑制細(xì)胞凋亡，包括調(diào)節(jié)BAX和BCL-2基因等[21]。本研究關(guān)注的SNHG16調(diào)控通路可能是肝細(xì)胞癌增殖調(diào)控路徑之一[22,23]，基于此通路進(jìn)行干預(yù)研究可能為肝細(xì)胞癌的治療提供幫助。

總之，肝細(xì)胞癌中SNHG16的表達(dá)升高，SNHG16通過miR-141-3p/FOXJ3途徑促進(jìn)肝細(xì)胞癌的增殖。