劉蕾 馬德賓 史亮 孫文武

肺動脈高壓(pulmonary arterial hypertension，PAH)是以肺動脈平均壓漸進性升高為特征，導致患者右心衰竭及死亡的慢性疾病[1-2]。內(nèi)皮功能障礙是PAH血管重塑的根源，尚無有效藥物可以逆轉(zhuǎn)廣泛血管重構(gòu)及隨后引起的肺血管阻力(pulmonary vascular resistance，PVR)升高[3]。內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(endothelial-mesenchymal transition，EndMT)導致肺動脈增厚，對PAH中的肺動脈重塑起了很大作用，但其具體機制仍然有待進一步探討[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)缺氧環(huán)境肺動脈內(nèi)皮細胞中存在Sonic Hedgehog(SHH)通路水平上調(diào)[6]，而其主要效應(yīng)因子glioma-associated oncogene-1(Gli1)能夠促進Twist-related protein 1(Twist1)的表達，后者轉(zhuǎn)錄激活是促進內(nèi)皮向間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因子[7]。因此，本課題計劃利用低氧誘導的肺動脈內(nèi)皮細胞模型探討SHH/Gli是否通過調(diào)控Twist1水平影響EndMT過程，為PAH臨床治療探索新的靶點和思路。

資料與方法

一、 材料

內(nèi)皮細胞專用培養(yǎng)基購自中喬新舟(中國)，Cyclopamine購自源葉生物(中國)，脂質(zhì)體3000購自invitrogen(美國)，結(jié)晶紫購自Amresco(美國)，Transwell小室購自Corning(美國)，BeyoRT II M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶購自碧云天(上海)，TRIpure購自BioTek(北京),2×Taq PCR MasterMix購自Solarbio(北京)，Twist siRNA及對照由金拓思(武漢)合成，兔抗SHH抗體購自abclonal(中國)，兔抗Gli1抗體購自Affinity(中國)，兔抗Twist1抗體、兔抗 β-actin抗體及羊抗兔IgG-HRP購自萬類生物(中國)，引物委托金斯瑞(南京)合成，其他試劑為國產(chǎn)分析純。

二、 大鼠肺動脈內(nèi)皮細胞原代分離培養(yǎng)

200～300 g雄性SD大鼠麻醉后取出心肺組織，顯微鏡下剝離各級肺動脈及周圍結(jié)締組織，將肺動脈剪開，在含PBS的10 cm的培養(yǎng)皿中，反復清洗血管內(nèi)的血液，用無菌刀片將組織片切成1～2 mm2大小的動脈片，移入直徑為35 mm的培養(yǎng)皿中，以其內(nèi)膜面貼于培養(yǎng)皿，置細胞培養(yǎng)箱干涸2 h后，加入3 mL專用培養(yǎng)基于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。72 h后細胞可達一定密度，將動脈片去除，換液一次。每2 d換液一次，每次按照新鮮培養(yǎng)基1 ∶1進行換液，繼續(xù)培養(yǎng)7 d，細胞融合成單層。密度達到90%，用胰蛋白酶消化，進行傳代培養(yǎng)。

三、 細胞處理及分組

將分離得到的大鼠肺動脈內(nèi)皮細胞胰酶消化計數(shù)后重新接種細胞培養(yǎng)板，隨機分為正常對照組、模型組、模型+SHH抑制劑組、模型+siNC、模型+Twist siRNA組；待細胞融合超過50%后，模型組細胞按照實驗分組，分別加入干預藥物或轉(zhuǎn)染試劑，其中模型+SHH抑制劑組細胞，更換含有5 μM Cyclopamine的培養(yǎng)基，模型+siNC及模型+Twist siRNA組分別將siNC/Twist siRNA與脂質(zhì)體混合后逐滴加入各細胞培養(yǎng)孔中，瞬時轉(zhuǎn)染細胞，37℃、5%CO2培養(yǎng)過夜后，將細胞置于3% O2條件下培養(yǎng)3～7 d，建立PAH誘導干預模型，正常對照組細胞保持正常培養(yǎng)條件，顯微鏡下觀察細胞形態(tài)學變化。

四、 CCK8檢測細胞增殖能力

細胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔細胞量為3×103個，每組設(shè)計5個復孔，按照實驗分組進行細胞處理后，分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，每孔加入10μl CCK-8，37 ℃，5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2 h，在酶標儀上測定其在450 nm處OD值，進行數(shù)據(jù)分析。

五、 Transwell細胞遷移實驗

將Transwell小室放入24孔板中，下室加入含10% FBS的培養(yǎng)液800 μl；胰酶消化各組細胞，取細胞懸液200 μl加入Transwell上室，細胞數(shù)均為3×104個/孔，置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度條件下的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，PBS清洗2次，4%多聚甲醛室溫下固定20 min，0.5%結(jié)晶紫染液染色5 min后清洗，在倒置顯微鏡下(200×)對遷移至微孔膜下層的細胞計數(shù)，每個樣本選取5個視野計數(shù)細胞個數(shù)，取均數(shù)。

六、 實時熒光定量PCR檢測mRNA表達

收集各組細胞樣品，分別加入1 mL TRIpure 裂解液，Trizol法提取總RNA，檢測濃度并調(diào)整使之均一化，參照反轉(zhuǎn)錄酶操作說明進行反應(yīng)合成cDNA，以β-actin為內(nèi)參基因，擴增VE-cadherin、Vimentin基因，2-△△ CT方法分析檢測結(jié)果。引物信息如下，VE-cadherin引物序列：上游5′-CGACGCTTCTACCACTTC-3′，下游5′-TGTTCCCTTGTTTGGTTATT-3′，擴增產(chǎn)物為160 bp；Vimentin引物序列：上游5′-CGCCAGATGCGTGAAATG-3′，下游5′-GAGGAAGTGACTCCAGGTTAG-3′，擴增產(chǎn)物為274 bp；β-actin引物序列：上游5′-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTAGC-3′，下游5′-GGCCGGACTCATCGTACTCCTGCTT-3′，擴增產(chǎn)物為155 bp。

七、 Western blot檢測蛋白表達

收集各組細胞樣本，參照試劑盒說明裂解抽提蛋白，BCA法測定蛋白濃度并調(diào)平后，取20 μl蛋白樣本進行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，洗膜后加入一抗(Twist1 1 ∶500，SHH 1 ∶400，Gli1 1 ∶1000)4℃孵育過夜，TBST緩沖液重復洗膜4次，加入HRP標記的二抗于37℃孵育45 min(1 ∶5000稀釋)，TBST再次洗膜6次，加入ECL發(fā)光液靜止反應(yīng)約5 min，暗室中曝光，以β-actin為內(nèi)參，進行圖像采集及灰度分析，分別對Twist1、SHH、Gli1抗體表達進行半定量分析。

八、 統(tǒng)計分析

結(jié) 果

一、 各組細胞形態(tài)學觀察

經(jīng)低氧條件培養(yǎng)7 d后，對照組細胞多呈鵝卵石鑲嵌狀排列，多角形或梭形，大小均勻，相互融合；模型組細胞呈梭形生長，細胞間界限分明，細胞增殖較快； SHH抑制劑處理組及Twist1 沉默組，細胞形態(tài)及數(shù)量介于前兩組之間(見圖1)。

圖1 光鏡下觀察低氧處理7d后各組細胞形態(tài)變化(×100鏡下觀察)

二、 各組細胞增殖能力變化

CCK8結(jié)果顯示(見圖2)，與對照組比較，24 h后模型組細胞增殖能力有所升高，但無顯著差異，48 h及72 h時間點顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，48 h及72 h時間點SHH抑制劑處理組及Twist1 沉默組細胞增殖能力顯著下調(diào)(P<0.05)。

圖2 CCK8檢測細胞增殖情況(*P<0.05，vs正常對照組；#P<0.05，vs模型組)

三、 各組細胞遷移能力變化

Transwell檢測結(jié)果顯示(見圖3)，與對照組比較，模型組細胞遷移能力顯著增強(P<0.05)，與模型組比較，SHH抑制劑處理組及Twist1 沉默組細胞遷移能力有所降低(P<0.05)。

圖3 Transwell檢測細胞遷移能力變化(A：結(jié)晶紫染色，×200鏡下觀察；B：各組細胞遷移個數(shù)比較，*P<0.05，vs正常對照組；#P<0.05，vs模型組)

四、各組細胞VE-cadherin及Vimentin mRNA表達情況

實時定量PCR結(jié)果顯示(見圖4)，與對照組比較，模型組中VE-cadherin表達顯著降低，Vimentin水平顯著上調(diào)(P<0.05)；與模型組比較，SHH抑制劑處理組及Twist1 沉默組VE-cadherin指標表達均顯著上調(diào)，Vimentin水平顯著降低(P<0.05)。

圖4 實時定量PCR檢測VE-cadherin及Vimentin mRNA表達情況

五、 各組細胞SHH、Gil1以及Twist1蛋白表達情況

Westernblot檢測結(jié)果顯示(見圖5)，與對照組比較，模型組中SHH、Gil1以及Twist1蛋白水平均顯著上調(diào)(P<0.05)；與模型組比較，SHH抑制劑處理組及Twist1 沉默組中SHH、Gil1及Twist1水平明顯降低(P<0.05)。

圖5 Westernblot檢測SHH、Gil1以及Twist1蛋白水平變化情況(*P<0.05，vs正常對照組；#P<0.05，vs模型組)

討 論

肺動脈高壓(PAH)的是一種肺小動脈原發(fā)性病變，特征在于肺動脈的一系列結(jié)構(gòu)變化，如內(nèi)膜增生、中膜肥厚、外膜纖維化等[8]。最近多項研究表明，內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EndMT)在PAH患者和動物模型中均有發(fā)生[5, 9]。EndMT指在缺氧、炎癥等刺激因素持續(xù)影響下，內(nèi)皮細胞向間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)變的過程，EndMT過程中，內(nèi)皮細胞失去極性及細胞間接觸，并經(jīng)歷細胞骨架重塑，是內(nèi)皮功能障礙的一個復雜事件，被認為是上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)變(epithelial-mesen-chymal transition，EMT)的一種特殊形式，與肺動脈高壓的發(fā)生和進展密切相關(guān)[3]。Hh信號通路在胚胎發(fā)育中起關(guān)鍵作用，研究發(fā)現(xiàn)，Hh通路能夠通過非配體依賴途徑，調(diào)控缺氧誘導的腫瘤細胞 EMT 及侵襲過程。Gli-1是Hh信號傳導的主要效應(yīng)因子，可降低E-cadherin的水平，增加Vimentin的水平，這提示Hh信號對于EMT的發(fā)生非常重要[10]。SHH是Hedgehog的同源基因，研究發(fā)現(xiàn)，在PAH患者肺組織中存在SHH表達上調(diào)[6]。越來越多的研究表明SHH信號通路通過調(diào)節(jié)EMT變化在腫瘤細胞中發(fā)揮影響作用，Perez等也指出EndMT與EMT過程共享許多分子調(diào)控機制[11-12]。在本研究中，我們通過體外實驗，首次驗證了SHH/Gli通路在缺氧誘導PAH的EndMT中的重要影響，SHH/Gli1上調(diào)，通過調(diào)控Twist1水平介導肺動脈內(nèi)皮細胞EndMT過程，抑制SHH活性或干擾Twist1均能抑制內(nèi)皮細胞向間質(zhì)轉(zhuǎn)化，可能對緩解PAH進展中內(nèi)皮功能障礙具有一定的調(diào)控作用。

為了建立PAH細胞模型，我們分離培養(yǎng)了大鼠原代肺動脈內(nèi)皮細胞，并給予低氧環(huán)境誘導。CCK-8及Transwell檢測結(jié)果顯示與正常細胞比較，缺氧誘導后肺動脈內(nèi)皮細胞增殖、遷移能力顯著增加；細胞形態(tài)觀察也顯示，缺氧誘導環(huán)境下內(nèi)皮細胞形態(tài)向間質(zhì)表型轉(zhuǎn)化。PAH中的EndMT細胞具有顯著增殖活性，是炎癥應(yīng)激與內(nèi)皮功能障礙之間復雜相互作用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[13]。EndMT在肺動脈重構(gòu)中起著關(guān)鍵作用，在此過程中內(nèi)皮細胞獲得間充質(zhì)樣細胞的遷移能力，并入侵到肺動脈中膜[14]。也有研究指出SHH在氧化應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)生上調(diào)，并與細胞增殖和動脈重塑有關(guān)[15-17]。而本研究中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)SHH抑制劑或Twist1 干擾處理后，模型組細胞增殖能力、遷移顯著降低(P<0.05)，且細胞形態(tài)變化發(fā)生逆轉(zhuǎn)。上述結(jié)果提示，在缺氧誘導的細胞PAH中存在SHH通路和Twist1的激活，并可能與EndMT過程轉(zhuǎn)變有關(guān)。

EndMT發(fā)展過程中內(nèi)皮細胞失去內(nèi)皮細胞表型及表面標記，而獲得間充質(zhì)或平滑肌細胞表型，內(nèi)皮細胞在形態(tài)上發(fā)生變化，內(nèi)皮細胞基因和蛋白水平變化主要表現(xiàn)在原有的內(nèi)皮標記物(VE-cadherin，CD31)減少，由VE-cadherin介導的細胞粘附喪失，間充質(zhì)標記物(Vimentin)的表達水平增加，轉(zhuǎn)錄因子Twist1表達增加[5]。本研究中的實驗結(jié)果也驗證了這些表型的變化，實時熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，模型組細胞內(nèi)皮細胞標志VE-cadherin表達顯著降低，間充質(zhì)細胞標記Vimentin水平顯著上調(diào)(P<0.05)。EndMT受到多種信號通路調(diào)控，我們的目標著重關(guān)注SHH/Gil1信號通路在缺氧誘導的PAH中發(fā)揮的作用。蛋白水平檢測結(jié)果提示低氧誘導能夠顯著上調(diào)肺動脈內(nèi)皮細胞中SHH、Gil1以及Twist1的表達水平(P<0.05)。SHH抑制劑作用及Twist1 沉默干預處理后，Western blot檢測結(jié)果驗證了模型組細胞中SHH/Gil1通路受到抑制以及Twist1蛋白水平下調(diào)，此外抑制Twist1表達后SHH/Gil1也受到抑制，提示Twist1可能對SHH通路存在反饋調(diào)節(jié)。與模型組比較，SHH抑制劑及Twist1 沉默干預后模型組細胞中VE-cadherin指標基因表達水平顯著上調(diào)，Vimentin水平顯著降低(P<0.05)；上述結(jié)果提示，抑制SHH通路可能通過影響Twist1水平調(diào)節(jié)低氧環(huán)境下肺動脈內(nèi)皮細胞的EndMT轉(zhuǎn)化。

綜上所述，缺氧環(huán)境誘導SHH/Gli通路激活促進肺動脈內(nèi)皮細胞增殖，加速細胞內(nèi)皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進PAH病理進展，這可能與該通路介導Twist1水平升高有關(guān)，抑制SHH通路活性可以改善PAH過程中EndMT轉(zhuǎn)化進程，從而緩解缺氧性肺動脈高壓。目前，已開發(fā)的防治策略難以根治PAH，主要原因是PAH發(fā)生機制尚未明晰。本文為肺血管ECs異常增殖及間充質(zhì)轉(zhuǎn)化在PAH進展中具體調(diào)節(jié)機制研究提供了新的視角及實驗證據(jù)，有助于為PAH臨床治療探索有效的干預措施及靶點，提供理論依據(jù)及實驗支持。