李明珍，何韶華，靳英輝，，陳 成，閻思宇，王永博，劉 歡，周治清，肖 涵，楊瑞瑞，譚力銘

1. 懷化市第二人民醫(yī)院精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)中心（湖南懷化 418000）

2. 武漢大學(xué)中南醫(yī)院循證與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心（武漢 430071）

3. 懷化市第二人民醫(yī)院胸部腫瘤內(nèi)科（湖南懷化 418000）

4. 懷化市第二人民醫(yī)院消化腫瘤內(nèi)科（湖南懷化 418000）

5. 懷化市第二人民醫(yī)院臨床藥學(xué)部（湖南懷化 418000）

肺癌是全球發(fā)病率及死亡率最高的惡性腫瘤之一[1]。非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占所有肺癌的75%～80%，治療后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是患者死亡的主要原因[2]。盡管肺癌治療方法取得了長(zhǎng)足進(jìn)步，NSCLC患者根治性手術(shù)后復(fù)發(fā)率仍高達(dá)30%～70%，5年總體生存率低于20%[3-4]。目前尚未發(fā)現(xiàn)更好的臨床生物標(biāo)志物能預(yù)測(cè)NSCLC復(fù)發(fā)高危人群[5]。循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cells，CTCs）是原發(fā)腫瘤或轉(zhuǎn)移灶脫落后釋放入外周血液循環(huán)的腫瘤細(xì)胞[6]。CTCs檢測(cè)屬于液體活檢技術(shù)，具有非侵入性的優(yōu)點(diǎn)，可識(shí)別術(shù)后疾病進(jìn)展的高風(fēng)險(xiǎn)患者，縱向監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)展和治療反應(yīng)[7]。目前認(rèn)為腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移可能與進(jìn)入外周血的CTCs有關(guān)[8]，多項(xiàng)研究顯示CTCs檢測(cè)可評(píng)估直腸癌、乳腺癌及食管癌等腫瘤的預(yù)后[9-11]，但其在監(jiān)測(cè)肺癌發(fā)生發(fā)展及預(yù)后評(píng)估方面的效果尚存爭(zhēng)議。本研究旨在對(duì)CTCs在NSCLC患者中的預(yù)后價(jià)值進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)價(jià)與Meta分析，以期為相關(guān)臨床應(yīng)用提供參考。

1 資料與方法

1.1 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：①研究類型為隊(duì)列研究；②研究對(duì)象為病理確診的NSCLC患者，腫瘤分期不限；③暴露的測(cè)量時(shí)間為初始治療前一周內(nèi)檢測(cè)其外周血基線CTCs水平；④結(jié)局指標(biāo)包括無(wú)進(jìn)展生存期（progression-free survival，PFS）和（或）總生存期（overall survival，OS）；⑤統(tǒng)計(jì)分析方法采用多變量Cox回歸分析，基線CTCs水平作為其中的協(xié)變量，且報(bào)告其風(fēng)險(xiǎn)比（HR）值及95%CI，或有充足數(shù)據(jù)可以計(jì)算HR值及95%CI。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①病例總數(shù)低于20例；②無(wú)法獲取或無(wú)法轉(zhuǎn)換數(shù)據(jù)的研究；③非中英文文獻(xiàn)。

1.2 文獻(xiàn)檢索策略

計(jì)算機(jī)檢索中國(guó)知網(wǎng)、萬(wàn)方、中國(guó)生物醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)服務(wù)系統(tǒng)、維普、PubMed、Web of Science、The Cochrane Library、Embase數(shù)據(jù)庫(kù)，收集檢測(cè)NSCLC患者基線CTCs水平的相關(guān)研究，檢索時(shí)限為建庫(kù)至2021年9月28日。中文檢索詞為循環(huán)腫瘤細(xì)胞、非小細(xì)胞肺癌、預(yù)后等；英文檢索詞為circulating tumor cell、NSCLC、prognosis等。采用主題詞與自由詞結(jié)合的方式進(jìn)行檢索，同時(shí)輔以手工檢索和文獻(xiàn)追溯法收集相關(guān)文獻(xiàn)。以PubMed為例，具體檢索策略見(jiàn)框1。

框1 PubMed檢索策略Box 1. Search strategy in PubMed

1.3 文獻(xiàn)篩選、資料提取與文獻(xiàn)質(zhì)量評(píng)價(jià)

由2名研究者獨(dú)立篩選文獻(xiàn)、提取資料，并交叉核對(duì)，如遇分歧，則通過(guò)討論或由第三方解決。文獻(xiàn)篩選時(shí)首先閱讀文題和摘要，在排除明顯不相關(guān)的文獻(xiàn)后，進(jìn)一步閱讀全文，以確定最終是否納入。資料提取內(nèi)容包括：①納入研究的基本信息，包括第一作者、樣本量、CTCs檢測(cè)方法、CTCs截?cái)嘀档?，以研究中設(shè)定的截?cái)嘀刀xCTCs水平，截?cái)嘀导耙陨蠟楦咚?，反之為低水平；②文獻(xiàn)質(zhì)量評(píng)價(jià)的相關(guān)要素；③結(jié)局指標(biāo)和多因素分析結(jié)果。文獻(xiàn)質(zhì)量評(píng)價(jià)采用紐卡斯?fàn)?渥太華量表（Newcastle-Ottawa Scale，NOS）評(píng)分，總分為9分，分?jǐn)?shù)越高，文獻(xiàn)質(zhì)量越高[12]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用RevMan 5.3和Stata 15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用倒方差法對(duì)多因素Cox模型中OS及PFS的HR值及95%CI進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，對(duì)于只提供HR值，未提供置信區(qū)間或標(biāo)準(zhǔn)差，并且通過(guò)其他途徑也無(wú)法獲取數(shù)據(jù)的文獻(xiàn)，則不進(jìn)行定量合成；對(duì)于未提供HR值，但有充足數(shù)據(jù)可以計(jì)算的，則通過(guò)公式換算得到近似估計(jì)HR值及置信區(qū)間；對(duì)于只提供生存曲線的研究，則參考其他方法獲取估算的HR值及置信區(qū)間[13]。如在同一研究中有多個(gè)多因素Cox模型，則選取調(diào)整因素最多的模型納入研究。通過(guò)Q檢驗(yàn)和I2檢驗(yàn)進(jìn)行異質(zhì)性檢驗(yàn)，若I2≤50%，P≥0.1，采用固定效應(yīng)模型合并HR值，反之，則采用隨機(jī)效應(yīng)模型。對(duì)異質(zhì)性來(lái)源進(jìn)行分析，按CTCs檢測(cè)方法、腫瘤分期及CTCs截?cái)嘀颠M(jìn)行亞組分析。對(duì)納入研究繪制漏斗圖及進(jìn)行Egger檢驗(yàn)評(píng)估發(fā)表偏倚，P＜0.05表示存在發(fā)表偏倚。

2 結(jié)果

2.1 文獻(xiàn)篩選流程及結(jié)果

初檢獲得相關(guān)文獻(xiàn)2 267篇，經(jīng)逐層篩選，最終納入19項(xiàng)研究，其中中文5篇，英文14篇。文獻(xiàn)篩選流程及結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.2 納入文獻(xiàn)基本特征

19項(xiàng)研究共包括1 853例患者。其中10項(xiàng)研究采用CellSearch法檢測(cè)CTCs，13項(xiàng)研究?jī)H納入了腫瘤分期為III/IV期的患者，18項(xiàng)研究NOS質(zhì)量評(píng)價(jià)≥7分，納入研究的基本特征和文獻(xiàn)質(zhì)量評(píng)價(jià)見(jiàn)表1。

表1 納入文獻(xiàn)的一般特征Table 1. Basic characteristics of theincludedstudies

2.3 Meta分析結(jié)果

2.3.1 CTCs與PFS的相關(guān)性

14項(xiàng)研究報(bào)道了CTCs與NSCLC患者PFS的相關(guān)性[14-16,18-27,31]。Meta分析結(jié)果顯示，與低水平CTCs患者相比，高水平患者在PFS方面預(yù)后更差 [HR=2.49, 95%CI（1.50，4.13），P=0.0004]，同時(shí)納入研究的異質(zhì)性較高（P＜ 0.001，I2=86%）（圖2-A）。按CTCs檢測(cè)方法、腫瘤分期、CTCs截?cái)嘀颠M(jìn)行亞組分析，結(jié)果尚未發(fā)現(xiàn)異質(zhì)性來(lái)源，詳見(jiàn)圖2。按CTCs檢測(cè)方法進(jìn)行亞組分析，結(jié)果顯示，采用CellSearch檢測(cè)方法的高水平CTCs患者較低水平患者在PFS方面預(yù)后更差[HR=3.51，95%CI（1.55，7.95），P＜0.05]（圖2-B）。按腫瘤分期、CTCs截?cái)嘀档膩喗M分析結(jié)果顯示，除截?cái)嘀怠?個(gè)/3.2 mL組外，其他各亞組均顯示高水平CTCs組較低水平患者在PFS方面預(yù)后更差（圖2-C、圖2-D）。

圖2 CTCs與PFS的相關(guān)性Figure 2. Correlation between CTCs and PFS

2.3.2 CTCs與OS的相關(guān)性

15項(xiàng)研究報(bào)道了CTCs與NSCLC患者OS的相關(guān)性[2,14,16-18,20-25,27-30]。Meta分析結(jié)果顯示，NSCLC患者的CTCs水平與其OS無(wú)顯著相關(guān)性[HR=1.18, 95%CI（0.70，1.99），P=0.54]，同時(shí)納入研究的異質(zhì)性較高（P＜0.001，I2=89%），見(jiàn)圖3-A。按CTCs檢測(cè)方法、腫瘤分期、CTCs截?cái)嘀颠M(jìn)行亞組分析，結(jié)果尚未發(fā)現(xiàn)異質(zhì)性來(lái)源，各亞組均顯示高水平CTCs對(duì)OS并沒(méi)有顯著的預(yù)測(cè)能力（圖3-B、圖3-C、圖3-D）。

圖3 CTCs與OS的相關(guān)性Figure 3. Correlation between CTCs and OS

2.4 發(fā)表偏倚

針對(duì)PFS和OS研究的漏斗圖顯示，散點(diǎn)分布大體對(duì)稱，且Egger檢驗(yàn)P值分別為0.163、0.775，提示存在發(fā)表偏倚的可能性較小。詳見(jiàn)圖4。

圖4 發(fā)表偏倚漏斗圖Figure 4. Funnel plot verifies publication bias of studies

3 討論

NSCLC患者行根治性手術(shù)后5年復(fù)發(fā)率高達(dá)25%～50%，其復(fù)發(fā)以全身轉(zhuǎn)移為主，局部復(fù)發(fā)并不多見(jiàn)[32]。目前對(duì)于肺癌療效的評(píng)價(jià)指標(biāo)普遍采用依賴CT檢測(cè)的RECIST評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，但對(duì)療效判定存在一定的滯后性[31]。近年來(lái)，隨著分子診斷及靶向治療的發(fā)展，腫瘤特異性的基因組和表觀遺傳學(xué)改變通常通過(guò)手術(shù)或活檢來(lái)識(shí)別[4]。由于時(shí)間和空間的異質(zhì)性，基于組織的分子信息檢測(cè)也存在不及時(shí)、不便利的局限性[33]。與傳統(tǒng)的組織活檢相比，液體活檢具有微創(chuàng)性、全面性及動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)等優(yōu)點(diǎn)[33]，且更能反映患者遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的真實(shí)情況。CTCs檢測(cè)作為液體活檢的重要分支，對(duì)腫瘤患者的療效、預(yù)后以及個(gè)體化治療等有重要的指導(dǎo)作用。

目前，CTCs的檢測(cè)技術(shù)包括CellSearch系統(tǒng)、膜過(guò)濾技術(shù)、AdnaTest系統(tǒng)、配體靶向PCR法（ligand-targeted PCR method，LT-PCR）等方法。其中LT-PCR是中國(guó)唯一獲批的肺癌CTCs檢測(cè)技術(shù)，CellSearch系統(tǒng)則在美國(guó)獲批用于臨床 CTCs 的檢測(cè)[34]。盡管有研究證實(shí)NSCLC患者術(shù)后CTCs的檢出率約為49%[14]，但不同檢測(cè)方法的局限性依然對(duì)CTCs檢測(cè)造成了較大的困難。因此可能需要更多的研究進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)來(lái)提高CTCs的特異性及敏感性。此外，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)了CellSearch法用于乳腺癌的推薦截?cái)嘀?，但未推薦用于肺癌的截?cái)嘀礫8]。目前，國(guó)際上對(duì)肺癌CTCs陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)并不統(tǒng)一，尚需大樣本、多中心的研究予以證實(shí)[34]。

腫瘤細(xì)胞的血行播散是腫瘤出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的主要原因[35]。原發(fā)灶腫瘤細(xì)胞在合適的微環(huán)境下發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致細(xì)胞間黏附能力減弱、遷移和侵襲能力增強(qiáng)，脫離原發(fā)灶后進(jìn)入外周血循環(huán)形成CTCs[36]。有研究發(fā)現(xiàn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和腫瘤播散入血早于腫瘤轉(zhuǎn)移病灶形成，因此在影像學(xué)可檢測(cè)的實(shí)體病灶形成之前進(jìn)行高危人群 CTCs 檢測(cè)對(duì)早期肺癌的篩查具有重要的預(yù)測(cè)作用[37]。CTCs水平可以反映腫瘤負(fù)荷和生物侵襲性[38]。CTCs檢測(cè)在惡性腫瘤預(yù)后中的潛力已在多項(xiàng)研究中得到證實(shí)[9-11]。Ried等研究發(fā)現(xiàn)，Ⅰ期腫瘤患者外周血中CTCs數(shù)量小于3 個(gè)/mL，Ⅱ～Ⅲ期患者CTCs計(jì)數(shù)為3～20 個(gè)/mL，Ⅳ期患者CTCs計(jì)數(shù)大于20 個(gè)/mL[39]，提示CTCs水平與腫瘤分期可能存在相關(guān)性?；颊呓?jīng)過(guò)放化療、靶向治療或根治性手術(shù)后監(jiān)測(cè)血液中的CTCs水平也可以在一定程度上反映手術(shù)和藥物治療的療效，CTCs計(jì)數(shù)減少時(shí)意味著患者對(duì)該治療方案反應(yīng)良好，反之則可能出現(xiàn)了耐藥性或腫瘤進(jìn)展[36]。本研究顯示CTCs檢測(cè)對(duì)NSCLC患者的PFS具有較顯著的預(yù)測(cè)作用，這與Jiang等Meta分析結(jié)果一致[8]。杜靜怡等研究也證實(shí)了患者基線CTCs計(jì)數(shù)與PFS相關(guān)，且在多因素Cox分析中基線CTCs計(jì)數(shù)是影響患者PFS的獨(dú)立因素[31]。在亞組分析中，僅其他CTCs檢測(cè)方法及截?cái)嘀怠?個(gè)/3.2mL組的結(jié)果顯示基線CTCs水平對(duì)PFS無(wú)顯著預(yù)測(cè)作用，這可能是由于不同CTCs檢測(cè)方法的特異性及敏感性存在差異。此外，雖然納入研究的數(shù)據(jù)顯示CTCs計(jì)數(shù)越多，NSCLC患者的OS越短，但本研究中的結(jié)果顯示基線CTCs 水平對(duì)OS無(wú)顯著預(yù)測(cè)能力，這可能是由于人口學(xué)特征及臨床混雜因素對(duì)患者的OS 影響較大，如年齡、身體狀況及治療依從性等。

本研究尚存一定的局限性：①不同CTCs檢測(cè)方法的特異性及敏感性可能會(huì)導(dǎo)致偏倚，且CTCs陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)（截?cái)嘀担┮采形唇y(tǒng)一，未來(lái)需進(jìn)一步規(guī)范；②受限于納入研究數(shù)量，無(wú)法對(duì)病理分型、隨訪時(shí)長(zhǎng)等對(duì)結(jié)果的影響展開(kāi)分析，且各研究多因素Cox回歸模型也存在不一致性，不同研究之間可能存在潛在偏倚；③當(dāng)前納入研究缺乏長(zhǎng)期隨訪數(shù)據(jù)，CTCs對(duì)長(zhǎng)期結(jié)局的預(yù)后作用仍需未來(lái)研究的證據(jù)支持。

綜上所述，本研究顯示CTCs高水平組NSCLC患者相較低水平組患者的PFS更差，差異達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，亞組分析結(jié)果表明無(wú)論腫瘤分期早晚，CTCs高水平組相較低水平組患者的PFS更差，但CTCs水平與OS的相關(guān)性并不顯著。外周血CTCs監(jiān)測(cè)已被證明可早于影像學(xué)檢查檢測(cè)出腫瘤發(fā)生發(fā)展，但基于CTCs結(jié)果的早期干預(yù)能否讓患者真正獲益尚不明確。CTCs可作為早期識(shí)別患者潛在轉(zhuǎn)移灶的輔助指標(biāo)，有助于評(píng)估NSCLC患者療效及預(yù)后。然而，更重要的是標(biāo)準(zhǔn)化的液體活檢技術(shù)需要在未來(lái)得到證實(shí)，以及需要更多的前瞻性研究來(lái)驗(yàn)證CTCs技術(shù)預(yù)測(cè)腫瘤復(fù)發(fā)的適用性及經(jīng)濟(jì)性，從而增加CTCs的臨床效用。