宋昆澤，李雅莉，牟 建

三二〇一醫(yī)院：1.兒科；2.微生物及免疫科，陜西漢中 723000

臨床上，兒童EB病毒(EBV)感染較為常見(jiàn)，多表現(xiàn)為咽峽炎、淋巴結(jié)腫大等，嚴(yán)重時(shí)可造成心、肝等器官損傷，危及生命。目前EBV感染患兒尚無(wú)特異性的治療方法，主要予以更昔洛韋、抗菌藥物及對(duì)癥支持治療等[1]。有研究表明，部分患兒在更昔洛韋治療中會(huì)出現(xiàn)骨髓抑制的現(xiàn)象，表現(xiàn)為白細(xì)胞及血小板減少等，導(dǎo)致患兒免疫力低下[2]。因此，提高EBV感染患兒治療療效，減少不良反應(yīng)發(fā)生是臨床研究的重點(diǎn)。重組人干擾素α-1b聯(lián)合人免疫球蛋白能中和毒素，殺死細(xì)菌和病毒，其用于小兒毛細(xì)支氣管炎等疾病治療已取得一定成效，在治療EBV感染過(guò)程中能發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)及抗病毒的雙重作用[3]。但是，重組人干擾素 α-1b聯(lián)合人免疫球蛋白用于治療EBV感染患兒的時(shí)間較短，且關(guān)于二者免疫調(diào)節(jié)的機(jī)制及療效判斷的指標(biāo)報(bào)道較少。纖維膠凝蛋白3(Ficolin-3)是參與補(bǔ)體凝集素途徑中的重要蛋白，可識(shí)別細(xì)菌及病毒等多種微生物，在免疫反應(yīng)中具有重要作用[4]。SH2結(jié)構(gòu)域蛋白1A(SH2D1A)基因定位于Xq25，SH2D1A可與信號(hào)淋巴細(xì)胞激活分子結(jié)合，影響SH2結(jié)構(gòu)域的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子SHP-2的募集，參與調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能[5]。有研究表明，EBV感染患兒Ficolin-3、SH2D1A表達(dá)升高，二者表達(dá)情況與患兒病情嚴(yán)重程度有關(guān)[6-7]。因此，本研究分析重組人干擾素α-1b 聯(lián)合人免疫球蛋白治療對(duì)EBV感染患兒的臨床療效，以及對(duì)Ficolin-3、SH2D1A表達(dá)水平的影響。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年2月至2020年2月在本院就診的130例EBV感染患兒作為研究對(duì)象。收集患兒一般資料，記錄患兒住院期間臨床癥狀及體征的消退時(shí)間。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)參考《諸福棠實(shí)用兒科學(xué)》[8]中EBV感染診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)臨床表現(xiàn)和血清學(xué)抗體EBV-DNA、EBV-CA-IgM 及EBV-NA-IgG檢測(cè)結(jié)果提示EBV活動(dòng)性感染。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)接受常規(guī)治療或人干擾素α-1b聯(lián)合人免疫球蛋白治療以外其他治療方案患兒；(2)伴嚴(yán)重神經(jīng)及器官功能損害患兒；(3)存在藥物禁忌證或不愿意接受相關(guān)診治患兒。根據(jù)治療方式不同將入選患兒分為對(duì)照組和觀察組，各65例。觀察組和對(duì)照組性別、年齡和病程等比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患兒家屬簽署知情同意書(shū)。

表1 兩組一般資料比較

1.2儀器與試劑 熒光定量PCR(RT-qPCR)儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司，型號(hào)ABI7500。流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)貝克曼公司，型號(hào)CytoFLEX。人Ficolin-3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒購(gòu)自泉州睿信生物公司(貨號(hào)：RX2918)，白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-8、腫瘤壞死因子(TNF)-α ELISA試劑盒購(gòu)自江萊生物公司(貨號(hào)：JL14113、JL13943、JL13317)，F(xiàn)icoll淋巴分離液購(gòu)自美國(guó)SIGMA公司(貨號(hào)：26873-85-8)。RNA快速提取試劑盒購(gòu)自新?；蚬?貨號(hào)：B0132)，引物序列由華大基因公司合成。

1.3方法 對(duì)照組給予常規(guī)治療，包括營(yíng)養(yǎng)支持、補(bǔ)液糾正水電解質(zhì)及酸堿失衡、抗感染治療等對(duì)癥支持治療，以及阿昔洛韋(陜西博森生物制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20052277)靜脈滴注治療，給藥劑量為5 mg/kg，12 h 1次，治療1周。觀察組在常規(guī)治療基礎(chǔ)上給予人干擾素α-1b聯(lián)合人免疫球蛋白治療，人干擾素α-1b 注射液(北京三元基因藥業(yè)公司，國(guó)藥準(zhǔn)字S20010006)給藥方式為肌內(nèi)注射，給藥劑量為5 μg/kg，每天1次，持續(xù)給藥1周，人免疫球蛋白(華蘭生物工程有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字10970032)給藥方式為靜脈滴注，給藥劑量為400 mg/kg，治療5 d。兩組患兒均治療5～7 d，7 d后評(píng)估療效。

1.4觀察指標(biāo)

1.4.1ELISA檢測(cè)血清Ficolin-3、SH2D1A表達(dá) 取各組治療前及治療后清晨空腹靜脈血。ELISA檢測(cè)血清Ficolin-3表達(dá)。采用RT-qPCR檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞SH2D1A表達(dá)。采用密度梯度離心法分離患兒治療前后外周血單個(gè)核細(xì)胞，RNA提取試劑盒提取總RNA。將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行PCR反應(yīng)。SH2D1A上游引物為5′-AGGCGTGTACTGCCTATGTG-3′，下游引物為5′-TGCAGAGGTATTACAATGCCTTG-3′；GAPDH上游引物為5′-GCACCCACATGGCACGAATTTT-3′，下游引物為5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。按照說(shuō)明書(shū)配制反應(yīng)體系，反應(yīng)條件：95 ℃ 預(yù)變性5 min，95 ℃ 變性20 s，60 ℃ 退火20 s，70 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。Ficolin-3、SH2D1A表達(dá)結(jié)果以相對(duì)定量法2-ΔΔCt表示。

1.4.2免疫分子及免疫細(xì)胞檢測(cè) 采用ELISA雙抗體夾心法檢測(cè)血清IL-6、IL-8、TNF-α水平，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血CD3+、CD4+、CD8+和CD4+/CD8+。采用RT-qPCR檢測(cè)治療前后兩組EBV-DNA、EBV-CA-IgM及EBV-NA-IgG，并計(jì)算轉(zhuǎn)陰率。

1.4.3療效評(píng)估及并發(fā)癥發(fā)生情況 療效評(píng)估[3]：根據(jù)患兒治療后癥狀、體征和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指標(biāo)進(jìn)行療效評(píng)估，患兒的癥狀、體征加重，實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)惡化時(shí)判斷為治療無(wú)效；當(dāng)患兒EBV感染的臨床癥狀和臨床體征完全消失，并且EBV感染相關(guān)的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指標(biāo)正常時(shí)判斷為顯效；癥狀、體征較治療前改善，實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指標(biāo)好轉(zhuǎn)但未達(dá)到正常時(shí)判斷為有效?？傆行?(顯效例數(shù)+有效例數(shù))/總例數(shù)×100%。并發(fā)癥：觀察患兒治療過(guò)程中有無(wú)心肌酶異常、肝功能異常及胸腔積液等并發(fā)癥發(fā)生情況。

2 結(jié) 果

2.1兩組治療后癥狀及體征比較 治療后，觀察組發(fā)熱、咳嗽、頸淋巴結(jié)腫大、咽痛、扁桃體腫大和肝脾腫大各臨床癥狀及體征的消失或消退時(shí)間均短于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 兩組癥狀及體征消失或消退時(shí)間比較

2.2兩組治療后病毒轉(zhuǎn)陰率比較 治療后，觀察組EBV-DNA轉(zhuǎn)陰率、EBV-CA-IgM 轉(zhuǎn)陰率均明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；兩組EBV-NA-IgG轉(zhuǎn)陰率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 兩組病毒轉(zhuǎn)陰率比較[n(%)]

2.3兩組治療前后免疫指標(biāo)比較 兩組治療后Ficolin-3、SH2D1A、IL-6、IL-8、TNF-α、CD8+均較治療前明顯降低，觀察組上述指標(biāo)較對(duì)照組降低更為明顯，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；兩組治療后CD3+、CD4+和CD4+/CD8+均明顯高于治療前，觀察組上述指標(biāo)較對(duì)照組升高更為明顯，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 兩組治療前后免疫分子水平比較

組別nIL-8(pg/mL)治療前治療后TNF-α(pg/mL)治療前治療后CD3+(%)治療前治療后對(duì)照組65174.26±31.3038.87±11.23a254.53±33.60110.69±21.58a73.11±5.6376.36±6.71a觀察組65173.55±29.5831.41±10.19a255.71±34.1894.66±22.79a74.42±5.5981.21±7.30at0.1333.9660.1984.1181.3313.944P0.894<0.0010.843<0.0010.185<0.001

組別nCD4+(%)治療前治療后CD8+(%)治療前治療后CD4+/CD8+治療前治療后對(duì)照組6516.23±5.2427.57±5.53a58.24±7.3542.14±6.61a1.39±0.311.54±0.34a觀察組6517.04±5.36133.87±6.45a59.24±7.3333.23±5.78a1.40±0.301.74±0.36at0.8715.9780.7778.1810.1873.256P0.385<0.0010.439<0.0010.8520.001

2.4治療前Ficolin-3、SH2D1A表達(dá)與各項(xiàng)免疫指標(biāo)的相關(guān)性 相關(guān)性分析顯示，治療前Ficolin-3表達(dá)與IL-6、IL-8、TNF-α及CD8+呈正相關(guān)，與CD3+、CD4+及CD4+/CD8+呈負(fù)相關(guān);SH2D1A表達(dá)與IL-6、IL-8及TNF-α水平呈正相關(guān)，與CD3+、CD4+及CD4+/CD8+呈負(fù)相關(guān)。見(jiàn)表5。

表5 治療前血清Ficolin-3、SH2D1A表達(dá)與免疫指標(biāo)的相關(guān)性

2.5兩組臨床療效及并發(fā)癥發(fā)生情況比較 觀察組顯效、有效和無(wú)效分別為36例、27例和2例，對(duì)照組分別為30例、22例和13例。觀察組治療總有效率[96.92%(63/65)]明顯高于對(duì)照組[80.00%(52/65)]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.119，P=0.003)。觀察組發(fā)生心肌酶異常3例，肝功能異常2例，胸腔積液1例；對(duì)照組心肌酶異常7例，肝功能異常10例，肺不張1例，胸腔積液2例；觀察組并發(fā)癥總發(fā)生率[9.23%(6/65)]明顯低于對(duì)照組[30.77%(20/65)]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.423，P=0.002)。

3 討 論

人體在感染EBV后，B淋巴細(xì)胞首先受累，受累的B細(xì)胞抗原性的異常改變會(huì)誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞的增殖活化，抑制被EBV感染的B細(xì)胞的增殖，調(diào)節(jié)局部的炎性反應(yīng)，但同時(shí)CD4+T細(xì)胞也被消耗而減少[9]。此外，大量EBV抗原的刺激使CD8+T細(xì)胞過(guò)度增殖活化，CD8+T細(xì)胞的細(xì)胞毒作用不僅殺傷EBV感染的B細(xì)胞，還侵犯心、肝及腎等多個(gè)器官，導(dǎo)致重要臟器發(fā)生組織病理學(xué)改變。T淋巴細(xì)胞活化會(huì)促進(jìn)單核-巨噬細(xì)胞分泌促炎性細(xì)胞因子，如IL-6、IL-8及TNF-α等，造成組織器官的炎性損傷[10]。Ficolin-3是補(bǔ)體凝集素途徑中的起始因子，結(jié)合病原體后參與補(bǔ)體激活，在宿主防御感染中起關(guān)鍵作用，在EBV感染的急性炎癥期間表達(dá)明顯升高[8,11]。SH2D1A是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的能夠調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞功能的重要因子，廣泛存在于T和B淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞中，當(dāng)免疫細(xì)胞活化后SH2D1A表達(dá)明顯上調(diào)，進(jìn)而調(diào)節(jié)周圍免疫細(xì)胞的功能。有學(xué)者報(bào)道，SH2D1A在兒童EBV感染時(shí)表達(dá)明顯升高，并導(dǎo)致患兒細(xì)胞免疫功能紊亂[7]。

目前，EBV感染患兒的治療原則主要是對(duì)癥治療，疾病急性期主要注意休息，輔以抗病毒治療，合并細(xì)菌感染的患兒予以抗菌藥物治療，但臨床療效有限。干擾素α-1b是一種低相對(duì)分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)，在人體中主要由單核細(xì)胞及淋巴細(xì)胞分泌產(chǎn)生，不僅參與調(diào)節(jié)機(jī)體的正常免疫功能的調(diào)節(jié)，在抗病毒方面也具有明顯的治療效果[12]。干擾素α-1b能夠誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生抗病毒蛋白，促進(jìn)病毒mRNA降解，并抑制病毒蛋白的轉(zhuǎn)錄、翻譯和復(fù)制過(guò)程，從而提高抗病毒治療效果[13]。人免疫球蛋白在臨床上常用于細(xì)菌或病毒感染性疾病，其能提高機(jī)體的體液免疫，減輕過(guò)度的炎性反應(yīng)，在機(jī)體免疫監(jiān)視、免疫防護(hù)、免疫自穩(wěn)等過(guò)程中發(fā)揮重要的功能[14]。本研究中，與對(duì)照組比較，采用干擾素α-1b 聯(lián)合人免疫球蛋白治療的觀察組總有效率明顯高于對(duì)照組，且患兒臨床癥狀消失或消退時(shí)間短、病毒轉(zhuǎn)陰率高、并發(fā)癥總發(fā)生率較低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。分析其原因:一方面，人免疫球蛋白能夠抑制抗原、抗體復(fù)合物的形成，降低器官組織的炎性反應(yīng)，改善EBV感染患兒的臨床癥狀[15]；另一方面，觀察組患兒治療后自身免疫功能有所提高。EBV感染的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，機(jī)體免疫功能紊亂是導(dǎo)致炎性反應(yīng)進(jìn)行性加重及疾病發(fā)生、發(fā)展的重要原因。CD3+T淋巴細(xì)胞是機(jī)體介導(dǎo)細(xì)胞免疫功能的主要成分，包括CD4+T淋巴細(xì)胞亞群和CD8+T淋巴細(xì)胞亞群。正常情況下，CD4+和CD8+的數(shù)量和功能處于動(dòng)態(tài)平衡，維持機(jī)體正常的免疫應(yīng)答；在病理情況下，細(xì)胞免疫功能紊亂，表現(xiàn)為CD4+T淋巴細(xì)胞功能抑制，CD8+T淋巴細(xì)胞功能激活。CD4+/CD8+是評(píng)價(jià)機(jī)體細(xì)胞免疫功能的重要指標(biāo)，也可作為反映EBV感染患兒病情輕重的客觀指標(biāo)。本研究中，觀察組治療后IL-6、IL-8、TNF-α及CD8+降低，CD3+、CD4+及CD4+/CD8+升高，表明干擾素α-1b 聯(lián)合人免疫球蛋白能夠提高患兒的細(xì)胞免疫功能，促進(jìn)患兒疾病恢復(fù)。楊婷等[16]研究表明，干擾素α-1b 聯(lián)合人免疫球蛋白治療能夠通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等多種機(jī)制抑制效應(yīng)性T細(xì)胞，改善對(duì)腺病毒性重癥患兒的細(xì)胞免疫及體液免疫狀態(tài)，提高臨床治療的療效，與本研究結(jié)果一致。IL-6、IL-8、TNF-α是機(jī)體重要的促炎因子，一定程度上能夠反映機(jī)體炎性反應(yīng)及組織損傷嚴(yán)重程度。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，干擾素α-1b 聯(lián)合人免疫球蛋白能夠明顯降低IL-6、IL-8、TNF-α水平，從而減輕炎性反應(yīng)，與其他文獻(xiàn)報(bào)道一致[3]。

本研結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，觀察組在接受干擾素α-1b 聯(lián)合人免疫球蛋白治療后Ficolin-3、SH2D1A表達(dá)明顯降低(P<0.05)，表明Ficolin-3、SH2D1A是反映干擾素α-1b 聯(lián)合人免疫球蛋白治療效果的潛在指標(biāo)。分析其原因：干擾素α-1b 聯(lián)合人免疫球蛋白治療可能通過(guò)抑制補(bǔ)體凝集素途徑的過(guò)度激活，抑制T、B細(xì)胞的過(guò)度活化，恢復(fù)患兒機(jī)體正常免疫功能，改善EBV感染患兒的臨床治療效果[17]。有研究亦證實(shí)，干擾素能夠通過(guò)抑制適應(yīng)性抗病毒免疫反應(yīng)，抑制補(bǔ)體凝集素通路的過(guò)度激活，發(fā)揮治療作用[18]。本研究中相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)icolin-3、SH2D1A與IL-6、IL-8、TNF-α及CD8+呈正相關(guān)，與CD3+、CD4+及CD4+/CD8+呈負(fù)相關(guān)，提示Ficolin-3、SH2D1A表達(dá)水平有助于反映EBV感染患兒機(jī)體免疫功能狀態(tài)，是新的免疫相關(guān)分子標(biāo)志物。

綜上所述，對(duì)EBV感染患兒應(yīng)用干擾素α-1b聯(lián)合人免疫球蛋白進(jìn)行治療能夠縮短患兒癥狀持續(xù)時(shí)間，降低Ficolin-3、SH2D1A的表達(dá)，改善患兒免疫功能，提高治療有效性，值得臨床關(guān)注。