郝 鈺，李 波

濟(jì)南市中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科，山東濟(jì)南 250012

系統(tǒng)性硬化病(SSc)是一種結(jié)締組織病變，可累及皮膚、腎臟、心臟、消化道等，損害患者身心健康[1-2]。有研究認(rèn)為，SSc發(fā)病與免疫失調(diào)、環(huán)境、微小RNA(miRNA)、血管纖維化、長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)等有關(guān)[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)，輔助性T細(xì)胞17(Th17)/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)在SSc中失衡，其可能通過(guò)影響免疫水平影響SSc發(fā)生、發(fā)展[5]。另外，lncRNA人母系表達(dá)基因3(MEG3)在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)中呈低表達(dá)，其可能通過(guò)調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)，進(jìn)而影響RA病變過(guò)程[6]；而在SSc患者中，微小RNA-21(miR-21)可促進(jìn)纖維化，lncRNA MEG3可靶向調(diào)節(jié)miR-21表達(dá)[7-8]。由此推測(cè)，SSc患者中l(wèi)ncRNA MEG3表達(dá)水平可能與Th17/Treg平衡有關(guān)。本研究旨在通過(guò)測(cè)定lncRNA MEG3在SSc患者血清中的表達(dá)情況，分析lncRNA MEG3與Th17/Treg平衡的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年1月至2021年3月本院診治的54例SSc患者作為SSc組。其中男8例，女46例；年齡25～57歲，平均(41.35±12.56)歲；病程3～24個(gè)月，平均(13.78±8.29)個(gè)月。另選取同期54例體檢健康者作為對(duì)照組，其中男10例，女44例；年齡25～57歲，平均(42.63±12.70)歲；無(wú)自身免疫性疾病史。SSc組與對(duì)照組性別、年齡等比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。SSc組納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合文獻(xiàn)[9]中的SSc診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)病程≤24個(gè)月，臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并心血管疾病、急性感染者；(2)合并精神疾病、腫瘤者；(3)合并肝、腎原發(fā)性疾病者；(4)皮膚硬化且處于晚期、皮膚嚴(yán)重萎縮者；(5)哺乳期、妊娠期女性。本研究符合《赫爾辛基宣言》要求，獲得本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，且受試者及其家屬簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本收集 分別收集健康體檢者、SSc患者清晨空腹外周血6～7 mL，分成兩份，一份置于含肝素抗凝劑的抗凝管內(nèi)，用于Th17、Treg細(xì)胞百分比檢測(cè)；另一份置于5 mL EP管內(nèi)，自然凝集25 min后，3 800 r/min離心7 min(離心半徑為8 cm)，分離血清，于-80 ℃冰箱中保存。

1.2.2流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Th17、Treg細(xì)胞水平 取1.2.1中的抗凝血，按密度梯度離心法使用人Ficoll淋巴細(xì)胞分離液(上海雅吉生物科技有限公司)獲取外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)，利用RPMI 1640培養(yǎng)液(南京維森特生物技術(shù)有限公司)將PBMCs稀釋為1.5×106個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，流式細(xì)胞儀(型號(hào)：FACSCantoⅡ，美國(guó)BD公司)檢測(cè)Th17、Treg細(xì)胞百分比，求Th17/Treg比值。

1.2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)法檢測(cè)血清lncRNA MEG3、miR-21、維甲酸相關(guān)孤核受體γt(RORγt)mRNA、叉頭/翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子3(Foxp3)mRNA表達(dá)水平 解凍血清，按TRIzol試劑盒(上海愛必信生物科技有限公司)說(shuō)明書提取總RNA，用超微量分光光度計(jì)(美國(guó)Quawell公司)按cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(上?？道噬锟萍加邢薰?說(shuō)明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用2×SYBR Green QPCR mix試劑盒(美國(guó)AMEKO公司)及RT-qPCR儀(CFX96型，美國(guó)Bio-Rad公司)對(duì)cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。采用2-ΔΔCt法計(jì)算血清lncRNA MEG3、miR-21及Foxp3 mRNA、RORγt mRNA相對(duì)表達(dá)水平，lncRNA MEG3、RORγt、Foxp3以GAPDH為內(nèi)參，miR-21以U6為內(nèi)參，各引物序列見表1。

表1 lncRNA MEG3、Foxp3、RORγt、miR-21及GAPDH、U6的引物序列

2 結(jié) 果

2.1兩組血清lncRNA MEG3、miR-21及外周血Th17、Treg、Th17/Treg比較 與對(duì)照組相比，SSc組患者血清lncRNA MEG3表達(dá)水平、Treg細(xì)胞百分比降低(P<0.05)，miR-21表達(dá)水平、Th17細(xì)胞百分比、Th17/Treg升高(P<0.05)，見表2。兩組Th17(CD4+IL-17+)、Treg(CD4+CD25+Foxp3+)細(xì)胞水平見圖1、2。

表2 兩組血清lncRNA MEG3、miR-21及外周血Th17、Treg、Th17/Treg比較

注：A為對(duì)照組；B為SSc組；百分率為CD4+IL-17+/CD4+ T細(xì)胞比例。

注：A為對(duì)照組；B為SSc組；百分率為CD4+CD25+Foxp3+/CD4+ T細(xì)胞比例。

2.2兩組血清RORγt mRNA、Foxp3 mRNA表達(dá)水平比較 與對(duì)照組相比，SSc組患者血清RORγt mRNA表達(dá)水平升高(P<0.05)，F(xiàn)oxp3 mRNA表達(dá)水平降低(P<0.05)。見表3。

表3 兩組血清RORγt mRNA、Foxp3 mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較

2.3SSc患者血清lncRNA MEG3、miR-21表達(dá)水平與外周血Th17、Treg、Th17/Treg相關(guān)性 Pearson法分析顯示，SSc患者血清lncRNA MEG3表達(dá)水平與Th17、RORγt mRNA、Th17/Treg及血清miR-21表達(dá)水平與Treg、Foxp3 mRNA呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，血清lncRNA MEG3表達(dá)水平與Treg、Foxp3 mRNA及血清miR-21表達(dá)水平與Th17、RORγt mRNA、Th17/Treg呈正相關(guān)(P<0.05)。見表4。

表4 SSc患者血清lncRNA MEG3、miR-21表達(dá)水平與Th17、Treg、RORγt mRNA、Foxp3 mRNA的相關(guān)性

2.4SSc患者血清lncRNA MEG3表達(dá)水平與miR-21的相關(guān)性 Pearson法分析顯示，SSc患者血清lncRNA MEG3表達(dá)水平與miR-21呈負(fù)相關(guān)(r=-0.564，P<0.05)。見圖3。

圖3 SSc患者血清lncRNA MEG3表達(dá)水平與miR-21相關(guān)性

2.5影響SSc發(fā)生的影響因素分析 以是否發(fā)生SSc為因變量(發(fā)生=1，未發(fā)生=0)，采用Enter法納入和剔除變量(α剔除=0.10，α入選=0.05)，以lncRNA MEG3(實(shí)測(cè)值)、miR-21(實(shí)測(cè)值)、Th17(實(shí)測(cè)值)、Treg(實(shí)測(cè)值)、RORγt mRNA(實(shí)測(cè)值)、Foxp3 mRNA(實(shí)測(cè)值)、Th17/Treg(實(shí)測(cè)值)為自變量，Logistic回歸分析顯示，lncRNA MEG3是影響SSc發(fā)生的保護(hù)因素(P<0.05)，miR-21、Th17/Treg是影響SSc發(fā)生的危險(xiǎn)因素(P<0.05)。見表5。

表5 Logistic回歸分析SSc發(fā)生的影響因素

3 討 論

SSc是一種多發(fā)于女性的自身免疫系統(tǒng)疾病，以內(nèi)臟纖維化、皮膚增厚為主要特征，病死率高[10-11]，尋找與SSc發(fā)病相關(guān)因素并及時(shí)干預(yù)對(duì)改善患者生存情況有積極意義。

既往研究發(fā)現(xiàn)，miR-21在SSc血管病變及纖維增生性改變中起促進(jìn)作用，其可能是SSc的治療靶點(diǎn)[12]。lncRNA可調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫炎性反應(yīng)，且lncRNA MEG3作為lncRNA的一員，其可通過(guò)靶向調(diào)節(jié)miR-21表達(dá)，進(jìn)而影響銀屑病發(fā)生、發(fā)展[8,13]。有報(bào)道顯示，lncRNA MEG3在RA中表達(dá)下調(diào)，其可能靶向調(diào)節(jié)有關(guān)基因進(jìn)而影響RA病理變化[14]。研究顯示，lncRNA MEG3在強(qiáng)直性脊柱炎中表達(dá)水平降低，其可能調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)，進(jìn)而影響強(qiáng)直性脊柱炎病變進(jìn)程，lncRNA MEG3可能是治療強(qiáng)直性脊柱炎的潛在靶標(biāo)[15]。本研究探究了lncRNA MEG3、miR-21與SSc的關(guān)系，結(jié)果顯示，SSc患者血清lncRNA MEG3表達(dá)水平較低，與其在RA患者中的表達(dá)情況一致[14]，miR-21表達(dá)水平較高，與HENRY等[12]研究結(jié)果相符，提示lncRNA MEG3、miR-21表達(dá)失調(diào)可能與SSc發(fā)生有關(guān)。由此推測(cè)，lncRNA MEG3可能靶向調(diào)控miR-21，進(jìn)而調(diào)節(jié)血管病理變化，影響免疫炎性反應(yīng)，從而在SSc病變過(guò)程中發(fā)揮作用，但相關(guān)機(jī)制仍需深入研究。

免疫系統(tǒng)維持著機(jī)體對(duì)外界刺激的反應(yīng)與免疫耐受間的平衡，其中Th17/Treg平衡是保證免疫穩(wěn)態(tài)的重要環(huán)節(jié)，Th17/Treg在復(fù)發(fā)緩解型多發(fā)性硬化患者中較高，其可能在多發(fā)性硬化中起重要免疫調(diào)節(jié)作用[16]。RORγt、Foxp3分別是Th17、Treg細(xì)胞的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，RORγt影響Th17細(xì)胞分化及IL-17分泌，調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)，而Foxp3可與染色體結(jié)合，調(diào)控多種基因表達(dá)，在免疫功能、Treg細(xì)胞發(fā)育中具有重要作用[17-18]。本研究顯示，與體檢健康者相比，SSc患者Th17細(xì)胞百分比、Th17/Treg、血清RORγt mRNA表達(dá)水平較高，Treg細(xì)胞百分比及血清Foxp3 mRNA表達(dá)水平較低較低，與李丹等[16]、LEI等[19]、樂(lè)靜等[20]研究一致，提示Th17、Treg細(xì)胞、RORγt、Foxp3可能參與并影響SSc病理發(fā)展，分析可能原因，Th17細(xì)胞增多會(huì)增強(qiáng)免疫炎性反應(yīng)，Treg細(xì)胞減少會(huì)降低免疫炎癥抑制作用強(qiáng)度，Th17、Treg細(xì)胞比例失衡，打破免疫平衡，Th17、Treg細(xì)胞在SSc疾病進(jìn)展中起免疫調(diào)節(jié)作用，而RORγt、Foxp3可能通過(guò)影響Th17、Treg細(xì)胞功能，調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)，進(jìn)而在SSc中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。

此外，ZHENG等[21]報(bào)道顯示，miR-21可調(diào)節(jié)Th17/Treg平衡。本研究探討了lncRNA MEG3、miR-21表達(dá)水平與Th17、Treg、Th17/Treg的相關(guān)性，結(jié)果顯示SSc患者血清lncRNA MEG3、miR-21表達(dá)水平與Th17、Treg、Th17/Treg、RORγt、Foxp3 mRNA均相關(guān)，提示lncRNA MEG3、miR-21可能與RORγt、Foxp3、Th17、Treg、Th17/Treg共同影響SSc發(fā)病進(jìn)程。本研究還發(fā)現(xiàn)，SSc患者血清lncRNA MEG3表達(dá)水平與miR-21呈負(fù)相關(guān)，分析可能原因，lncRNA MEG3可能通過(guò)調(diào)節(jié)miR-21表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)Th17/Treg平衡，從而影響SSc病理進(jìn)展。Logistic回歸分析顯示，lncRNA MEG3表達(dá)降低，miR-21、Th17/Treg升高均會(huì)增加SSc發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，及時(shí)檢測(cè)上述指標(biāo)水平可能有助于及早診治SSc。

綜上所述，lncRNA MEG3在SSc患者中表達(dá)下調(diào)，與miR-21、Th17/Treg平衡密切相關(guān)，為臨床診治SSc提供了新思路。但本研究樣本量較小，后期需增加樣本量，從多中心、多角度探討lncRNA MEG3與SSc的關(guān)系，以提高研究的可靠性。