趙 奎，汪 蘭，孫衛(wèi)青，熊光權(quán)，喬 宇，吳文錦，李 新，丁安子

（1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工與核農(nóng)技術(shù)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品冷鏈物流技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430064；2.長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 荊州 434025）

斑點(diǎn)叉尾鮰（）俗名美國鮰魚、溝鲇，屬叉尾鮰科、叉尾鮰屬。1984年，斑點(diǎn)叉尾鮰從美國引進(jìn)，由于其易飼養(yǎng)、肉質(zhì)鮮美、蛋白質(zhì)含量較高，具有很大的營養(yǎng)價(jià)值和商品價(jià)值，因而成為我國優(yōu)良的水產(chǎn)養(yǎng)殖品種之一，同時(shí)也在世界范圍內(nèi)被廣泛接受，美國、日本等國家已對(duì)養(yǎng)殖斑點(diǎn)叉尾鮰進(jìn)行了不同方面的研究。

近年來，很多文獻(xiàn)報(bào)道不動(dòng)桿菌屬（）是肉類食品中的優(yōu)勢腐敗菌之一。史云嬌等研究發(fā)現(xiàn)，冷藏藏羊肉優(yōu)勢腐敗菌為不動(dòng)桿菌屬、陰溝腸桿菌屬（）、溶酪大球菌屬（）、糞腸球菌屬（）和氣單胞菌屬（）等；于美娟等對(duì)風(fēng)味小龍蝦的研究表明，冷藏鮮蝦中以嗜水氣單胞菌屬（）、巨形球菌屬（）、弧菌屬（）、不動(dòng)桿菌屬、檸檬酸桿菌屬（）和腸桿菌屬（）為主；胡秀彩等從草魚體內(nèi)分離得到致病性廈門不動(dòng)桿菌；羅土炎等從澳洲墨瑞鱈魚體中分離得到寄魚不動(dòng)桿菌。為豐富不同來源不動(dòng)桿菌的分離鑒定和低溫條件下鮰魚腐敗菌的相關(guān)研究，本研究以斑點(diǎn)叉尾鮰為原料，在4 ℃冷庫中取其背部肌肉組織進(jìn)行真空包裝，4 ℃冰箱中貯藏7 d，然后分離得到2 株細(xì)菌，分別編號(hào)為by 7-2、bs 7-3，進(jìn)行細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀察、革蘭氏染色及鏡檢、生化鑒定、16S rDNA測序及負(fù)染等方面研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

斑點(diǎn)叉尾鮰 湖北省武漢市某海鮮批發(fā)市場。

MAC培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、血平板培養(yǎng)基 青島海博生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌微量生化鑒定管 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；2×聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）Master Mix細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、DNA膠回收試劑盒 天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司；PCR板 愛思進(jìn)生物技術(shù)（杭州）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Mikro 120臺(tái)式離心機(jī) 廣州市華粵行儀器有限公司；DL-CJ-2NDH超凈工作臺(tái) 北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；Thermal Cycler 2720 PCR儀、3730XL測序儀美國ABI公司；DYY-6C電泳儀 北京六一儀器廠；BPC-150F生化培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；Gel DocTM XR+紫外分析儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 腐敗菌的分離純化

在4 ℃無菌冷庫（使用紫外燈照射30 min）中將鮰魚進(jìn)行宰殺，去除鱗片、魚頭及內(nèi)臟，進(jìn)行無菌取樣，取背鰭附近肌肉組織約20 g，真空包裝后4 ℃冷藏7 d。在超凈工作臺(tái)上取適量冷藏樣品切碎，然后放入裝有200 mL生理鹽水的錐形瓶中振蕩均勻，制成菌懸液。將菌懸液進(jìn)行一系列梯度稀釋，取適當(dāng)濃度梯度的菌懸液1 mL于LB瓊脂培養(yǎng)基和血平板培養(yǎng)基中，在37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h。挑選各個(gè)平板上白色圓形菌落，用平板劃線法分離純化菌株，選取形成菌落形狀穩(wěn)定的菌株并分別編號(hào)為by 7-2、bs 7-3。

1.3.2 革蘭氏染色、生化鑒定及負(fù)染

分離得到的菌種進(jìn)行革蘭氏染色，然后鏡檢觀察細(xì)菌的形態(tài)、大小及顏色等。將分離菌種接種至生化微量鑒定管中，然后在37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察并記錄生化鑒定結(jié)果。參考朱艷等的方法加以修改，取菌株by 7-2、bs 7-3的菌懸液置于以福爾瓦為膜的銅網(wǎng)上，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%（pH 7.0）磷鎢酸溶液負(fù)染2～3 min，然后自然干燥，用透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）觀察、拍照。

1.3.3 細(xì)菌DNA提取、16S rDNA測序及PCR擴(kuò)增

因傳統(tǒng)的生化檢驗(yàn)方法對(duì)微生物進(jìn)行正確分類鑒定存在困難，而且容易出錯(cuò)。王恒安等用革蘭氏陰性細(xì)菌檢測實(shí)驗(yàn)卡鑒定某一菌種為醋酸不動(dòng)桿菌，而16S rDNA序列分析結(jié)果和進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示為約翰遜不動(dòng)桿菌。革蘭氏染色是鑒別微生物的重要手段之一，但并不能準(zhǔn)確鑒定微生物的物種，故進(jìn)行菌種鑒定時(shí)有必要運(yùn)用核酸雜交和序列分析進(jìn)行鑒定。參照趙欣宇等的方法提取細(xì)菌總DNA，然后將純化的DNA進(jìn)行測序。PCR擴(kuò)增體系（30 μL）為：2×PCR Mix 15 μL、DNA 1 μL、上、下游引物（27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG、1492R：TACGG（C/T）TACCTTGTTACGACTT，濃度均為10 mmol/L）各1 μL、ddHO 12 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s、58 ℃復(fù)性30 s、72 ℃延伸45 s，循環(huán)35 次；72 ℃延伸5 min；4 ℃保溫。將PCR反應(yīng)產(chǎn)物送至天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司進(jìn)行測序。

1.3.4 系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

通過NCBI的BLAST檢索系統(tǒng)對(duì)菌株by 7-2、bs 7-3提取獲得的16S rDNA序列進(jìn)行相同序列檢索，選取合理且相似性高的DNA序列，然后使用MEGA 7.0.26軟件（美國MEGA公司）的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株菌落形態(tài)、革蘭氏染色及負(fù)染結(jié)果

從鮰魚背鰭肌肉組織中分離純化得到2 株菌株，分別編號(hào)為by 7-2、bs 7-3。細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀察、革蘭氏染色鏡檢及負(fù)染結(jié)果為：菌株by 7-2在LB瓊脂培養(yǎng)基上為圓形、濕潤、白色菌落，進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢結(jié)果為革蘭氏陰性短桿菌，取菌懸液進(jìn)行負(fù)染結(jié)果顯示為短桿菌且無鞭毛（圖1A～C）；菌株bs 7-3在LB瓊脂培養(yǎng)基上為圓形、濕潤、乳白色菌落，進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢結(jié)果為革蘭氏陰性短桿菌，取菌懸液進(jìn)行負(fù)染顯示為長桿菌且無鞭毛（圖1A～C）。

圖1 by 7-2、bs 7-3菌株菌落（A）、革蘭氏染色（B）及負(fù)染后TEM圖（C）Fig. 1 Bacterial colonies (A), Gram staining (B) and negative staining (C)of strains by 7-2 and bs 7-3

2.2 菌株生化鑒定結(jié)果

分別將菌株by 7-2、bs 7-3接種至微量生化鑒定管中，然后在37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h。由表1可知：菌株by 7-2的硝酸鹽還原、精氨酸雙水解酶、乙酰胺酶、分解木糖、分解麥芽糖、分解甘露醇、利用檸檬酸鹽、DNA酶、O-F實(shí)驗(yàn)和氧化酶實(shí)驗(yàn)均為陰性；菌株bs 7-3的硝酸鹽還原、精氨酸雙水解酶、乙酰胺酶、分解木糖、分解麥芽糖、分解甘露醇、DNA酶和氧化酶實(shí)驗(yàn)均為陰性，而利用檸檬酸鹽和O-F實(shí)驗(yàn)為陽性。與《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》比對(duì)分析可知，菌株by 7-2和菌株bs 7-3均與不動(dòng)桿菌屬的生化特性基本相同。

表1 菌株by 7-2、bs 7-3生化鑒定實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Biochemical test results of strains by 7-2 and bs 7-3

2.3 菌株16S rDNA基因測序、系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建及分析

分別以菌株by 7-2、bs 7-3細(xì)菌基因組DNA為模板，使用PCR擴(kuò)增16S rDNA片段。由圖2可知，2 個(gè)菌株均在約1 500 bp處有明顯目的條帶。進(jìn)一步對(duì)16S rDNA測序表明，菌株by 7-2目的片段大小為1 398 bp，菌株bs 7-3目的片段大小為1 408 bp。

圖2 純化菌種16S rDNA電泳圖Fig. 2 16S rDNA electropherogram of purified strains

將各個(gè)菌落的16S rDNA片段通過BLAST檢索系統(tǒng)進(jìn)行序列比對(duì)分析及構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，由圖3～4可知，菌株by 7-2與約翰遜不動(dòng)桿菌親緣關(guān)系最近，相似度達(dá)99.90%，菌株bs 7-3與抗輻射不動(dòng)桿菌親緣關(guān)系最近，相似度達(dá)99.79%。

圖3 純化菌種by 7-2系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 3 Phylogenetic tree of strain by 7-2

圖4 純化菌種bs 7-3系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 4 Phylogenetic tree of strain bs 7-3

3 討 論

不動(dòng)桿菌屬是需氧、不發(fā)酵、氧化酶陰性的革蘭氏陰性桿菌，極易產(chǎn)生抗藥性，一般認(rèn)為是條件致病菌。不動(dòng)桿菌屬被認(rèn)為是重要的醫(yī)院病原菌，特別是鮑氏不動(dòng)桿菌，由于其具有較強(qiáng)抗藥性，故難以治療，且已發(fā)現(xiàn)由鮑曼不動(dòng)桿菌引起的疑似新型冠狀病毒肺炎。Visca、Wang Tian等在進(jìn)行不動(dòng)桿菌病例分析時(shí)，對(duì)其進(jìn)行革蘭氏染色，結(jié)果呈現(xiàn)出假陽性，本次實(shí)驗(yàn)同樣也曾將不動(dòng)桿菌染成陽性。具體分析原因，可能是部分不動(dòng)桿菌屬菌株具有保留結(jié)晶紫并抵抗脫色的能力，從而誤將該菌認(rèn)為是革蘭氏陽性菌。抗輻射不動(dòng)桿菌除了抗輻射外，還能抵抗一定劑量的過氧化氫和紫外照射，因此很容易從醫(yī)院等環(huán)境中分離出。不動(dòng)桿菌屬作為致病菌，因其容易產(chǎn)生泛耐藥性并在醫(yī)院內(nèi)引起醫(yī)療保健相關(guān)感染暴發(fā)而受到越來越多的關(guān)注。不動(dòng)桿菌不止感染人類，也是魚類致病菌，從而導(dǎo)致魚類患病或死亡，其中約翰遜不動(dòng)桿菌是導(dǎo)致斑點(diǎn)叉尾鮰腸套疊的致病菌之一，約翰遜不動(dòng)桿菌的感染也會(huì)導(dǎo)致短須裂腹魚大量死亡。

目前研究顯示，不動(dòng)桿菌屬的分離源在食物中非常普遍，在果蔬、肉類、魚類、乳和乳制品及飲用水中均有分離。不動(dòng)桿菌還是一種常見的腐敗菌，雖然其致腐能力較低，且不會(huì)產(chǎn)生有臭味的副產(chǎn)物，但是能增強(qiáng)假單胞菌和希瓦氏菌的腐敗能力，主要是由于希瓦氏菌無法產(chǎn)生酰基高絲氨酸內(nèi)酯（acyl homoserine lactones，AHLs）群體感應(yīng)信號(hào)，但可以利用不動(dòng)桿菌產(chǎn)生的3 種AHLs（C-HSL、O-C-HSL、O-C-HSL），尤其是C-HSL可以促進(jìn)希瓦氏菌的生長，且希瓦氏菌利用不動(dòng)桿菌產(chǎn)生的AHLs可產(chǎn)生4 倍多的胞外蛋白酶，而O-C-HSL可以增強(qiáng)希瓦氏菌硫氧化蛋白還原酶trxB mRNA的表達(dá)，從而加快魚類的腐敗變質(zhì)。不動(dòng)桿菌屬是斑點(diǎn)叉尾鮰的優(yōu)勢腐敗菌之一，可以利用氨基酸生長繁殖同時(shí)產(chǎn)生酯類、酸類等物質(zhì)，造成食品變酸、腐敗?？馆椛洳粍?dòng)桿菌可生活在偏堿性的環(huán)境中，因而其產(chǎn)生的脂肪酶在堿性條件下具有較強(qiáng)的活性，對(duì)中長鏈脂肪具有較好的選擇性。釀酒酵母能夠刺激不動(dòng)桿菌屬某些細(xì)菌的生長，其促進(jìn)因子為乙醇，原因在于部分不動(dòng)桿菌缺乏生成乙醇的乙醇脫氫酶，低劑量的乙醇不僅能促進(jìn)菌株生長，還可以改變其生理功能，增強(qiáng)不動(dòng)桿菌對(duì)鹽的抵抗力及致病性，從而加快魚類腐敗，增強(qiáng)對(duì)人的致病能力。Wang Xinyun等通過超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法評(píng)估大眼金槍魚腐敗中約翰遜不動(dòng)桿菌和熒光假單胞菌共同培養(yǎng)的代謝變化，結(jié)果表明，由于戊糖和葡萄糖醛酸的相互轉(zhuǎn)化、苯丙氨酸代謝和氨基酸變化，使得共同培養(yǎng)產(chǎn)生特殊的代謝產(chǎn)物，從而加快了腐敗進(jìn)程。趙丹丹等研究真菌發(fā)酵魚糜中鮑氏不動(dòng)桿菌腐敗能力及其群體感應(yīng)現(xiàn)象，結(jié)果表明，鮑氏不動(dòng)桿菌具有較強(qiáng)的蛋白水解酶活性，在其繁殖過程中會(huì)產(chǎn)生大量有機(jī)酸和揮發(fā)性鹽基氮。綜上表明，不動(dòng)桿菌屬是食品中常見的腐敗菌和致病菌，因而應(yīng)得到廣泛的重視。

4 結(jié) 論

通過平板分離純化，從冷藏鮰魚肌肉組織中分離、鑒定得到2 株菌株，分別編號(hào)為by 7-2、bs 7-3，經(jīng)革蘭氏染色、生化鑒定、16S rDNA基因測序及系統(tǒng)發(fā)育樹分析，結(jié)果表明，by 7-2與約翰遜不動(dòng)桿菌親緣關(guān)系最近，相似度達(dá)99.90%，bs 7-3與抗輻射不動(dòng)桿菌親緣關(guān)系最近，相似度達(dá)99.79%。冷藏是魚類運(yùn)輸?shù)闹饕绞街唬緦?shí)驗(yàn)通過對(duì)鮰魚肌肉組織進(jìn)行真空包裝，并在4 ℃冷藏條件下貯藏7 d，分離出不動(dòng)桿菌，表明不動(dòng)桿菌具有一定抗低溫及在缺氧時(shí)仍能存活的能力，結(jié)果為研究魚類腐敗、豐富魚源不動(dòng)桿菌及研究不動(dòng)桿菌提供了參考。