宋來超，劉芳彬，王晨羽，丁兆堂，孫海偉，馬青平

(1. 聊城大學農(nóng)學院，山東 聊城 252000；2. 山東省農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所，山東 日照 276800；3. 泰安市農(nóng)業(yè)科學研究院茶葉研究所，山東 泰安 271001)

細胞色素P450 (cytochrome P450，簡稱CYP450)為一種B 族細胞色素，其輔基為血紅素，屬于強大的超基因家族蛋白酶之一，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體內(nèi)膜是真核生物中CYP450 存在的主要場所。 CYP450 最早發(fā)現(xiàn)于大鼠肝微粒體中，1969年Frear 等[1]從棉花(Gossypium hirsutumL.)中發(fā)現(xiàn)了CYP450，這是首次發(fā)現(xiàn)植物細胞中存在CYP450。 隨后，人們分別從擬南芥(Arabidopsis thalianaL.)[2]、水稻(Oryza sativaL.)[3]、小麥(Triticum aestivumL.)[4]等植物中發(fā)現(xiàn)了CYP450的存在。

不同家族CYP450 的氨基酸序列具有一定的保守性，即CYP450 在不同物種之間具有同源性，其三級結(jié)構(gòu)均由N 端的β 折疊和C 端的α 螺旋構(gòu)成。 在所有CYP450 的典型保守結(jié)構(gòu)域中，C末端血紅素的結(jié)合域含有FXXGXRXCXG 保守序列，這是鑒定CYP450 的主要特征結(jié)構(gòu)，其中的半胱氨酸(Cys)具有完全保守性；K 螺旋區(qū)域中具有保守序列EXXR，其中谷氨酸(Glu)和精氨酸(Arg)完全保守；PDR 結(jié)構(gòu)域中具有保守序列PXRX。

CYP450在植物不同組織、不同發(fā)育時期及不同脅迫條件下的表達存在較為明顯的差異。F3′H基因?qū)儆贑YP75B2 家族基因，茶樹F3′H基因在第一葉、第二葉、第三葉、第四葉、嫩莖、根、老葉中的表達水平依次降低，在根和老葉中幾乎不表達[5]。 崔會婷[6]研究發(fā)現(xiàn)蒺藜苜蓿葉中的Mt-CYP450基因表達量最高，且從嫩苗期到結(jié)果期呈先上升后下降的趨勢。 茶樹CYP71A26與CYP71B34基因受蟲害脅迫時分別表現(xiàn)為上調(diào)和下調(diào)表達，而受冷熱脅迫時則分別表現(xiàn)為下調(diào)和上調(diào)表達[7]；受干旱、高溫、氮脅迫、鹽脅迫的影響，高羊茅P450 基因的表達表現(xiàn)為上調(diào)趨勢[8]。

CYP450 在植物體內(nèi)起重要作用，主要分為兩類:一是參與多種植物內(nèi)源性物質(zhì)的代謝與合成，在苯丙烷代謝產(chǎn)物木質(zhì)素、黃酮、異黃酮等物質(zhì)的合成過程中發(fā)揮重要作用，且其在黃酮生物合成中的作用底物廣泛，對同一位點結(jié)構(gòu)相似的化合物能夠同時進行催化[9]。 研究表明，鹽和植物根際促生菌(PGPR) 接種聯(lián)合處理誘導的CYP94B3基因可參與茉莉酸(JA)代謝[10]；煙草香氣物質(zhì)西柏三烯二醇的合成受CYP71D16基因的催化[11]；CYP71AU87可催化萜類的合成與代謝過程[12]；肉桂酸羧化酶(C4H)屬于CYP450 家族酶系，滇水金鳳(Impatiens uliginosaFranch)的C4H1、C4H2基因可催化反式肉桂酸轉(zhuǎn)化為香豆酸[13]；紫蘇和蝴蝶草的CYP93B1、CYP93B2基因可參與黃酮合成酶Ⅱ的合成并發(fā)揮最重要的作用，其中黃酮合成酶Ⅱ?qū)儆贑YP93 亞家族，是黃酮類化合物合成過程中的關(guān)鍵酶；花青素、縮合單寧化合物的合成離不開CYP75 的參與，CYP75 對黃酮化合物的C3′位、C5′位上的羥基化具有催化作用[14]；CYP93B 亞家族能夠催化黃酮類化合物C2 位羥基化并使其脫水，形成C ＝C[15]，如CYP93B10 和CYP93B11 可將黃酮類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為2-羥基黃酮。 二是參與生物體代謝解毒。 植物生長過程中常會受到多種病蟲的侵害或化學藥品的毒害，細胞色素P450 作為解毒過程中的關(guān)鍵酶能將除草劑、殺蟲劑等外源化學物質(zhì)轉(zhuǎn)化為無毒物質(zhì)。 研究發(fā)現(xiàn)，棉鈴蟲CYP9A 亞家族6 個成員及CYP6B 亞家族四個成員能代謝殺蟲劑菊戊酸酯[16]，多個細胞色素P450 的過表達可使致倦庫蚊(Culex quinquefasciatus)種群對氯菊酯類殺蟲劑的抗性增強[17]。

茶樹[Camellia sinensis(L.) O. Kuntze]是山茶科山茶屬中種植最為廣泛的植物，也是三大飲品之一。 黃酮類化合物是它的次生代謝產(chǎn)物之一，其骨架為C6-C3-C6，主要包括黃酮、異黃酮、花青素等天然化合物。 黃酮類化合物在茶葉中含量豐富，可影響茶葉的品質(zhì)、滋味以及色澤等，其中黃酮醇類物質(zhì)可增強咖啡堿的苦味，同時使茶湯干燥柔和，有更好的收斂感[18]，其含量決定著綠茶的湯色。 CYP450 作為“萬能生物催化劑”，可參與黃酮類化合物的生物合成，間接影響茶葉的品質(zhì)。

本試驗以不同季節(jié)的長清茶葉片為材料提取RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，通過轉(zhuǎn)錄組分析(登錄號PRJNA830980)篩選得到CsCYP94B3基因，將茶樹及與其同源性較高的26 個物種的CYP94B3進行蛋白序列比對并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，運用實時熒光定量PCR 技術(shù)測定不同季節(jié)CsCYP94B3的相對表達量，以期為長清茶采摘及品質(zhì)提高提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

長清茶鮮葉采自濟南市長清區(qū)立泰山、圣虎山、南湖玉露3 個茶園中，采摘時間均為2020年春季(5月)、夏季(7月)和秋季(9月)晴朗無風天氣的9 時，采摘的葉片均為一芽二葉、長勢良好、生長均勻、無病蟲害。 葉片采摘后用2 mL 離心管封存，立即于液氮中速凍，然后置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆?，樣品設(shè)置3 次生物學重復。

1.2 試劑與設(shè)備

華越洋快速通用植物RNA 提取試劑盒、Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit、2000 DNA Marker、2×TaqPlus Master Mix (Dye Plus)、5×DNA Loading buffer、Biomarker 2×SYBR Green Fast qPCR Mix、瓊脂糖，PCR 儀、離心機、高通量組織研磨儀、紫外透射儀、金屬浴、渦旋振蕩器、超微量紫外分光光度計。

1.3 總RNA 提取與第一鏈cDNA 合成

使用高通量組織研磨儀將經(jīng)過液氮速凍的長清茶葉片研磨成粉末，按照華越洋快速通用植物RNA 提取試劑盒說明書的操作步驟提取總RNA。總RNA 在1%瓊脂糖凝膠電泳上檢測完整度，并使用超微量紫外分光光度計測其濃度和純度。 吸取1 μg RNA，用Thermo Fermentas 反轉(zhuǎn)錄試劑盒K1622 合成第一鏈cDNA。 逆轉(zhuǎn)錄的反應條件為42℃溫育60 min，70℃反應5 min(此步反應目的為使逆轉(zhuǎn)錄酶失活)，反應結(jié)束后將制備好的cDNA 置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 CYP94B3 生物信息學分析

將通過轉(zhuǎn)錄組分析(登錄號PRJNA830980)篩選得到的CsCYP94B3基因，通過NCBI 中的BLAST 進行CsCYP94B3基因的同源性比對，獲得與該基因同源性較高的榴蓮(Durio zibethinus)、葡萄(Vitis vinifera)、銀白楊(Populus alba)、柑橘(Citrus sinensis)、歐洲木犀欖(Olea europaeasubsp.europaea)、小果咖啡(Coffea arabica)、番茄(Solanum lycopersicum)、野生煙草(Nicotiana attenuata)、可可樹(Theobroma cacao)等26 個物種的蛋白序列，并將CsCYP94B3基因序列通過DNAMAN 軟件翻譯成蛋白序列。 使用ExPASy 網(wǎng)站分析CYP94B3 氨基酸的組成、理化性質(zhì)及疏水性。 選取葡萄、榴蓮、可可樹3 個代表性物種與茶樹的CYP94B3 蛋白序列使用DANMAN 軟件進行多重序列比對。 將茶樹與其他26 個物種的CYP94B3 蛋白序列使用MEGA-X 中的鄰位相連法(Neighbor-joining)-泊松模型構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.5 實時熒光定量PCR

利用實時熒光定量PCR 測定CsCYP94B3基因在春、夏、秋季茶葉中的表達量。 PCR 總體系20 μL:cDNA 2 μL，10 μmol/L 上下游引物各0.5 μL (F:5′-AGCACATTCTCAAGACCAACTTC-3′，R:5′-ACTCGTGACTCGCTAACTTCC-3′)，無菌水7 μL，Biomarker 2×SYBR Green Fast qPCR Mix 10 μL。 反應程序為:95℃3 min；95℃5 s，60℃30 ～40 s，共45 個循環(huán)。CsGAPDH基因為內(nèi)參基因，CsCYP94B3基因的相對表達量用2-ΔΔCt法計算，統(tǒng)計分析使用SPSS 18.0 和Microsoft Excel 2010 軟件進行，差異顯著性分析基于Duncan’s 多重比較的單因素方差分析進行，P＜0.05 表示兩兩之間差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶樹CYP94B3 蛋白理化性質(zhì)及疏水性分析

根據(jù)ExPASy 網(wǎng)站分析結(jié)果，CsCYP94B3 的蛋白質(zhì)分子量為58.79 kDa，理論等電點為8.76；氨基酸殘基數(shù)為518 個，堿性氨基酸的平均含量為15%，酸性氨基酸的平均含量為10%，芳香族氨基酸約占10%，雜環(huán)族氨基酸約占9%，脂肪族氨基酸約占81%；不穩(wěn)定指數(shù)為41.51，屬于不穩(wěn)定蛋白；總平均疏水性-0.052，為可溶性蛋白。 疏水性分析(圖1)發(fā)現(xiàn)，CsCYP94B3 蛋白疏水性在第16 位亮氨酸(Ile)具有最大值2.900，在第32位組氨酸(His)具有最小值-3.411，為親水蛋白。

圖1 茶樹CYP94B3 蛋白疏水性分析

2.2 不同物種CYP94B3 蛋白多重序列比對分析

多重序列比對(圖2)發(fā)現(xiàn)，茶樹CYP94B3 蛋白序 列 與 葡 萄、 榴 蓮、 可 可 樹3 個 物 種 的CYP94B3 蛋白序列一致性為80. 41%，且其CYP94B3 蛋白序列都含有PDR 結(jié)構(gòu)域(PXRX)、K 螺旋(EXXR)以及C 末端的血紅素結(jié)合域(FXXGXXXCXG)，其中血紅素結(jié)合域是鑒別細胞色素P450 基因的主要特征結(jié)構(gòu)，因此，茶樹、葡萄、榴蓮、可可樹的CYP94B3基因均為細胞色素P450 亞家族基因。

2.3 茶樹與其他物種的CYP94B3 進化樹構(gòu)建

將茶樹與歐洲木犀欖、小果咖啡、煙草等26個物種的CYP94B3 蛋白序列使用MEGA-X 軟件中的鄰位相連法(Neighbor-joining)-泊松模型構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，結(jié)果(圖3)顯示，茶樹與中華獼猴桃、大桉、歐洲木犀欖、小果咖啡、番茄、野生煙草6 個物種的親緣關(guān)系較近，與其他20 個物種的親緣關(guān)系較遠。

圖3 茶樹及其他物種CYP94B3 的系統(tǒng)進化樹分析

2.4 CsCYP94B3 在不同季節(jié)長清茶新梢中的表達變化

CsCYP94B3基因在3 個茶園長清茶樹的春、夏、秋新梢中均可表達，但不同季節(jié)、不同地理條件間存在差異(圖4)。 在立泰山、圣虎山、南湖玉露3 處茶園茶樹中，CsCYP94B3基因在夏季茶樹新梢中的相對表達量明顯高于春秋兩季，且與圣虎山茶園春季、南湖玉露茶園春秋兩季差異達顯著水平。 圣虎山和南湖玉露茶園的茶樹新梢中CsCYP94B3基因相對表達量秋季略高于春季，但差異不顯著；立泰山茶園茶樹新梢中CsCYP94B3基因相對表達量春秋兩季相當。 表明CsCYP94B3基因的表達與環(huán)境條件有關(guān)，可響應季節(jié)變化，表現(xiàn)為夏季上調(diào)表達。

圖4 不同茶園不同季節(jié)長清茶中CYP94B3基因的相對表達量

3 討論與結(jié)論

P450 廣泛存在于動植物等細胞中，同一種植物的不同組織中都有分布但含量各不相同，其基因的表達量受到不同外界因素的調(diào)控[19]。 本研究結(jié)果表明，茶樹與中華獼猴桃、大桉、歐洲木犀欖、小果咖啡、番茄、野生煙草的CYP94B3 親緣關(guān)系較近，而與其他20 個物種親緣關(guān)系較遠，這種現(xiàn)象可能與細胞色素P450 堿基易突變有關(guān)。 前人研究發(fā)現(xiàn)，CYP704B2基因在第4 個外顯子處常發(fā)生多對堿基的替換或缺失，從而造成氨基酸的轉(zhuǎn)變或缺失[20]。 因此，不同物種CYP94B3 常在系統(tǒng)進化樹上發(fā)生分離。

本試驗通過實時熒光定量PCR 分析了不同茶園不同季節(jié)長清茶CYP94B3基因的相對表達量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3個茶園的長清茶CYP94B3基因均在夏季表達量最高，推測夏季溫度高、光照強，長清茶生長代謝最旺盛，需要更多的細胞色素P450參與多種內(nèi)源物質(zhì)的合成與代謝反應。

綜上所述，茶樹CYP94B3基因的表達受季節(jié)因素調(diào)控，夏季上調(diào)表達，且南湖玉露和圣虎山的CsCYP94B3基因表達量夏季明顯高于春秋季。 這將為長清茶采摘及品質(zhì)提高提供一定的參考，并為通過人工干預給茶樹創(chuàng)造適宜的生長環(huán)境以提高茶葉品質(zhì)和產(chǎn)量奠定基礎(chǔ)。