安 碩,姚玲婭,張 鵬,胡 悅,葛曉春

(1.復旦大學 生命科學學院,上海 200438;2.復旦大學遺傳工程國家重點實驗室,上海 200438)

水稻為地球上35億多人口提供主食,其種植遍及全球多個農(nóng)業(yè)氣候區(qū)[1]。我國地處北溫帶和熱帶,地理跨度大,但是北到黑龍江,南到海南均以水稻為主栽作物。由于各種植區(qū)地理和氣候條件千變?nèi)f化,水稻在其生長過程中可能會遭受各種環(huán)境因素的脅迫,包括干旱、高鹽、高低溫等,它們均可能對水稻的生長和產(chǎn)量造成嚴重影響[2-5]。水稻喜溫卻不耐熱,最佳生長環(huán)境溫度在28～30℃,氣溫如果持續(xù)超過35℃,會導致大部分品種產(chǎn)量下降而且品質(zhì)變差。隨著全球人口膨脹和工業(yè)化程度的加深,碳排放加劇,從長遠來看,全球氣溫將處于上升趨勢。對于氣候變暖后果的預測表明,高溫可能會嚴重影響亞洲包括我國的水稻種植,導致水稻的產(chǎn)量大幅下降[6]。我國大部分人口均以水稻為主食,對稻米的需求量尤其巨大,開展水稻抗逆研究,尤其是耐高溫新品種的培育對于國計民生來說至關(guān)重要。尋找植物抗逆尤其是耐高溫基因,通過分子育種技術(shù)將相關(guān)基因轉(zhuǎn)入水稻栽培品種中,改良水稻的耐逆性,是穩(wěn)定異常氣候條件下糧食作物產(chǎn)量的重要手段。

本實驗室前期發(fā)現(xiàn)并報道了一個干旱脅迫響應(yīng)基因OsPM1,該基因編碼一個細胞膜蛋白,可以向細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運ABA,從而影響氣孔導度,調(diào)控水稻對干旱的耐受能力[7]。過表達OsPM1的轉(zhuǎn)基因植株顯示出較強的耐旱性[7]。ABA作為植物的逆境激素,在應(yīng)對干旱、高鹽、高溫等多種非生物脅迫的應(yīng)答中都發(fā)揮著重要作用[8-10]。在正常生長條件下,ABA在體內(nèi)的含量較低,PP2Cs磷酸酶與Sn RK2s蛋白激酶結(jié)合并抑制后者的激酶活性,ABA信號通路被抑制;在脅迫條件下,植物體內(nèi)ABA大幅增多并與ABA受體(PYR/PYL/RACR)結(jié)合,受體發(fā)生構(gòu)象改變,然后與PP2Cs磷酸酶結(jié)合形成三元復合體,從而釋放出SnRK2s蛋白激酶,使得其活性被激活,SnRK2s激活后磷酸化下游的離子通道或轉(zhuǎn)錄因子,進而改變細胞內(nèi)的離子濃度或調(diào)控下游一系列基因的表達[9-13]。OsPM1作為ABA轉(zhuǎn)運蛋白,影響了細胞內(nèi)ABA水平,從而影響植物的逆境響應(yīng),我們在前期工作中僅僅報道了OsPM1過表達的抗旱表型和其作用機理[7],但由于ABA激素的重要性和在逆境響應(yīng)中的廣泛性,我們推測OsPM1過表達除了增強水稻的耐旱性外,可能還影響了水稻耐受其他非生物逆境的能力,但是否如此需要進一步的實驗證實。

在植物逆境響應(yīng)過程中,轉(zhuǎn)錄因子可以與下游基因啟動子上的順式作用元件結(jié)合,從而激活或者抑制下游基因的表達。第一個調(diào)控熱脅迫反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子是在酵母中鑒定到的,被命名為熱休克轉(zhuǎn)錄因子(Heat shock transcription factors,Hsfs)[14]。Hsfs在植物的熱應(yīng)激反應(yīng)中具有重要功能,它可以與熱休克蛋白(Heat Shock Proteins,HSPs)基因上游的熱休克元件(Heat Shock Elements,HSEs)結(jié)合[15-22]。除了熱脅迫之外,還有人發(fā)現(xiàn)Hsfs的表達增強了植物耐受其他非生物脅迫包括氧化、高鹽、冷脅迫的能力[23]。番茄過表達自身的HsfA1時,具有更強的耐熱性[24]。在擬南芥中過表達AtHsfA2時,其對熱脅迫和氧化脅迫的耐受性均增強[25]。為了增強水稻的耐熱性,將熱脅迫轉(zhuǎn)錄因子置于一個逆境高度響應(yīng)的啟動子之后,提高熱脅迫下轉(zhuǎn)錄因子的表達水平,并避免其在正常條件下的高表達,則有可能既提高水稻的耐熱性,又不影響其在正常條件下的生長發(fā)育。高粱是禾本科植物中一類耐熱性較強的作物,其熱休克轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)節(jié)其耐熱性上起重要作用。我們推測,在水稻中異源表達高粱的Hsfs家族基因,并控制其在正常情況下的表達,很可能獲得具有較高耐熱性的水稻品種。

1 材料與方法

1.1 植物材料、菌株與載體

實驗水稻(OryzasativaL.)均為粳稻日本晴,OsPM1及OsPM1::SbHsf03的轉(zhuǎn)基因株系均以日本晴為背景構(gòu)建;大腸桿菌菌株為E.coliDH5α;農(nóng)桿菌菌株為AgrobacteriumEHA105;植物轉(zhuǎn)基因載體為p CAMBIA1301ubi、pCAMBIA1302;雙螢光素酶報告系統(tǒng)載體為p CHF3、p GreenⅡ0800-LUC。

1.2 方法

1.2.1 脅迫處理

RT-qPCR實驗中脅迫處理:水稻種子用3%雙氧水消毒0.5 h,然后用蒸餾水洗3遍,置蒸餾水中,于室溫泡種兩天至露白,將剛剛露白的種子放入底部有孔的96孔板中,每一個孔放入一粒種子,放在盛有水稻營養(yǎng)液(木村B)的槍頭盒中培養(yǎng)(28℃,16 h光照/8 h黑暗),至三葉期后進行不同脅迫處理。分別用20%PEG處理24 h、200 mmol/L NaCl處理24 h、50μmol/L ABA處理12 h、45℃處理4 h、0℃處理4 h,處理結(jié)束后收集水稻葉片,同時取未處理的水稻葉片作對照,重復3次取樣。另外,為了觀察OsPM1對熱處理的時間響應(yīng)曲線,將三葉期幼苗在45℃下熱處理不同時間后取樣。

OsPM1轉(zhuǎn)基因株系脅迫處理:各株系種子去殼后先用70%的乙醇浸泡1 min,再用50%的次氯酸鈉浸泡20 min,然后用無菌水清洗3次并鋪于濾紙上晾干,清洗過程在超凈工作臺中進行。準備MS的對照平板、添加了200 mmol/L NaCl的高鹽脅迫平板和添加了5%甘露醇的滲透脅迫平板。將晾干的種子放入各平板中,在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 d后拍照并測量苗長,比較正常平板上和脅迫平板上的生長差異。熱脅迫處理:將在營養(yǎng)液中生長14 d的水稻放入45℃的高溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 d(RNAi株系)和5 d(過表達株系)(12 h 45℃光照/12 h 28℃黑暗),觀察植株表型,檢測正常條件下及高溫處理條件下植物的離子泄漏率。

OsPM1::SbHsf03重組基因轉(zhuǎn)基因株系熱脅迫處理:將正常條件下生長兩周的轉(zhuǎn)基因幼苗轉(zhuǎn)入45℃高溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng),46 h后觀察植株表型,并統(tǒng)計卷葉率,檢測處理前及高溫處理后植物的丙二醛(MDA)含量及離子泄漏率。長期熱處理:將正常條件下生長兩周的轉(zhuǎn)基因幼苗轉(zhuǎn)入45℃高溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1個月(6 h 45℃光照/18 h 28℃黑暗),之后觀察表型。

1.2.2 轉(zhuǎn)基因植物構(gòu)建

OsPM1過表達株系及RNAi株系由本實驗室構(gòu)建[7]。

OsPM1::SbHsf03融合基因轉(zhuǎn)基因株系的構(gòu)建:從高粱葉片的總RNA中通過反轉(zhuǎn)錄PCR擴增SbHsf03cDNA全長,連入中間載體PCR-Blunt中,然后將SbHsf03、eGFP基因及OsPM1基因上游2 152 bp長的啟動子連接到pCAMBIA1302載體中,測序正確后送武漢伯遠公司進行水稻日本晴轉(zhuǎn)化。

1.2.3 水稻葉片RNA抽提及實時熒光定量PCR

利用TRIzol法提取水稻葉片總RNA,用PrimeScript RT-PCR Kit with gDNA eraser試劑盒(Ta KaRa,日本)將1μg RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,以cDNA為模板用SYBR Green Master Mix試劑盒(YEASEN,中國)進行RT-qPCR檢測,OsUBQ5作為內(nèi)參基因,引物見表1。

1.2.4 丙二醛(MDA)含量測定

取待測水稻葉片0.075 g(植物組織鮮重記為m鮮)放入2 mL離心管中,加入兩顆鋼珠,在液氮中打成粉末。向離心管中加入2 mL 10%TCA(三氯乙酸)(提取液體積記為V)與植物混勻后靜置10 min。靜置后用10 000×g的轉(zhuǎn)速離心15 min。取1 m L上清與1 m L 0.6%硫代巴比妥酸混合后于95℃加熱30 min并立刻于冰上降溫。將冷卻后的反應(yīng)液用10 000×g的轉(zhuǎn)速離心10 min。取上清用分光光度計測532 nm、600 nm、450 nm吸光度值并分別記為A532、A600、A450,計算MDA含量。MDA的質(zhì)量摩爾濃度bMDA(μmol/g)=(6.45(A532-A600)-0.56A450)×V/m鮮。每個株系進行3次生物學重復。

1.2.5 離子泄漏率檢測

取各株系葉片若干于5 m L離心管中,其中已提前加入4 m L蒸餾水,將葉片浸沒到水中,放置過夜。次日,將離心管上下顛倒幾次,檢測溶液的電導率,記為E0。然后將含有材料的離心管放入100℃的沸水浴中煮15 min。待溶液溫度降到室溫上下顛倒幾次重新檢測其電導率,記為E1。相對離子泄漏率=E0/E1×100%。每個株系3個重復。

1.2.6 雙螢光素酶報告系統(tǒng)檢測

載體構(gòu)建:將OsPM1的啟動子(718 bp)連接到雙螢光素酶報告系統(tǒng)載體p GreenⅡ0800-LUC中;將編碼水稻熱休克轉(zhuǎn)錄因子的基因(OsHsf)連接到pCHF3中。

水稻原生質(zhì)體制備:配制酶解液(1.5%Cellulase R-10、0.5%Macerozyme R-10、0.6 mol/L Mannitol、10 mmol/L MES)后先于55℃水浴10 min,溫度降到室溫后添加1 mmol/L CaCl2、5μmol/Lβ-巰基乙醇、0.1%BSA,然后調(diào)p H至5.7,再用0.45μm的濾膜過濾至錐形瓶中待用。取大小適宜的水稻苗葉鞘部分切成小于1 mm的小段放入酶解液中,真空抽氣20 min兩次,然后放入28℃的搖床中55 r/min避光酶解4 h。酶解結(jié)束后向錐形瓶中加入與酶解液等體積的4℃預冷的W5反應(yīng)液(154 mmol/L NaCl、125 mmol/L CaCl2、5 mmol/L KCl、2 mmol/L MES,定容后調(diào)p H至5.7,用0.45μm濾膜過濾,4℃保存)輕輕攪拌,攪拌后用專用濾網(wǎng)過濾,然后200×g低溫離心2～3 min。倒去上清后將離心管底部的原生質(zhì)體用W5反應(yīng)液重懸洗滌一次,再將原生質(zhì)體用W5反應(yīng)液稀釋后放在冰上靜置30 min。然后200×g離心3 min,棄上清,用MMG反應(yīng)液(4 mmol/L MES、0.4 mmol/L Mannitol、15 mmol/L MgCl2,定容后調(diào)p H至5.7,用0.45μm濾膜過濾,4℃保存)將原生質(zhì)體的濃度調(diào)至(1～2)×105個/m L。

原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化:將上述構(gòu)建的兩個質(zhì)粒加入100μL原生質(zhì)體中,加入120μL 40%PEG4000(40%PEG4000、0.2 mmol/L Mannitol、0.1 mmol/L CaCl2),混勻,放入28℃烘箱中黑暗靜置15 min。靜置后加入480μL W5反應(yīng)液混勻并用200×g的轉(zhuǎn)速離心3 min,吸走上清后用1 m L W5反應(yīng)液洗滌一次,洗滌后的原生質(zhì)體用100μL W5反應(yīng)液重懸并轉(zhuǎn)移到已經(jīng)加入900μL W5反應(yīng)液的細胞板中,28℃黑暗培養(yǎng)過夜(12～16 h)。

熒光強度檢測:次日,將細胞板中的原生質(zhì)體移至2 m L離心管中并用200×g的轉(zhuǎn)速離心3 min,吸走上清。然后用Dual-Luciferase?Reporter Assay System(Promega,美國)試劑盒檢測。加入LARII后檢測Luminescence發(fā)光值記為LUC,加入Stop&Glo Reagent后檢測Luminescence發(fā)光值記為REN,LUC/REN的比值代表OsPM1啟動子的相對轉(zhuǎn)錄活性。以不連接OsHsf的空載體質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化連接OsPM1啟動子(718 bp)的雙螢光素酶報告系統(tǒng)載體質(zhì)粒組為對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 OsPM1受各種非生物脅迫的誘導并能夠被熱休克轉(zhuǎn)錄因子激活

為了探究OsPM1在水稻各種非生物脅迫中是否發(fā)揮功能,我們首先觀察了各種脅迫處理后OsPM1在水稻葉片中的表達情況。發(fā)現(xiàn)除冷脅迫處理(0℃)外,干旱、滲透、高鹽、高溫這些非生物脅迫均可以誘導OsPM1在水稻葉片中的表達,最高可達1 000倍以上(圖1(a)),暗示OsPM1很可能也在除干旱外的其他非生物脅迫中發(fā)揮功能。利用45℃處理生長到三葉期的幼苗不同時間,發(fā)現(xiàn)熱處理后4 h,OsPM1的表達水平可以達到處理前的300倍以上,其他時間點也有一定倍數(shù)的誘導表達(圖1(b)),表明OsPM1與水稻熱脅迫有關(guān)。為了研究OsPM1在水稻熱脅迫中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制,將OsPM1的啟動子(718 bp)連接到雙螢光素酶報告系統(tǒng)載體p GreenⅡ0800-LUC中,將其與35S啟動子驅(qū)動編碼水稻熱休克轉(zhuǎn)錄因子基因(OsHsf)的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化水稻原生質(zhì)體(圖1(c)),然后用雙螢光素酶報告系統(tǒng)檢測OsPM1的相對轉(zhuǎn)錄活性。結(jié)果顯示,Os Hsf A2b、Os Hsf A2e、Os Hsf A3均可在一定程度上激活OsPM1的轉(zhuǎn)錄,其中Os Hsf A3對OsPM1的轉(zhuǎn)錄激活高達11倍(圖1(d))。說明OsPM1受熱脅迫誘導可能是通過熱休克轉(zhuǎn)錄因子的直接或間接激活實現(xiàn)的。

圖1 各種脅迫處理后OsPM1在水稻葉片中的表達變化及熱休克轉(zhuǎn)錄因子對OsPM1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控Fig.1 Expression of OsPM1 in rice leaves under various stress treatments and transcriptional regulation of Hsfs on OsPM1

2.2 過表達OsPM1能夠提高水稻耐受滲透脅迫和高鹽脅迫的能力

進一步對OsPM1的過表達株系OE-2、OE-13、OE-15和RNAi株系RNAi-1,RNAi-3和RNAi-12進行滲透脅迫(5%甘露醇)和高鹽脅迫(200 mmol/L NaCl)。結(jié)果如圖2所示,在正常培養(yǎng)基上各株系長勢一致;在含有5%甘露醇的滲透脅迫培養(yǎng)基上生長,過表達株系相比于野生型苗長更長,RNAi株系最短;在200 mmol/L NaCl培養(yǎng)基上RNAi株系生長也慢于野生型。該結(jié)果表明,OsPM1在水稻抵御滲透和高鹽脅迫過程中也發(fā)揮重要功能,過表達OsPM1能夠提高水稻耐受滲透脅迫和高鹽脅迫的能力。

圖2 滲透及高鹽脅迫處理下各轉(zhuǎn)基因水稻株系表型分析Fig.2 Phenotype analysis of transgenic rice lines under osmotic and high salt stress

2.3 過表達OsPM1能夠提高水稻耐高溫能力

將三葉期的野生型、OsPM1過表達(OE-2、OE-13)和RNAi(RNAi-1、RNAi-3)水稻苗高溫處理后觀察植株表型,發(fā)現(xiàn)過表達植株的葉片比野生型綠而RNAi植株的葉片則比野生型更黃(圖3(a),見第390頁),同時檢測了正常條件下及高溫處理條件下各株系植物的離子泄漏率,結(jié)果顯示:相較野生型,過表達株系的離子泄漏率較低,而RNAi株系的則較高(圖3(b),見第390頁)。上述結(jié)果說明OsPM1也參與了水稻抗高溫反應(yīng),過表達OsPM1可以增強水稻的耐熱性。因此,OsPM1基因在改善作物耐熱性上具有很好的應(yīng)用前景。

圖3 高溫脅迫處理下各轉(zhuǎn)基因水稻株系表型分析Fig.3 Phenotype analysis of rice transgenic lines under high temperature

2.4 OsPM1::Sb Hsf03融合基因轉(zhuǎn)基因株系的構(gòu)建

OsPM1啟動子是一個脅迫誘導型啟動子,在面臨干旱、高溫等逆境時,其活性常常提高幾百倍以上,而在正常生長條件下,該啟動子的活性則很低。高粱是禾本科植物中一類耐熱性較強的作物,其熱休克轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)節(jié)其耐熱性上起重要作用。因此,我們將OsPM1啟動子與高粱熱休克轉(zhuǎn)錄因子基因融合,轉(zhuǎn)化到對熱敏感的粳稻日本晴中并檢測轉(zhuǎn)基因株系的耐高溫能力。

我們從高粱葉片的總cDNA中擴增到SbHsf03基因(LOC8085952)的cDNA全長,然后通過基因融合技術(shù)將SbHsf03與OsPM1基因上游2 152 bp長度的啟動子融合,轉(zhuǎn)化水稻日本晴。圖4(a)、(b)分別為高粱熱休克轉(zhuǎn)錄因子Sb Hsf03的蛋白結(jié)構(gòu)域示意簡圖及OsPM1::SbHsf03融合基因轉(zhuǎn)基因載體示意圖。

圖4 Sb Hsf03蛋白結(jié)構(gòu)域示意簡圖及OsPM1::Sb Hsf03融合基因轉(zhuǎn)基因載體示意圖Fig.4 Schematic diagrams of Sb Hsf03 protein and the transgenic vector of OsPM1::Sb Hsf03

2.5 OsPM1::Sb Hsf03融合基因轉(zhuǎn)基因株系耐高溫能力鑒定

利用PCR的方法對2.4節(jié)描述的轉(zhuǎn)基因株系進行檢測,結(jié)果顯示3個株系均轉(zhuǎn)基因成功(圖5(a))。將生長兩周的野生型及OsPM1::SbHsf03融合基因的轉(zhuǎn)基因株系E452-1、E452-2、E452-3的水稻苗放入45℃的培養(yǎng)箱中處理46 h后觀察植株表型,發(fā)現(xiàn)OsPM1::SbHsf03融合基因的轉(zhuǎn)基因株系較野生型卷葉更少(圖5(b,c)),同時檢測了處理前及高溫處理后植物的丙二醛含量及離子泄漏率,結(jié)果表明:高溫處理后,OsPM1::SbHsf03融合基因轉(zhuǎn)基因株系的丙二醛含量及離子泄漏率都低于野生型,而處理前各株系的丙二醛含量和離子泄漏率均沒有顯著差異(圖5(d,e)),說明在水稻中表達OsPM1::SbHsf03融合基因可以增強其耐熱性,且對苗期正常情況下水稻的生長沒有影響。

圖5 OsPM1::Sb Hsf03融合基因轉(zhuǎn)基因株系耐高溫能力鑒定Fig.5 Characterization of the heat tolerance of OsPM1::Sb Hsf03 transgenic lines

2.6 OsPM1::Sb Hsf03融合基因轉(zhuǎn)基因植株在長時間高溫脅迫后具有更高的存活率

將野生型及OsPM1::SbHsf03融合基因的轉(zhuǎn)基因植株E452的幼苗放入45℃的培養(yǎng)箱中處理1個月后觀察植株表型,發(fā)現(xiàn)野生型植株幾乎全部死亡(存活率:3.1%),OsPM1::SbHsf03融合基因的轉(zhuǎn)基因植株全部存活(存活率:100%)(圖6),進一步說明在水稻中表達OsPM1::SbHsf03融合基因可以增強植物的耐熱性。

圖6 熱脅迫1個月后野生型及OsPM1::Sb Hsf03轉(zhuǎn)基因植株E452的表型Fig.6 Phenotype of wild type and OsPM1::Sb Hsf03 transgenic plant E452 after 1 month of heat stress treatment

3 討 論

環(huán)境逆境是造成作物產(chǎn)量下降的一個主要因素,因此培育抗逆性強的作物是穩(wěn)定作物產(chǎn)量的必經(jīng)之路。然而,培育對單一脅迫(如干旱、鹽堿、病原體等)耐受性增強的植物可能存在一定的風險,因為植物對不同的脅迫有獨特的反應(yīng),增加對一種脅迫的耐受性可能以犧牲對另一種脅迫的耐受性為代價[26-27]。例如,一個耐旱性強的好氧水稻品種能夠適應(yīng)缺水環(huán)境,但是這個品種對根結(jié)線蟲感染特別敏感,導致產(chǎn)量嚴重下降[28]。隨著氣候變化,越來越多的極端天氣事件增加了植物在田間遭受多種脅迫的可能性。因此,有必要尋找能夠同時響應(yīng)多種脅迫的基因,進而培育能夠同時抵御多種極端環(huán)境的作物品種。如水稻NAC家族轉(zhuǎn)錄因子Os NAC2的RNA干擾株系同時具有對干旱脅迫和高鹽脅迫的耐受性[29];而在番茄中過表達自身的SIAREB1基因則能同時增強番茄對鹽和干旱脅迫的耐受性[30]。OsPM1作為編碼一種ABA轉(zhuǎn)運蛋白的功能基因,過表達能夠增強水稻的干旱耐受能力[7]。本文對OsPM1在抵御非生物脅迫中的作用進行了進一步研究,發(fā)現(xiàn)該基因還受滲透、高鹽以及高溫脅迫的誘導,并且過表達OsPM1后,水稻抵御滲透脅迫、高鹽脅迫、高溫脅迫的能力都得到了增強。因此,該基因作為一個能夠在多種脅迫反應(yīng)中發(fā)揮功能的基因,具有可用于培育兼具多種抗逆性的水稻品種的潛力。然而,由于本研究均為在實驗室環(huán)境下模擬單一脅迫,至于在多種脅迫并存時尤其是在野外環(huán)境下OsPM1的轉(zhuǎn)基因株系表現(xiàn)如何,還有待進一步研究。

在本研究中我們還發(fā)現(xiàn),水稻熱脅迫轉(zhuǎn)錄因子Os Hsf A2b、Os Hsf A2e、Os Hsf A3都對OsPM1有一定的轉(zhuǎn)錄激活作用。因此我們推測,OsPM1在水稻熱脅迫響應(yīng)中的功能很可能是通過Os Hsfs的直接或間接激活實現(xiàn)的,而OsPM1在各種非生物脅迫中更加詳細的作用機制還需更深入的研究。

高溫會嚴重降低水稻的產(chǎn)量。亞洲栽培稻分為秈亞種和粳亞種,其中秈稻耐熱性強,而粳稻喜溫卻不耐熱,因其各自適宜的生長環(huán)境不同在我國形成了“南秈北粳”的水稻種植格局[31]。相較于秈稻而言,粳稻米粒黏性更強,適口性好,因此也更受大眾歡迎。南方的粳稻種植面積隨著近年來“秈改粳”的不斷推進展現(xiàn)出逐漸增加的態(tài)勢,但粳稻耐熱性差,導致其在高溫年份嚴重減產(chǎn)。我國長江以南地區(qū)夏季溫度經(jīng)常在37℃以上,提高粳稻耐熱性便尤為重要。因此我們以口感好但不耐熱的粳稻日本晴為背景進行轉(zhuǎn)基因,以獲得兼具優(yōu)質(zhì)口感和耐熱性的水稻品系。

目前已經(jīng)有一些基因在水稻中過表達能夠提高其耐熱性。例如,將OsWRKY11與水稻HSP101啟動子融合后轉(zhuǎn)入水稻品種Sasanishiki中,其耐熱性和耐旱性均得到增強[32];在亞洲水稻品種“長優(yōu)1號”中異源表達擬南芥的AtPLC9基因后,其耐熱性也顯著增強[33]。在本研究中,我們選用了耐熱性較強的禾本科植物高粱的熱脅迫轉(zhuǎn)錄因子Sb Hsf03,將其編碼基因在粳稻品種日本晴中異源表達,獲得的轉(zhuǎn)基因植物耐熱性顯著增強,45℃處理1個月后其存活率仍為100%。

在以往的研究中,有一些轉(zhuǎn)基因植物在轉(zhuǎn)入抗逆轉(zhuǎn)錄因子后,雖然抗逆性得到了顯著提高,但植物出現(xiàn)了生長缺陷。例如,向水稻中轉(zhuǎn)入玉米泛素啟動子(Ubi-1)驅(qū)動的WRKY家族轉(zhuǎn)錄因子WRKY45的編碼基因后,轉(zhuǎn)基因水稻對稻瘟病菌的抗性增強,但植株生長遲緩[34];CaMV35s啟動子或玉米泛素啟動子驅(qū)動的水稻OsDREB1或擬南芥DREB1轉(zhuǎn)入水稻后,轉(zhuǎn)基因株系對干旱、高鹽和低溫脅迫的耐受性均增強,但在無脅迫的正常生長條件下也表現(xiàn)出生長遲緩[35]。有研究表明,將組成型啟動子換為脅迫誘導型啟動子能夠在很大程度上減小過表達轉(zhuǎn)錄因子給轉(zhuǎn)基因植株正常生長帶來的不良影響。在擬南芥中過表達DREB1A激活了許多抗逆基因的表達,從而提高了植株對干旱、高鹽和凍害的耐受性,但在正常生長條件下,使用CaMV35s啟動子驅(qū)動DREB1A的轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出嚴重的生長遲緩,相比之下,DREB1A在脅迫誘導型rd29A啟動子驅(qū)動下對植物生長的影響很小,而且轉(zhuǎn)基因植物的逆境耐受性比CaMV35s啟動子驅(qū)動DREB1A的轉(zhuǎn)基因植物更強[36]。在本研究中,我們利用OsPM1的脅迫誘導型啟動子來驅(qū)動高粱熱休克轉(zhuǎn)錄因子Sb Hsf03的編碼基因,轉(zhuǎn)化不耐熱的粳稻日本晴,獲得了既具有很強耐高溫能力又不影響植株正常生長的粳稻品系。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中,熱脅迫對水稻的影響主要在生殖生長期,生殖生長期高溫會嚴重影響水稻的育性。本文主要鑒定了轉(zhuǎn)基因品系在營養(yǎng)期的耐高溫能力,為后續(xù)的耐熱性鑒定奠定了基礎(chǔ),今后也將進一步觀察該品系在生殖期高溫天氣下的結(jié)實率及耐熱性變化。