楊理章，倪德讓，楊玉波*，楊 帆，王 莉

（1.貴州茅臺酒股份有限公司，貴州 遵義 564501；2.中國貴州茅臺酒廠（集團）有限責(zé)任公司，貴州 遵義 564501）

大曲是以小麥、大麥等谷物為原料，采用生料制曲、自然接種，在培養(yǎng)室內(nèi)固態(tài)發(fā)酵而成，是白酒釀造所需的糖化發(fā)酵劑和生香劑[1-3]。高溫大曲以小麥為主要原料，制曲過程中品溫可達65 ℃左右，主要用于生產(chǎn)醬香型白酒[4-5]。高溫大曲中豐富的風(fēng)味物質(zhì)賦予其濃郁的曲香，而曲香是高溫大曲質(zhì)量的重要指標[6-7]。因此，研究高溫大曲風(fēng)味物質(zhì)含量和組成有助于大曲分類與質(zhì)量評價。

大曲是固體狀態(tài)，需要對大曲樣品進行前處理，一種方法是可從樣品的頂空氣體提取，如頂空固相微萃?。╤eadspace solid-phase microextraction，HS-SPME）[8-9]，另一種方法是將固體樣品轉(zhuǎn)換為液體樣品，再對液體樣品進行提取，包括液液萃?。╨iquid-liquid extraction，LLE）、溶劑輔助風(fēng)味蒸發(fā)法（solvent-assisted flavor evaporation，SAFE）、同時蒸餾萃取（simultaneous distillation extraction，SDE）、索氏提?。╯oxhlet extraction，SE）、攪拌棒吸附萃?。╯tir bar sorptive extraction，SBSE）等[10]。大曲樣品經(jīng)過前處理后采用氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）[11]、全二維氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜（comprehensive two-dimensional gas chromatography-time-of-flight mass spectrometry，GC-TOF/MS）[12]、液相色譜-質(zhì)譜（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）等手段進行分離檢測。由于固相微萃取技術(shù)是集采樣、萃取、濃縮和進樣于一體的無溶劑樣品微萃取技術(shù)[13]，目前在大曲風(fēng)味物質(zhì)分析應(yīng)用較多[14-15]。但是固相微萃取方法多采用峰面積歸一化法和內(nèi)標法進行半定量分析[16-18]，未能實現(xiàn)大曲風(fēng)味物質(zhì)的準確定量。有學(xué)者采用內(nèi)標法建立標準曲線定量分析大曲風(fēng)味物質(zhì)，然而酸類物質(zhì)需要采用溴化芐衍生化方法進行定量[19]。此外，液液萃取（LLME）大曲風(fēng)味分析中另一種前處理方法，具有操作簡單、回收率高等優(yōu)勢，但缺點是樣品和試劑使用量大[20]，并且大曲中富含油脂、色素、蛋白質(zhì)以及糖類[21]，這些不揮發(fā)性物質(zhì)嚴重影響氣相色譜對揮發(fā)性風(fēng)味化合物的檢測。趙金松等[22]采用液液萃取法分析大曲風(fēng)味物質(zhì)時的有機溶劑乙醚用量為300 mL，之后需要加入無水硫酸鈉除水和氮吹濃縮，該方法存在有機溶劑用量大、需要除水濃縮等問題。

本研究以高溫大曲作為研究對象，采用液液微萃?。╨iquid-liquid microextraction，LLME）法提取高溫大曲中風(fēng)味物質(zhì)，通過優(yōu)化樣品用量、提取溶劑、提取方式、萃取劑種類及用量、漩渦振蕩萃取時間前處理條件，建立液液微萃取（LLME）結(jié)合氣相色譜質(zhì)譜（GC-MS）聯(lián)用技術(shù)定量分析高溫大曲風(fēng)味物質(zhì)的方法，并對該方法進行方法學(xué)評價，以期為高溫大曲風(fēng)味物質(zhì)分析提供新的技術(shù)手段，對于研究高溫大曲中風(fēng)味物質(zhì)含量和組成，以及對大曲中風(fēng)味物質(zhì)的評價具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

高溫大曲（編號1、2、3、4、5）：來源貴州茅臺酒股份有限公司制曲車間，其中試驗優(yōu)化選取高溫大曲2號樣品。

1.1.2 試劑

乙醚、戊烷、氯化鈉（均為分析純）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；己烷（色譜純）：美國Tedia公司；乙酸乙酯（色譜純）：德國Merck公司；乙醇（99.9%）：美國ACS公司；乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、苯甲酸、苯乙酸、β-苯乙醇、苯甲醇、苯甲醛、2,3-二甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪、2,3-二甲基-5-乙基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2,3,5,6-四甲基吡嗪、2-吡咯甲醛、2-乙?；量?、2,3-丁二醇、丙三醇、香茅醇、4-乙烯愈創(chuàng)木酚、3-羥基-2-丁酮、二甲基三硫（純度均≥98%）：美國Sigma公司；戊酸、己酸（純度均≥98%）：美國Chem service公司；香草醛（99%）：北京百靈威科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7890A-5975C氣質(zhì)聯(lián)用儀：美國安捷倫公司；PL3002電子天平：瑞士Mettler Toledo公司；KS260basic搖床：德國IKA公司；8510超聲波清洗機：美國Branson公司；SI-T256可調(diào)速計時漩渦混合器：美國Scientific Industries公司；Sigma 2-16離心機：德國Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 液液微萃取前處理

稱取10 g經(jīng)粉碎后的大曲樣品于50 mL離心管中，加入30 mL體積分數(shù)40%乙醇，以轉(zhuǎn)速為450 r/min的搖床振搖15 min；4 000 r/min離心6 min，吸取10 mL上層清液于20 mL樣品瓶中，加入3.6 g氯化鈉，然后加入1 mL乙醚/戊烷為萃取劑，漩渦振蕩2 min萃??；最后2 000 r/min離心2 min，吸取上層乙醚相用于GC-MS分析。

1.3.2 液液微萃取條件優(yōu)化

在方法1.3.1的基礎(chǔ)上對高溫大曲進行前處理，在其他條件恒定的條件下分別考察大曲用量（2.5 g、5 g、10 g、15 g、20 g）、乙醇體積分數(shù)（10%、20%、30%、40%、50%）、提取方式（A：450 r/min振搖15 min；B：超聲5 min；C：先450 r/min振搖10 min，再超聲5 min；D：先450 r/min振搖15 min，再超聲5min；E：先450r/min振搖20min，再超聲5 min；F：先450 r/min振搖15 min，再超聲10 min）、萃取劑種類（戊烷、己烷、乙醚、乙醚：戊烷（1∶1，V/V）、乙酸乙酯）、萃取劑用量（1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL）、漩渦振蕩萃取時間（5 s、10 s、20 s、40 s、60 s、120 s）對萃取效果的影響。根據(jù)總峰數(shù)和總峰面積，對大曲液液微萃取前處理條件進行優(yōu)化。

1.3.3 GC-MS分析條件

GC條件：DB-FFAP色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；進樣口溫度230 ℃，載氣為高純氦氣（He），流速1 mL/min，不分流進樣，進樣量1 μL；升溫程序為初始溫度60 ℃，保持1 min，然后以20 ℃/min升至100 ℃，再以6 ℃/min升至110 ℃，再3 ℃/min升至140 ℃，最后以5 ℃/min升至220 ℃，保持28 min。

質(zhì)譜條件：電子電離（electronic ionization，EI）源，電子能量為70 eV，離子源溫度230 ℃，四級桿溫度150 ℃，采用全掃描分析風(fēng)味物質(zhì)總峰數(shù)和總峰面積，采用選擇離子掃描（single ion monitoring，SIM）對風(fēng)味物質(zhì)進行精確定量。

定性定量分析：通過美國國家標準技術(shù)研究所（national institute of standards and technology，NIST）譜庫檢索、標準品比對定性25種大曲風(fēng)味物質(zhì)[23]。采用內(nèi)標法進行定量分析，往樣品瓶內(nèi)加入3 μL 11 727 mg/L香茅醇內(nèi)標到10 mL風(fēng)味物質(zhì)的標準溶液中，以風(fēng)味物質(zhì)與內(nèi)標質(zhì)量濃度的比值為橫坐標（x）、以風(fēng)味物質(zhì)與內(nèi)標峰面積的比值為縱坐標（y）繪制風(fēng)味物質(zhì)標準曲線，得到大曲風(fēng)味物質(zhì)標準曲線回歸方程。通過安捷倫化學(xué)工作站（Agilent Chemstation）軟件計算待測樣品中風(fēng)味物質(zhì)含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 液液微萃取條件優(yōu)化

2.1.1 樣品用量的選擇

考察樣品用量對風(fēng)味物質(zhì)總峰面積和總峰數(shù)的影響，結(jié)果見圖1。由圖1可知，大曲用量為2.5～20 g時，總峰面積逐漸增加。大曲用量為2.5～15 g時，總峰數(shù)隨大曲用量增大而增大；大曲用量為15 g時，總峰數(shù)均達到最大值254個，總峰面積為7.7×108；大曲用量＞15 g時，總峰數(shù)下降，說明大曲中風(fēng)味物質(zhì)萃取不完全。綜合考慮，選擇樣品用量為15g。

圖1 大曲樣品用量對萃取效果的影響Fig. 1 Effect of Daqu sample dosage on extraction efficiency

2.1.2 提取溶劑的選擇

高溫大曲中含有大分子親水蛋白質(zhì)等表面活性物質(zhì)，在液液微萃取過程中容易產(chǎn)生乳化現(xiàn)象[28]，不利于萃取的進行。實驗中發(fā)現(xiàn)當(dāng)提取溶劑的酒精度較高時，可有效減少乳化現(xiàn)象的產(chǎn)生，但酒精度過高時不利于大曲中風(fēng)味物質(zhì)的富集?？疾炝瞬煌掖俭w積分數(shù)對總峰數(shù)和總峰面積的影響，結(jié)果見圖2。由圖2可知，隨著乙醇體積分數(shù)在10%～40%范圍內(nèi)的增加，總峰數(shù)和總峰面積呈上升趨勢；當(dāng)乙醇體積分數(shù)為40%時，總峰數(shù)和總峰面積均達到最大值，分別為292個、16.1×108。當(dāng)乙醇體積分數(shù)＞40%，總峰數(shù)和總峰面積均下降。故確定最優(yōu)提取溶劑為乙醇體積分數(shù)40%。

圖2 乙醇體積分數(shù)對萃取效果的影響Fig. 2 Effect of ethanol volume fraction on extraction efficiency

2.1.3 提取方式的選擇

振蕩提取和超聲提取是兩種常見的風(fēng)味物質(zhì)提取方法，其中振蕩提取主要通過加大溶劑流動性，將樣品充分混勻提取其中風(fēng)味物質(zhì)；超聲提取則是通過物理破碎對樣品進行深度提取[24]。固定搖床轉(zhuǎn)速為450 r/min，超聲功率為120 W，考察不同提取方式對風(fēng)味物質(zhì)總峰數(shù)和總峰面積的影響，結(jié)果見圖3。由圖3可知，提取方式D（即先450 r/min振搖15 min，再超聲5 min）的總峰數(shù)、總峰面積均達到最大值，分別為278個、10.2×108?？紤]操作簡便性，選擇最優(yōu)提取方式為D，即先450 r/min振搖15 min，再超聲5 min。

圖3 提取方式對萃取效果的影響Fig. 3 Effect of extraction method on extraction efficiency

2.1.4 萃取劑種類的選擇

戊烷、己烷、乙醚、乙酸乙酯是常見的萃取劑[25-26]，具有沸點低、易除去等優(yōu)點，由于極性、水溶性等的差異，不同萃取劑對風(fēng)味物質(zhì)具有不同的選擇性和萃取效果。分別選用1 mL戊烷、己烷、乙醚、乙醚∶戊烷（1∶1，V/V）、乙酸乙酯為萃取劑，考察不同萃取劑對總峰數(shù)和總峰面積的影響，結(jié)果見圖4。由圖4可知，萃取劑為乙醚時，總峰數(shù)和總峰面積均達到最大值，分別為288個、11.0×108。故選用乙醚作為萃取劑。

圖4 萃取劑對萃取效果的影響Fig. 4 Effect of extraction solvent on extraction efficiency

2.1.5 萃取劑乙醚用量的選擇

萃取劑用量的增加有利于更多風(fēng)味物質(zhì)的萃取，但用量過大會導(dǎo)致稀釋效應(yīng)大于提取效率[27]，影響低濃度物質(zhì)的分析?？疾燧腿┮颐延昧繉偡鍞?shù)和總峰面積的影響，結(jié)果見圖5。由圖5可知，當(dāng)萃取劑乙醚用量為2 mL時，總峰數(shù)和總峰面積均達到最大值，分別為290個、16.0×108。故確定萃取劑乙醚用量為2 mL。

圖5 乙醚用量對萃取效果的影響Fig. 5 Effect of ether dosage on extraction efficiency

2.1.6 漩渦振蕩萃取時間的選擇

考察漩渦振蕩萃取時間對萃取效果的影響，結(jié)果見圖6。由圖6可知，隨著漩渦振蕩時間在5～40 s范圍內(nèi)增加，總峰數(shù)和總峰面積呈上升趨勢；當(dāng)漩渦振蕩時間為40 s時，總峰數(shù)和總峰面積分別為292個、16.2×108，之后總峰數(shù)和總峰面積均無明顯變化。故確定漩渦振蕩時間為40 s。

圖6 漩渦振蕩時間對萃取效果的影響Fig. 6 Effect of vortex oscillating time on extraction efficiency

綜上，液液萃取的前處理條件如下：大曲樣品用量為15 g，提取溶劑為體積分數(shù)40%乙醇，提取方式為先450 r/min振搖15 min，再超聲5 min，萃取劑為乙醚，用量為2 mL，漩渦振蕩時間為40 s。

2.2 方法學(xué)評價

液液微萃取結(jié)合氣相色譜質(zhì)譜分析高溫大曲中風(fēng)味物質(zhì)的方法學(xué)評價結(jié)果見表1。

表1 液液微萃取結(jié)合氣相色譜質(zhì)譜分析高溫大曲中風(fēng)味物質(zhì)的方法學(xué)評價Table 1 Methodological evaluation of liquid-liquid microextraction combined with GC-MS for analyzing flavor compounds in high-temperature Daqu

由表1可知，所定量的大曲樣品中的25種風(fēng)味物質(zhì)在各自質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2均≥0.99。通過計算5次平行樣的相對標準偏差（relative standard de viation，RSD）考察方法的精密度，按信噪比（signal to noise ratio，S/N）≥3確定其檢出限，按信噪比S/N≥10確定其定量限。該方法測定25種大曲風(fēng)味物質(zhì)的RSD均≤7.26%，方法的加標回收率為80.25%～119.26%，方法的檢出限為0.13～50.17 μg/kg，方法的定量限為0.44～167.22 μg/kg，說明方法的重現(xiàn)性好，準確度及精密度高，可滿足準確定量分析要求。

2.3 高溫大曲風(fēng)味物質(zhì)的測定

采用優(yōu)化確定的前處理條件，對高溫大曲樣品中風(fēng)味物質(zhì)進行分析，其風(fēng)味物質(zhì)GC-MS總離子流色譜圖見圖7，高溫大曲風(fēng)味物質(zhì)含量測定結(jié)果見表2。由圖7和表2可知，大曲樣品中的25種風(fēng)味物質(zhì)均可檢出，但所分析的高溫大曲中各風(fēng)味物質(zhì)含量差異較大，醇類和酸類化合物含量較高，其中含量最高的前3個風(fēng)味物質(zhì)分別為丙三醇、2,3-丁二醇、乙酸。

圖7 高溫大曲樣品風(fēng)味物質(zhì)GC-MS總離子流色譜圖Fig. 7 Total ion chromatography of the flavor compounds in hightemperature Daqu samples analyzed by GC-MS

表2 高溫大曲樣品風(fēng)味物質(zhì)GC-MS分析測定結(jié)果Table 2 Determination results of flavor compounds in high-temperature Daqu samples analysis by GC-MS mg/kg

3 結(jié)論

本試驗建立液液微萃取結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用儀分析高溫大曲中風(fēng)味物質(zhì)，優(yōu)化樣品前處理條件，并采用內(nèi)標法定量分析了25種風(fēng)味物質(zhì)，包括7種酸類化合物、6種芳香族化合物、5種吡嗪類化合物、2種雜環(huán)類化合物、2種醇類化合物、1種酚類化合物、1種酮類化合物和1種含硫化合物。所建方法的大曲風(fēng)味物質(zhì)在各自線性范圍內(nèi)標準曲線線性良好，相關(guān)系數(shù)R2均≥0.99，精密度試驗相對標準偏差（RSD）≤7.26%，方法的加標回收率為80.25%～119.26%，檢出限為0.13～50.17 μg/kg，定量限為0.44～167.22 μg/kg，可滿足準確定量分析要求。該方法具有簡便、快速、成本低等優(yōu)點，可用于高溫大曲的風(fēng)味物質(zhì)分析，并為其他大曲以及其他固體樣品的風(fēng)味物質(zhì)解析提供了一種新思路。