吳小燕 ，周仙莉 ，張紅巖 ，彭小星 ，范惠玲 ，滕長才 ，劉玉皎 ，3*

（1.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，西寧 810016；2.青海省農(nóng)林科學(xué)院，西寧 810016；3.青海大學(xué)省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧 810016）

蠶豆(Vicia fabaL.)，又稱羅漢豆、佛豆和胡豆等，屬豆科巢菜屬，一年生或越年生草本植物，是人類最早栽培種植的豆科類作物之一。蠶豆富含豐富的蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)和維生素等，在食品、飼料以及綠肥等方面廣泛應(yīng)用[1]。蠶豆還具有較高的藥用價(jià)值，它的莖、葉、花和莢殼等都可入藥，其根部的固氮能力可改善土壤結(jié)構(gòu)與土壤營養(yǎng)狀況[2]。目前，國內(nèi)外蠶豆育種主要集中在產(chǎn)量、品質(zhì)與抗性育種等方面[3]。機(jī)械化生產(chǎn)是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展的總體趨勢(shì)，也是制約蠶豆生產(chǎn)的因素之一。近年來，由于蠶豆難以適應(yīng)機(jī)械化，生產(chǎn)效率低，生產(chǎn)成本不斷增加，導(dǎo)致其種植面積減少[4]。始莢節(jié)位與始莢高度是蠶豆重要的農(nóng)藝性狀，是實(shí)現(xiàn)蠶豆規(guī)?；瘷C(jī)械生產(chǎn)的關(guān)鍵性狀，因此，選育始莢節(jié)位與高度適宜且結(jié)莢比較集中、適合機(jī)械收獲的蠶豆品種，是解決近年來制約蠶豆產(chǎn)業(yè)發(fā)展的機(jī)械化收獲問題的有效方式。蠶豆基因組巨大，約為13 Gb，其基因組學(xué)與遺傳學(xué)研究進(jìn)展相比于其他豆類較為緩慢[5]，基因組學(xué)研究僅局限于分子標(biāo)記及QTLs層面。目前，關(guān)于始莢高度性狀基因定位的研究主要是在大豆上[6-10]，還未見關(guān)于蠶豆的相關(guān)報(bào)道。本研究以青蠶19號(hào)/青海13號(hào)構(gòu)建的F2群體為材料，對(duì)蠶豆的始莢節(jié)位、始莢高度性狀的遺傳進(jìn)行分析，明確其遺傳規(guī)律，定位與蠶豆始莢節(jié)位、始莢高度性狀相關(guān)的QTLs，為應(yīng)用分子標(biāo)記輔助選擇育種技術(shù)定向選育適宜始莢高度與始莢節(jié)位的優(yōu)良品種選育提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

青蠶19號(hào)，始莢節(jié)位、始莢高度高，晚熟；青海13號(hào)，始莢節(jié)位、始莢高度低，早熟；以上材料均由青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院作物栽培研究所蠶豆課題組提供，種植于青海省農(nóng)林科學(xué)院試驗(yàn)地(36°43′N，101°45′E)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 群體構(gòu)建及性狀調(diào)查

以始莢節(jié)位、始莢高度較高的青蠶19號(hào)為母本，以始莢節(jié)位、始莢高度低的青海13號(hào)為父本，于2019年6—7月組配雜交組合，于8月份收獲雜交種；2020年4月種植F1群體，于8月份收獲F1單株；2021年4月種植F2群體。田間管理按常規(guī)方法進(jìn)行。待成熟時(shí)，分別測(cè)定F2群體中各單株的始莢節(jié)位、始莢高度等性狀，利用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)F2群體的表型數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用植物數(shù)量性狀“主基因+多基因”混合遺傳模型[11]對(duì)親本和F2群體單株始莢節(jié)位與始莢高度進(jìn)行遺傳分析。

1.2.2 引物篩選

DNA提?。涸谟酌缙谌∮H本及F2群體的幼嫩葉片，采用改良CTAB法[12]提取DNA。利用IMPLEN GMBH的超微量核酸蛋白測(cè)定儀與1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)提取的蠶豆基因組DNA進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)。

PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物的檢測(cè)：配置PCR反應(yīng)體系，依次加入4 μL 2× San Taq PCR mix預(yù)混液體系、上下游SSR引物各0.5 μL、1.5 μL DNA模板及3.5 μL ddH2O，共10 μL。PCR儀擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，50℃～60℃退火45 s，72℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物使用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，緩沖液為1×TBE，220 V恒壓電泳1.2 h左右，電泳結(jié)束后進(jìn)行銀染和顯影，然后統(tǒng)計(jì)在親本材料間表現(xiàn)多態(tài)性的SSR引物。

1.2.3 基因分型

利用篩選出來的具有多態(tài)性的SSR引物，對(duì)F2群體進(jìn)行基因分型，與青蠶19號(hào)帶型一致的帶型記為1，與青海13號(hào)帶型一致記為2，雜合帶型記為0，缺失帶型記為3。

1.2.4 圖譜構(gòu)建

采用QTL Icimapping v.4.2軟件的構(gòu)建遺傳連鎖圖譜，對(duì)SSR標(biāo)記進(jìn)行分組排列，計(jì)算標(biāo)記間的連鎖距離。

1.2.5 基因初步定位

根據(jù)F2單株始莢節(jié)位與始莢高度性狀表型數(shù)據(jù)，應(yīng)用QTL Icimapping v.4.2軟件的復(fù)合區(qū)間作圖法對(duì)表型數(shù)據(jù)和分子標(biāo)記數(shù)據(jù)進(jìn)行連鎖分析，掃描步長為1.00 cM，逐步回歸分析中標(biāo)記進(jìn)入的最大P值（PIN）為0.001，LOD閾值為2.2，初步定位始莢節(jié)位與始莢高度性狀相關(guān)QTLs。

2 結(jié)果與分析

2.1 遺傳規(guī)律分析

F2群體中始莢節(jié)位與始莢高度兩個(gè)性狀呈現(xiàn)連續(xù)性分布（圖2），符合數(shù)量性狀的特征。F2群體始莢節(jié)位與始莢高度性狀的分離情況（表1）表明，始莢節(jié)位性狀的偏度值與峰度值的絕對(duì)值都小于3，說明該性狀由主效基因控制，始莢高度性狀的偏度值的絕對(duì)值小于3，但峰度值的絕對(duì)值大于3，說明該性狀受主基因控制的同時(shí)可能還受多個(gè)微效基因控制。始莢節(jié)位與始莢高度的變異系數(shù)都大于15%，說明這兩個(gè)性狀的變異豐富，始莢節(jié)位的變異系數(shù)33.4%，小于始莢高度的變異系數(shù)49.2%，表明后者比前者在形態(tài)變異上更豐富，更突出。這兩個(gè)性狀的變異系數(shù)都小于1，說明存在超親分離現(xiàn)象。通過相關(guān)性分析，結(jié)果表明始莢節(jié)位與始莢高度性狀之間呈現(xiàn)極顯著的正相關(guān)關(guān)系，且相關(guān)系數(shù)高達(dá)0.594（表2）。

圖2 始莢節(jié)位與始莢高度頻率分布直方圖Figure 2 Frequency distribution histogram of initial pod node position and initial pod height

表1 F2群體分離情況Table 1 Segregation of F2population

表2 始莢節(jié)位與始莢高度性狀的相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis between the position of the first pod node and the height of the first pod

2.2 始莢節(jié)位與高度性狀的遺傳模型和遺傳效應(yīng)分析

采用植物數(shù)量性狀“主基因+多基因”混合遺傳模型對(duì)親本和F2群體單株始莢節(jié)位與始莢高度進(jìn)行分析，根據(jù)AIC值最小法則選擇AIC值最小的一組作為備選模型（表3），對(duì)備選模型進(jìn)行一組適合性檢驗(yàn)（表4），選擇AIC值最小且統(tǒng)計(jì)量達(dá)到顯著水平個(gè)數(shù)較少的模型作為最優(yōu)模型，備選模型的統(tǒng)計(jì)量達(dá)到顯著水平的個(gè)數(shù)均為0，根據(jù)AIC準(zhǔn)則進(jìn)行篩選，即蠶豆始莢高度性狀符合2對(duì)加性-顯性主基因模型（2MG-AD）遺傳模型，蠶豆始莢節(jié)位性狀符合2對(duì)加性-顯性-上位性主基因模型（2MG-ADI）遺傳模型。根據(jù)選擇的最優(yōu)遺傳模型估計(jì)最優(yōu)遺傳模型的一階、二階遺傳參數(shù)，并求得了相關(guān)二階遺傳參數(shù)（表5、6），結(jié)果表明始莢節(jié)位性狀由2對(duì)主基因控制，主基因的遺傳率為44.6%，該性狀受環(huán)境因素的影響較大；2對(duì)主基因的加性效應(yīng)值da(d)、db分別為1.134 9、1.060 5，具有正向遺傳效應(yīng)，顯性效應(yīng)值 ha(h)、hb 分別為-1.649 9、-0.921 5，均表現(xiàn)為負(fù)向遺傳效應(yīng)。加性×加性互作效應(yīng)值i為1.051 4，表現(xiàn)為正向效應(yīng)，加性×顯性互作jab和顯性×加性互作jba的效應(yīng)值分別為-0.920 3和-0.464 1，表現(xiàn)為較低的負(fù)向遺傳效應(yīng)；顯性與顯性互作效應(yīng)值l為1.481 6，表現(xiàn)為正向效應(yīng)。始莢高度性狀由2對(duì)主基因控制，主基因的遺傳率較高，達(dá)到了83%。2對(duì)主基因的加性效應(yīng)值da(d)、db分別為11.231、8.705 9，具有較高的正向遺傳效應(yīng)，其顯性效應(yīng)值ha(h)、hb分別為-15.806 6、-4.962 3，均表現(xiàn)為負(fù)向遺傳效應(yīng)，尤其前者的負(fù)向遺傳效應(yīng)更為突出。

表3 F2群體始莢節(jié)位與始莢高度性狀的遺傳模型Table 3 Genetic model of the characters of initial pod node position and initial pod height in F2population

表4 F2群體始莢節(jié)位與高度性狀的適合性檢驗(yàn)Table 4 Fitness test of initial pod position and height traits in F2population

表5 F2群體始莢節(jié)位性狀遺傳參數(shù)估計(jì)值Table 5 Estimation of genetic parameters of the first pod node traits in F2population

表6 F2群體始莢高度性狀遺傳參數(shù)估計(jì)值Table 6 Estimation of genetic parameters for the traits of initial pod height in F2population

2.3 遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建

2.3.1 多態(tài)性引物篩選

利用1 596對(duì)蠶豆SSR引物在親本青蠶19號(hào)和青海13號(hào)之間進(jìn)行多態(tài)性引物的篩選，共篩選出202個(gè)在親本間具有多態(tài)性的標(biāo)記，多態(tài)性比率為12.7%。

2.3.2 基因分型與偏分離分析

利用202對(duì)多態(tài)性引物對(duì)（青蠶19號(hào)×青海13號(hào)）F2群體進(jìn)行基因分型，其中132個(gè)標(biāo)記的帶型清晰且易識(shí)別，用于構(gòu)建遺傳圖譜。利用QTL Ici?mapping v.4.2軟件對(duì)每個(gè)SSR標(biāo)記位點(diǎn)在作圖群體中的分布情況進(jìn)行測(cè)驗(yàn)，在P<0.05的顯著水平上，判斷某標(biāo)記位點(diǎn)是否存在偏分離現(xiàn)象。結(jié)果表明132個(gè)標(biāo)記中，53個(gè)標(biāo)記表現(xiàn)出明顯的偏分離現(xiàn)象，占標(biāo)記數(shù)量的40.15%，后期構(gòu)建遺傳圖譜時(shí)將這些偏分離標(biāo)記剔除。

2.3.3 遺傳圖譜的構(gòu)建

利用QTL Icimapping v.4.2軟件對(duì)79個(gè)多態(tài)性標(biāo)記的基因分型數(shù)據(jù)進(jìn)行連鎖分析，構(gòu)建遺傳連鎖圖譜。當(dāng)LOD值為2.2時(shí)，圖譜共包含6個(gè)連鎖群，圖譜總長度為1 804.59 cM，標(biāo)記間平均距離為22.84 cM，各連鎖群長度介于26.34～1 389.89 cM之間，SSR標(biāo)記在各個(gè)連鎖群上分布不均勻，連鎖群的標(biāo)記數(shù)量介于2～54個(gè)，其中LG1覆蓋長度最長，標(biāo)記數(shù)量最多為54個(gè)，LG6覆蓋長度最短，含標(biāo)記數(shù)量最少為2個(gè)，LG4標(biāo)記間平均距離最小為7.47 cM，LG5標(biāo)記間平均距離最大為28.12 cM。

2.3.4 始莢節(jié)位與始莢高度性狀基因的初步定位

利用QTL Icimapping v.4.2軟件對(duì)分子標(biāo)記與始莢節(jié)位和始莢高度表型數(shù)據(jù)進(jìn)行完備區(qū)間作圖法(inclusive composite interval mapping，ICIM)作圖，以LOD≥2.5為判定QTL是否顯著的標(biāo)準(zhǔn)，定位到了5個(gè)與始莢節(jié)位相關(guān)的QTLs（圖3），分別為qPs-2-1、qPs-2-2、qPs-2-3、qPs-2-4和 qPs-2-5，分別位于LG2上的482.00 cM、1018.00 cM、1183.00 cM、1 243.00 cM和1 354.00 cM處，LOD值分別為6.512 6、3.070 4、6.618 4、2.907 6和 2.618 0，加性效應(yīng)分別為 0.512 6、1.173 7、1.270 4、0.408 9和-0.451 8，分別解釋了1.2213%、5.8434%、5.1660%、0.614 6%和0.663 0%的表型變異。定位到8個(gè)與始莢高度相關(guān)QTL（圖2），分別命名為qPh-2-1、qPh-2-2、qPh-2-3、qPh-2-4 qPh-2-5、qPh-2-6、qPh-3-1和qPh-3-2，他們分別位于LG2上的262.00 cM、484.00 cM、505.00 cM、697.00 cM、1 181.00 cM以及1 238.00 cM處和LG3上的48.00 cM以及187.00 cM處，LOD值分別為9.607 5、4.263 1、4.331 1、2.831 3、10.772 5、6.235 8、5.246 9和3.046 4，加性效應(yīng)分別為9.506 7、2.386 1、3.817 5、2.347 5、9.144 9、4.030 3、9.183 1和 7.944 1，分別解釋了4.759 4%、0.548 2%、1.125 9%、0.386 8%、4.613 5%、0.781 5%、4.425 2%和3.225 9%的表型變異。

圖3 遺傳連鎖圖譜Figure 3 Genetic linkage map

3 討論

蠶豆作為我國種植面積最廣的食用豆品種，它可以調(diào)整種植結(jié)構(gòu)，增加農(nóng)民的收入，但是在生產(chǎn)過程中所需勞動(dòng)強(qiáng)度大，生產(chǎn)成本高，效率低，影響了自身優(yōu)勢(shì)作用的發(fā)揮[13]。始莢高度是蠶豆實(shí)現(xiàn)機(jī)械化生產(chǎn)的重要性狀，明確該性狀的遺傳規(guī)律，定位相關(guān)的QTLs，為適宜始莢高度與始莢節(jié)位的優(yōu)良品種選育及分子輔助選擇育種提供依據(jù)。研究結(jié)果表明始莢節(jié)位與始莢高度都是數(shù)量性狀，并且這兩個(gè)性狀都由2對(duì)主基因所控制，始莢節(jié)位主基因的遺傳力為44.6%，該性狀表型的變異容易受環(huán)境因子的影響；始莢高度主基因的遺傳力為83%，說明該表型變異是由遺傳因子決定的，這與大豆始莢高度遺傳研究所得到的結(jié)論相一致[7,14-15]。當(dāng)遺傳力較大時(shí)，在早代進(jìn)行選擇比較適宜，遺傳力較低時(shí)在晚代進(jìn)行選擇[16]，因此若要在后代群體中進(jìn)行選擇，需在早代選擇。根據(jù)相關(guān)性分析可知，始莢節(jié)位與始莢高度之間呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)達(dá)0.594，這說明兩個(gè)性狀之間存在緊密聯(lián)系。

構(gòu)建高密度的遺傳圖譜是蠶豆基因組研究的基礎(chǔ)和主要手段，在基因定位、克隆和關(guān)聯(lián)分析等方面發(fā)揮了重要的作用[17]；在構(gòu)建遺傳圖譜時(shí)，得到的連鎖群數(shù)目應(yīng)與所研究對(duì)象染色體對(duì)數(shù)目是一一對(duì)應(yīng)的[18]；如已有研究證實(shí)水稻的12對(duì)染色體與其連鎖群之間是完全對(duì)應(yīng)的[19]；大豆有20對(duì)染色體，構(gòu)建的連鎖圖譜中含20個(gè)連鎖群[20]；玉米含有10對(duì)染色體，其連鎖群個(gè)數(shù)也為10[21]；還有馬鈴薯[22]、番茄[23]、綠豆[24]、菜豆[25]以及冬瓜[26]等它們的遺傳連鎖群個(gè)數(shù)均與單倍染色體個(gè)數(shù)相等。本試驗(yàn)所構(gòu)建的遺傳圖譜包含6個(gè)連鎖群，與蠶豆的單倍染色體數(shù)目相等。與前人在研究中構(gòu)建的蠶豆遺傳圖譜相比[27]，該遺傳圖譜密度較小，連鎖群上所分布的標(biāo)記不均勻，大多數(shù)標(biāo)記都分布在LG02上，LG01和LG06上分別僅有3個(gè)和2個(gè)標(biāo)記，主要是因?yàn)樾Q豆基因組大而構(gòu)建圖譜所用的標(biāo)記少，覆蓋率小導(dǎo)致的，后期需繼續(xù)篩選引物標(biāo)記來加密已構(gòu)建遺傳圖譜。在構(gòu)建遺傳圖譜時(shí)存在一些偏分離標(biāo)記，偏分離的概率達(dá)到了40.15%。前人[28-29]在研究中表明，構(gòu)建遺傳圖譜時(shí)偏分離是一種普遍現(xiàn)象，引起偏分離的原因有很多，如染色體丟失、重排、環(huán)境因素以及試驗(yàn)過程中的誤差等，本試驗(yàn)中偏分離存在的原因有待進(jìn)一步研究。本試驗(yàn)共定位到了5個(gè)與始莢節(jié)位相關(guān)的QTLs和8個(gè)與始莢高度相關(guān)的QTLs，兩個(gè)性狀各QTL位點(diǎn)貢獻(xiàn)率在0.61%～5.84%、0.39%～4.76%之間，小于10%，貢獻(xiàn)率較低。影響貢獻(xiàn)率的因素為遺傳方差和表型方差，本試驗(yàn)在進(jìn)行QTL作圖時(shí)，對(duì)每個(gè)SSR標(biāo)記位點(diǎn)在作圖群體中的分布情況進(jìn)行檢測(cè)，在P>0.05的顯著水平上，去除奇異分離的標(biāo)記后進(jìn)行QTL作圖，因此，遺傳因素對(duì)貢獻(xiàn)率的影響可以忽略。表型方差是導(dǎo)致低貢獻(xiàn)率的原因，本試驗(yàn)未設(shè)多年多點(diǎn)，作圖群體為F2群體，變異系數(shù)大，表型變異豐富，此外調(diào)查表型性狀時(shí)還存在人為誤差，基因和環(huán)境互作也對(duì)貢獻(xiàn)率有一定的影響。在后期試驗(yàn)中，應(yīng)選用次級(jí)作圖群體或設(shè)多年多點(diǎn)試驗(yàn)，減小試驗(yàn)中的隨機(jī)誤差，提高所定位的QTL的質(zhì)量。有研究表明，在QTL作圖結(jié)果中，遺傳效應(yīng)大、PVE低屬于正?，F(xiàn)象[30]。檢測(cè)到QTLs的準(zhǔn)確性還需進(jìn)一步驗(yàn)證，可采用連鎖分析和關(guān)聯(lián)分析相結(jié)合的方法來提高QTL定位結(jié)果的準(zhǔn)確性。

4 結(jié)論

蠶豆的始莢節(jié)位與始莢高度均是數(shù)量性狀，兩者之間呈極顯著正相關(guān)關(guān)系，這兩個(gè)性狀均由2對(duì)主基因控制，無多基因；始莢節(jié)位性狀遺傳力較小，容易受環(huán)境因素影響，始莢高度性狀遺傳力較大，表型變異主要由遺傳因子決定，受環(huán)境影響較小。經(jīng)過SSR標(biāo)記連鎖分析，定位到了5個(gè)始莢節(jié)位相關(guān)的QTLs和8個(gè)始莢高度相關(guān)的QTLs，貢獻(xiàn)率分別在0.61%～5.84%、0.39%～4.76%之間。這一研究結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇育種技術(shù)為定向選育適宜始莢高度與始莢節(jié)位的優(yōu)良品種選育提供依據(jù)。