焦 陽，馬 英，張 振，吳漢東，李躍飛

(錦州醫(yī)科大學(xué) 食品與健康學(xué)院，遼寧錦州 121000)

植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑是一類與植物激素類似的化學(xué)物質(zhì)，在植物生長(zhǎng)、發(fā)育等多個(gè)生理過程中表現(xiàn)顯著的調(diào)控作用，具有安全、作用面廣、用量少、見效快等特點(diǎn)，是近代生理學(xué)和農(nóng)業(yè)科學(xué)上的一項(xiàng)重大研究進(jìn)展。以吲哚丁酸和萘乙酸為標(biāo)志，天然、人工合成的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)已經(jīng)陸續(xù)應(yīng)用到農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中[1]。乙烯利是20世紀(jì)90年代人工合成的一種化學(xué)物質(zhì)，其主要成分為2-氯乙基磷酸，通過對(duì)植株進(jìn)行噴施等處理，能夠釋放出氣態(tài)乙烯發(fā)揮功能。外源乙烯(ethylene)在植物生長(zhǎng)發(fā)育期間，如果實(shí)成熟、葉片脫落、植株矮化生長(zhǎng)、花芽分化等過程均可產(chǎn)生顯著的調(diào)節(jié)作用[2]。同時(shí)，乙烯作為一種信號(hào)因子可以誘發(fā)植物內(nèi)源激素代謝過程發(fā)生變化[2]，如孫亮等[3]對(duì)百合鱗莖組織進(jìn)行外源乙烯的處理，發(fā)現(xiàn)對(duì)其組織內(nèi)的脫落酸(ABA)、赤霉素(GA)、生長(zhǎng)素(IAA)的含量均產(chǎn)生了顯著影響。這種現(xiàn)象在施用外源ABA、GA對(duì)葡萄和刺五加的處理過程中同樣得到了證實(shí)，表明內(nèi)源激素的合成與外源調(diào)節(jié)物質(zhì)之間存在著明顯的互作效應(yīng)[4-5]。

外源生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)作用于植物后，會(huì)引發(fā)基因表達(dá)水平的改變，進(jìn)而影響相關(guān)內(nèi)源激素的代謝過程。乙烯生物合成途徑中兩個(gè)重要的限速酶1-氨基環(huán)丙基-1-羧酸(ACC)合成酶(ACS)、氧化酶(ACO)的表達(dá)水平與乙烯產(chǎn)量間密切相關(guān)，在對(duì)西瓜[6]、中國(guó)南瓜[7]、番茄[8]、樹莓[9]、菠蘿[10]等作物進(jìn)行外源乙烯利處理后，兩種酶的表達(dá)豐度均出現(xiàn)了顯著提高，大大提升了乙烯的產(chǎn)率，表明乙烯利可以有效刺激作物內(nèi)源乙烯的合成。同時(shí)，有研究表明，外源乙烯利對(duì)厚皮甜瓜幼苗葉片中IAA和GA的合成具有抑制作用，對(duì)ABA的合成具有促進(jìn)作用[11]；乙烯利對(duì)轉(zhuǎn)基因油菜角果和種子發(fā)育階段的內(nèi)源激素GA和IAA的生成均具有抑制作用，推測(cè)乙烯與內(nèi)源植物激素相互作用，調(diào)節(jié)油菜籽角果和種子的發(fā)育和生長(zhǎng)[12]；西瓜幼苗在噴施乙烯利后，體內(nèi)IAA、ABA、GA的含量均低于對(duì)照[13]；黃瓜幼苗經(jīng)乙烯利處理后，莖尖組織中的IAA、ZT含量上升，而GA3則表現(xiàn)為降低，有利于雌性花芽的分化[14]。

苦瓜為葫蘆科作物，外源乙烯可以調(diào)控苦瓜幼苗的生長(zhǎng)發(fā)育以及花芽分化[15]。當(dāng)前的相關(guān)報(bào)道更多側(cè)重于對(duì)植株農(nóng)藝性狀以及內(nèi)源激素含量的分析，雖鑒定了個(gè)別調(diào)控基因，但從整體分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的角度，闡述乙烯利對(duì)內(nèi)源激素代謝過程的研究仍較為缺乏。因此，本研究對(duì)苦瓜幼苗進(jìn)行乙烯利處理，在分析內(nèi)源激素含量的基礎(chǔ)上，結(jié)合高通量測(cè)序(High-throughput sequencing)技術(shù)，從基因轉(zhuǎn)錄水平挖掘相關(guān)信息，獲得苦瓜應(yīng)對(duì)外源乙烯誘導(dǎo)的內(nèi)源激素代謝靶點(diǎn)，初步明確相關(guān)調(diào)控基因的作用特點(diǎn)，進(jìn)而為生產(chǎn)上調(diào)控瓜類作物的生長(zhǎng)發(fā)育奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)以苦瓜常規(guī)品種“綠爵士”為試材，在遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院(41.7898°N，123.4206°E)日光溫室內(nèi)播種，常規(guī)管理后出苗。在幼苗3～4葉期挑選生長(zhǎng)勢(shì)一致的植株，將其分為對(duì)照組(CK)與處理組(ET)兩部分，分別對(duì)葉片噴施蒸餾水和160 μL/L 的40% (v/v)乙烯利溶液，共噴施2次，2次間隔3 d。在末次處理后的第48小時(shí)采樣用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析(圖1)，末次處理后第7天采樣用于植物激素含量的測(cè)定。每一處理的樣品隨機(jī)選取10株幼苗，采集嫩葉和莖尖組織進(jìn)行混合，經(jīng)液氮速凍后置于-80 ℃超低溫冰箱凍存?zhèn)溆?，?shí)驗(yàn)共設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。

1.2 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.2.1 1-氨基環(huán)丙基-1-羧酸(ACC)含量的測(cè)定稱量約0.2 g植物樣品，于液氮中研磨后轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，加入5 mL去離子水，在超聲清洗儀中水浴30 min。然后于4 ℃下離心(10 000 r·min-1)5 min后取上清液，將上清液pH調(diào)至4.0。加入20 mL氯仿振蕩混勻，4 ℃下離心(10 000 r·min-1)5 min，取上清液過MCX小柱，并以2 mL甲醇，1 mL去離子水，5 mL氨水(1 mol·L-1)淋洗柱子。過0.22 μm濾膜，用于高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)檢測(cè)。HPLC分析條件：色譜柱(100 mm×2.1 mm×1.7 μm)，A相流動(dòng)相為水/甲醇(98/2，V/V)(添加0.05%甲酸和5 mmol·L-1乙酸銨)，B相流動(dòng)相為乙腈，流速為0.3 mL·min-1。MS/MS條件：氣簾氣15 psi，霧化溫度400 ℃，噴霧電壓4 500 V，霧化器壓力65 psi。

1.2.2 ACS活性測(cè)定稱量約2.0 g植物樣品，于液氮中研磨后轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的15 mL離心管中，加入3 mL的Tricine提取液震蕩。4 ℃下離心(10 000 r·min-1)3 min，取2.4 mL上清液加入到預(yù)冷的15 mL離心管中。過GE Sephadex去鹽柱去除樣品中原始ACC，以3 mL的Tricine柱洗液洗脫柱子，收集粗酶液。取1.5 mL粗酶液加入150 μL反應(yīng)buffer及150 μL的SAM溶液作為反應(yīng)底物，25 ℃下溫浴2 h，加入200 μL的HgCl2溶液終止反應(yīng)。過0.22 μm濾膜，用于高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)檢測(cè)，以新生成的ACC來計(jì)算ACS的活性。HPLC分析條件：色譜柱(100 mm×2.1 mm×1.7 μm)，A相流動(dòng)相為水/甲醇(98/2，V/V)(添加0.05%甲酸和5 mmol·L-1乙酸銨)，B相流動(dòng)相為乙腈，流速為0.3 mL·min-1。MS/MS條件：氣簾氣15 psi，霧化溫度400 ℃，噴霧電壓4 500 V，霧化器壓力65 psi。

1.2.3 內(nèi)源激素IAA、GA3、tZR含量的測(cè)定準(zhǔn)確約1.0 g植物樣品，于液氮中研磨后加入10 mL異丙醇/鹽酸提取緩沖液，4 ℃震蕩30 min，再加入20 mL二氯甲烷震蕩30 min。于4 ℃下離心(13 000 r·min-1)5 min后取下層有機(jī)相。避光下氮?dú)獯蹈捎袡C(jī)相，以400 μL甲醇(添加0.1%甲酸)溶解。過0.22 μm濾膜，用于高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)檢測(cè)。HPLC分析條件：色譜柱(150 mm×2.1 mm×2.7 μm)，A相流動(dòng)相為甲醇(添加0.1%甲酸)，B相流動(dòng)相為水(添加0.1%甲酸)，梯度洗脫流速為0～1 min時(shí)20%A，1～9 min時(shí)80%A，10～10.1 min時(shí)20%A，10.1～15 min時(shí)20%A。MS/MS條件：氣簾氣15 psi，霧化溫度400 ℃，噴霧電壓4 500 V，霧化器壓力65 psi。

1.2.4 轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序使用Trizol法提取6個(gè)試驗(yàn)樣本的總RNA，使用Bioanalyzer 2100和RNA 1000 Nano LabChip Kit分析總RNA的產(chǎn)量和純度，獲得質(zhì)量合格的樣本用于文庫的構(gòu)建。使用Oligo(dT)寡聚磁珠富集純化RNA，將其片段化后反轉(zhuǎn)錄為cDNA，創(chuàng)建最終的cDNA文庫，在Illumina Hiseq-4000高通量測(cè)序平臺(tái)上機(jī)檢測(cè)。

1.2.5 生物信息學(xué)分析對(duì)原始轉(zhuǎn)錄本(raw reads)去除接頭序列以及低質(zhì)量堿基信息，獲得有效轉(zhuǎn)錄本(clean reads)。采用從頭組裝的方式，使用Trinity 2.4.0進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本的整合[16]。將組裝后的Unigenes通過DIAMOND比對(duì)到Non-redundant(Nr)、Gene Ontology (GO)、Swiss-Prot、Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)以及eggNOG數(shù)據(jù)庫[17]。通過TPM值計(jì)算Unigenes的表達(dá)量，以“FDR < 0.05”和“l(fā)og2FC ≥ 1”為閾值，篩選兩個(gè)文庫間的差異表達(dá)基因(DEGs)。利用GOseq和KOBAS對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO和KEGG通路富集分析。

1.2.6 差異表達(dá)基因的qRT-PCR分析參考轉(zhuǎn)錄組中的TPM值，選擇8個(gè)差異表達(dá)基因，利用Primer Premier6.0軟件設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行熒光定量PCR分析(表1)。提取樣本總RNA，檢驗(yàn)RNA產(chǎn)量及純度，對(duì)質(zhì)量合格的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。根據(jù)第1鏈合成試劑盒(TaKaRa，日本)中的反應(yīng)體系和條件合成cDNA，以β-Actin基因作為內(nèi)參基因，在Bio-Rad IQ5 Real Time PCR系統(tǒng)(Bio-Rad，美國(guó))上進(jìn)行實(shí)時(shí)定量檢測(cè)，采用20 μL反應(yīng)體系，按2-ΔΔCt算法計(jì)算各差異基因的相對(duì)表達(dá)量[18]。

表1 qRT-PCR分析引物序列Table 1 Primers used for qRT-PCR analysis

2 結(jié)果與分析

2.1 外源乙烯利對(duì)苦瓜幼苗內(nèi)源激素含量和ACS活性的影響

苦瓜幼苗經(jīng)過葉面噴施乙烯利后，內(nèi)源激素的代謝受到影響，內(nèi)源激素含量發(fā)生了顯著的變化(表2)。其中，與對(duì)照(CK)相比，外源乙烯利處理苦瓜幼苗嫩葉和莖尖的1-氨基環(huán)丙基-1-羧酸(ACC)含量與ACS的活性均表現(xiàn)為顯著上升的趨勢(shì)，分別提升了23.2%和19.7%。由于ACS是ACC生物合成的限速酶，而且ACC是乙烯生物合成的直接前體，所以二者含量的升高有利于內(nèi)源乙烯的合成。同時(shí)，外源乙烯利處理苦瓜幼苗的兩種植物激素IAA和tZR含量也比相應(yīng)對(duì)照顯著上升，分別提高了57.5%和42.0%。與之相反，處理組幼苗GA3的含量卻比對(duì)照出現(xiàn)了顯著的下降，降幅達(dá)到了88.7%。上述結(jié)果表明，外源乙烯利處理能夠顯著誘發(fā)苦瓜幼苗激素水平的變化，同時(shí)誘導(dǎo)乙烯合成前體物質(zhì)ACC含量和ACC生物合成限速酶ACS活性的顯著提高，從而促進(jìn)內(nèi)源乙烯的合成。

表2 外源乙烯利處理下苦瓜幼苗內(nèi)源激素含量和ACS活性的變化Table 2 Endogenous hormonal contents and ACS activity of the bitter melon seedlings under exogenous ethephon treatment(ET)

2.2 外源乙烯利處理苦瓜幼苗轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析

通過對(duì)6個(gè)cDNA文庫進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，共產(chǎn)生原始數(shù)據(jù)49.66 Gb。其中clean reads數(shù)目介于53 195 286～55 924 028之間，測(cè)序Q30值大于95%，GC含量大于45%，表明測(cè)序質(zhì)量良好(表3)。對(duì)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行組裝后，最終鑒定到了46 026個(gè)基因，平均長(zhǎng)度494 bp。經(jīng)過與各數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)分析，在Nr、Pfam、Swiss-Prot、eggNOG、GO和KEGG數(shù)據(jù)庫中分別有59.37%、45.74%、41.88%、57.1%、51.86%和25.64%的基因得到了注釋。BLASTx比對(duì)結(jié)果顯示，同源序列命中比率最高的幾個(gè)物種分別為甜瓜(11385)、黃瓜(10580)、花燭屬紅掌(478)、葡萄(456)和水稻(446)。

表3 cDNA文庫RNA-seq 測(cè)序結(jié)果Table 3 Summary of sequencing results based on RNA-seq from six cDNA libraries

進(jìn)一步通過差異表達(dá)量分析，共獲得了1234個(gè)差異表達(dá)基因(DEGs)，其中679個(gè)為上調(diào)表達(dá)，555為下調(diào)表達(dá)。GO富集分析顯示，共有980個(gè)DEGs得到了有效富集，包括具有“分子功能”的545個(gè)，“細(xì)胞原件”的179個(gè)，“生物代謝過程”的909個(gè)。此外，共有570個(gè)DEGs在KEGG庫中得到了有效富集，這些基因可以整合到118條代謝通路當(dāng)中。其中包括植物-病原互作途徑(63DEGs)、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(41DEGs)、苯丙素的生物合成(39DEGs)、淀粉及糖代謝(35DEGs)、氨基糖和核苷酸糖的代謝(31DEGs)(圖2)。

2.3 外源乙烯利處理苦瓜幼苗參與內(nèi)源激素合成的差異基因

為了進(jìn)一步明確乙烯利誘導(dǎo)了哪些功能基因，進(jìn)而影響內(nèi)源激素的生物合成，基于數(shù)據(jù)庫比對(duì)信息，我們篩選了與激素代謝相關(guān)的差異表達(dá)基因(表4)。其中，在乙烯生物合成途徑中，共鑒定到了6個(gè)顯著上調(diào)表達(dá)的DEGs，包括1個(gè)ACS基因、1個(gè)ACO基因、3個(gè)HMT3基因，這些基因的表達(dá)趨勢(shì)與激素含量的變化情況一致。對(duì)于生長(zhǎng)素合成途徑，1個(gè)ALDH基因和1個(gè)TAA1基因出現(xiàn)了顯著下調(diào)，另一個(gè)基因UGT74B1表現(xiàn)為顯著的上調(diào)。由于生長(zhǎng)素合成途徑較為復(fù)雜，通常包含4條支路，因此上述基因的表達(dá)可能暗示著代謝支路發(fā)生了變化。與細(xì)胞分裂素代謝相關(guān)的基因表達(dá)水平也出現(xiàn)了改變，2個(gè)與其合成相關(guān)的CYP735A基因表達(dá)受抑，負(fù)責(zé)將細(xì)胞分裂素轉(zhuǎn)化為其他代謝產(chǎn)物的2個(gè)CKX基因則大幅度上調(diào)表達(dá)。對(duì)于GA的代謝途徑，只鑒定到1個(gè)參與其生物合成的上調(diào)表達(dá)基因KAO1，此外，通過對(duì)差異基因進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)2個(gè)抑制其活性的CYP736A12-like基因高倍數(shù)上調(diào)表達(dá)。

表4 與內(nèi)源激素代謝相關(guān)的差異表達(dá)基因Table 4 Differentially expressed genes involved in hormonal metabolism

2.4 外源乙烯利處理苦瓜幼苗參與激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的差異基因

內(nèi)源激素通常以信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的方式誘導(dǎo)下游一系列基因進(jìn)行表達(dá)。通過對(duì)KEGG通路數(shù)據(jù)庫中map04075進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，在乙烯的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑當(dāng)中，共有1個(gè)EIN3基因和11個(gè)ERF基因顯著上調(diào)表達(dá)。在生長(zhǎng)素通路當(dāng)中，3個(gè)負(fù)調(diào)控基因AUX/IAA的表達(dá)活性下降，1個(gè)ARF基因、1個(gè)GH3基因和3個(gè)SAUR基因表現(xiàn)為活性的上升。對(duì)于細(xì)胞分裂素通路來說，只獲得了1個(gè)上調(diào)表達(dá)的負(fù)調(diào)控基因A-ARR。在GA信號(hào)通路中，3個(gè)植株矮化基因GID1、1個(gè)PIF3基因表達(dá)活性顯著升高(表5)。上述參與激素應(yīng)答的基因表達(dá)豐度的改變，表明乙烯利處理不僅影響內(nèi)源激素的生物合成，同時(shí)也間接影響了下游基因的相應(yīng)功能。

表5 與內(nèi)源激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的差異表達(dá)基因Table 5 Differentially expressed genes involved in phytohormone signal transduction

2.5 外源乙烯利處理苦瓜幼苗差異表達(dá)基因的qRT-PCR分析

為了驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的準(zhǔn)確性，挑選了8個(gè)基因進(jìn)行熒光定量表達(dá)分析，主要包括β-葡萄糖苷酶基因、細(xì)胞分裂素代謝調(diào)控基因CKX3、乙烯合成基因ACO1、細(xì)胞色素類基因CYP77A3等。結(jié)果顯示，上述8個(gè)基因的表達(dá)趨勢(shì)與轉(zhuǎn)錄組log2FC值變化趨勢(shì)一致，其中4個(gè)為上調(diào)表達(dá)，4個(gè)下調(diào)表達(dá)，表明本次轉(zhuǎn)錄組獲得的數(shù)據(jù)信息較為可靠(圖3)。

3 討 論

植物的生長(zhǎng)發(fā)育受多種因素的調(diào)控，包括內(nèi)因和外因的影響。外部因素主要體現(xiàn)為生長(zhǎng)環(huán)境，包括溫度、光照、水分、土壤、養(yǎng)分等多個(gè)條件，組織器官的發(fā)育需要合適的環(huán)境條件。內(nèi)部因素則主要以植物激素的形式扮演著極為重要的“調(diào)節(jié)器”作用，在極低的濃度下即可誘發(fā)植物產(chǎn)生顯著的生理反應(yīng)，并表現(xiàn)為相應(yīng)的農(nóng)藝性狀改變。本研究中，外源乙烯利誘發(fā)了苦瓜幼苗幾種激素含量發(fā)生顯著變化。作為乙烯生物合成的直接前體物質(zhì)及其生物合成限速酶，ACC的含量與ACS的活性均顯著升高。在番茄和大麥等作物幼苗中，施用乙烯利或者ACC均可以升高內(nèi)源乙烯的含量，這與本研究結(jié)果一致[9,19]。生長(zhǎng)素可以促進(jìn)植株器官組織的發(fā)育，本研究中IAA的含量也表現(xiàn)出顯著的升高趨勢(shì)，陳學(xué)好等[14]的研究也表明，黃瓜幼苗經(jīng)乙烯利處理后組織內(nèi)IAA的含量出現(xiàn)了升高。Swarrp等[20]以擬南芥幼苗為試材，經(jīng)外源乙烯處理后，IAA含量同樣表現(xiàn)為升高的趨勢(shì)。但也有一些作物在經(jīng)過乙烯利處理后IAA的含量出現(xiàn)了下降，我們推測(cè)可能是由于實(shí)驗(yàn)對(duì)象的不同或者取樣時(shí)期的差異所導(dǎo)致。細(xì)胞分裂素主要通過細(xì)胞數(shù)目的增殖和莖尖組織的快速分化調(diào)節(jié)植株的生長(zhǎng)發(fā)育，其中兩種類型iP-type 和tZ-type通常被認(rèn)為具有顯著生理活性[21]，本研究中苦瓜幼苗經(jīng)乙烯利處理后tZR的含量出現(xiàn)了顯著升高，表明外源乙烯與細(xì)胞分裂素之間存在著正向的互作關(guān)系。GA在植物的發(fā)育過程中主要調(diào)控植株的高度與種子的萌發(fā)，本研究中GA3的含量在乙烯利的作用下出現(xiàn)了顯著的下降，這與大多數(shù)研究結(jié)果相符[11-12]。孫義甫等[22]在早前的研究中曾指出，乙烯利與GA間存在著明顯的抗拮作用，適當(dāng)濃度的GA溶液噴施黃瓜幼苗可以有效逆轉(zhuǎn)乙烯利對(duì)幼苗形態(tài)的影響。

內(nèi)源激素含量的改變?yōu)檫M(jìn)一步開展相關(guān)研究提供了條件，結(jié)合激素代謝的變化趨勢(shì)，我們對(duì)乙烯利處理后的苦瓜幼苗進(jìn)行了Illumina測(cè)序等后續(xù)研究。以往關(guān)于苦瓜的研究報(bào)道，對(duì)于乙烯利的作用模式基本局限于生理水平的研究，并沒有深入探討其對(duì)分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的影響，因此，從分子層面認(rèn)識(shí)苦瓜應(yīng)答外界乙烯刺激的研究具有重要理論意義。測(cè)序結(jié)果顯示，與激素代謝相關(guān)的功能基因出現(xiàn)了差異表達(dá)。首先在內(nèi)源乙烯的代謝過程中，S-腺苷-L-蛋氨酸(SAM)是其生物合成途徑的重要起始物質(zhì)，同時(shí)也是合成ACC的前體物質(zhì)，本研究發(fā)現(xiàn)了3個(gè)表達(dá)水平顯著升高的HMT3基因，該類基因可以有效促進(jìn)SAM的生物合成[23]。此外，ACO和ACS是乙烯合成途徑中的重要限速酶，二者的表達(dá)豐度在處理組中均出現(xiàn)了較大的提升，尤其是ACO1基因的表達(dá)倍數(shù)很高。上述結(jié)果表明，內(nèi)源乙烯含量的升高主要源于SAM的累積以及ACO和ACS基因的正向調(diào)控。

對(duì)于植株的生長(zhǎng)發(fā)育，生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素主要通過細(xì)胞體積的增大與細(xì)胞數(shù)目的增殖兩種方式進(jìn)行調(diào)控。生長(zhǎng)素的生物合成包括IAOx、TRA、IAM和IPA四條途徑[24]。本研究中2個(gè)與IAOx途徑相關(guān)的基因ALDH和TAA1出現(xiàn)了下調(diào)表達(dá)，而與IPA途徑有關(guān)的基因UGT74B1卻出現(xiàn)了上調(diào)表達(dá)。聯(lián)想到之前實(shí)驗(yàn)結(jié)果中IAA含量的增加，推測(cè)在外源乙烯的處理下苦瓜幼苗IAA的合成主要集中于IPA途徑，且合成水平有較大的增強(qiáng)。對(duì)于細(xì)胞分裂素的變化，理化分析與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序并不一致，HPLC-MS/MS檢測(cè)結(jié)果顯示tZR的含量比對(duì)照組有顯著升高，但tZR合成的限速酶基因CYP735A表達(dá)水平卻出現(xiàn)了下降。同時(shí)，促進(jìn)tZR轉(zhuǎn)化為其他代謝產(chǎn)物的CKX基因卻表現(xiàn)為顯著的上調(diào)表達(dá)。對(duì)于上述研究結(jié)果，我們分析可能與tZR較特殊的合成過程有關(guān)。已有研究證實(shí)tZR主要在植物的根中合成，然后經(jīng)由木質(zhì)部運(yùn)輸至地上葉片中[21]。在對(duì)地上植物組織進(jìn)行乙烯利處理后，可能誘發(fā)了某種反饋機(jī)制，當(dāng)葉片中與tZR生物合成相關(guān)的基因表達(dá)受抑時(shí)，根部tZR的合成代謝出現(xiàn)強(qiáng)化并更加集中地轉(zhuǎn)移至葉片中，來彌補(bǔ)由于轉(zhuǎn)錄受抑帶來的不利影響，從而使葉片部位保持較高的tZR含量。

赤霉素屬于四環(huán)二萜類化合物，迄今為止已發(fā)現(xiàn)一百多種類型。其中主要以GA1、GA3、GA4、GA7等結(jié)構(gòu)類型具有顯著的生理活性，尤其以GA3的研究和應(yīng)用最為廣泛[25]。外源乙烯對(duì)內(nèi)源GA的影響較多表現(xiàn)為抗拮作用，本研究也發(fā)現(xiàn)苦瓜幼苗中GA3含量在乙烯利處理后出現(xiàn)了顯著下降，降幅達(dá)到了88.7%。但測(cè)序結(jié)果顯示，控制GA3合成的相關(guān)功能基因并沒有出現(xiàn)顯著的下調(diào)表達(dá)。值得注意的是，在激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，多達(dá)11個(gè)ERF家族轉(zhuǎn)錄因子出現(xiàn)了表達(dá)水平的升高，其中有多個(gè)表現(xiàn)出極高的表達(dá)倍數(shù)；Dubois等[26]和Plett等[27]的研究發(fā)現(xiàn)，ERFs基因的上調(diào)表達(dá)可以誘發(fā)生理活性型GAs含量下降，進(jìn)而導(dǎo)致植株表現(xiàn)出明顯的矮化生長(zhǎng)現(xiàn)象。另外，我們?cè)诮y(tǒng)計(jì)高倍數(shù)表達(dá)的差異基因時(shí)，發(fā)現(xiàn)了2個(gè)與GAs代謝間接相關(guān)的P450CYP736A12基因，前人研究表明在擬南芥幼苗中超表達(dá)這類基因可以使生理活性型GAs的含量出現(xiàn)下降，從而引發(fā)植株莖節(jié)的短縮[28]。鑒于此，我們推測(cè)本研究中外源乙烯利雖然沒有在轉(zhuǎn)錄水平影響GA3的生物合成，但轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制(Post-translational regulation)很可能以諸如ERF等轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的方式，使活性GA3出現(xiàn)分解，進(jìn)而導(dǎo)致其含量的下降。

除上述參與內(nèi)源激素合成的基因受到影響之外，激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的相關(guān)基因也出現(xiàn)了表達(dá)水平的改變。植株在經(jīng)歷乙烯利處理后，內(nèi)源激素誘導(dǎo)信號(hào)通路中一系列調(diào)節(jié)因子差異表達(dá)，使植株發(fā)育過程中的細(xì)胞體積、數(shù)目，莖桿長(zhǎng)度，以及側(cè)根發(fā)育等表觀性狀出現(xiàn)變化。這些調(diào)節(jié)因子中不乏有類似ERFs的基因，還能以反饋調(diào)控的方式影響內(nèi)源激素(如GA3)的代謝水平?？傮w來講，本研究從分子代謝水平上獲得了大量外源乙烯利對(duì)苦瓜作物的作用靶點(diǎn)，并探討了基因可能存在的調(diào)控功能。將來可以從中挑選某些感興趣的基因進(jìn)一步開展功能驗(yàn)證等后續(xù)工作，從而更加深刻地揭示乙烯類物質(zhì)對(duì)瓜類作物的調(diào)節(jié)機(jī)制。