林慶柱，林芬，蔡林生 ，李振宇，朱友聰

(1.浙江亞米農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司，浙江衢州 324102;2.浙江同濟(jì)科技職業(yè)學(xué)院，浙江杭州 311231)

獼猴桃(Actinidia)為獼猴桃科獼猴桃屬落葉藤本果樹，果實(shí)因營(yíng)養(yǎng)豐富、特別是高維生素C含量深受消費(fèi)者喜愛[1]。中國(guó)是世界上最大的獼猴桃生產(chǎn)國(guó)[2], 江山市是浙江省最大的獼猴桃生產(chǎn)區(qū)域，種植面積在1 600 hm2左右，目前獼猴桃已成為江山市縣域經(jīng)濟(jì)的優(yōu)勢(shì)產(chǎn)業(yè)。近年來，獼猴桃根腐病的發(fā)生正成為困擾該區(qū)域獼猴桃生產(chǎn)的主要問題，致使樹勢(shì)變?nèi)?、產(chǎn)量降低、品質(zhì)變差[3]。

高通量測(cè)序作為第2代測(cè)序技術(shù)，具有操作簡(jiǎn)單、成本低、結(jié)果可信度高等優(yōu)勢(shì)，一次可對(duì)幾百萬條，甚至上千萬條DNA序列分別進(jìn)行測(cè)序，有助于準(zhǔn)確分析環(huán)境中微生物的組成和分布[4]。筆者采用高通量測(cè)序的方法，研究獼猴桃根腐病植株根際土壤真菌群落多樣性和群落結(jié)構(gòu)特征，為生物防治此病害提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

獼猴桃種植園位于江山市塘源口鄉(xiāng)倉(cāng)坂村，地處中亞熱帶北部濕潤(rùn)季風(fēng)氣候區(qū)，光照充足，降雨充沛，雨熱同期，多年平均氣溫17 ℃，無霜期249.7 d，地貌為山地丘陵。于2020年9月12日在獼猴桃種植園內(nèi)采集土壤樣品。選取面積10 m×10 m，間隔6 m的相鄰的3個(gè)小區(qū)，每小區(qū)的土壤類型、肥力水平、施肥條件以及栽培管理措施均一致。在每個(gè)小區(qū)內(nèi)隨機(jī)選取3株具有典型發(fā)病癥狀的獼猴桃植株，同時(shí)選取3株生長(zhǎng)健康、未感病的獼猴桃植株作為對(duì)照。用無菌手套采用抖落法收集粘附在感病植株與未感病植株細(xì)根上的土壤作為土壤樣品，去除雜質(zhì)，用直徑2 mm的網(wǎng)篩過篩。取10 g土置于已消毒的自封袋中，利用冰盒保存，用于高通量測(cè)序。

1.2 土壤 DNA 提取與真菌ITS基因擴(kuò)增

采用E.Z.N.A. Soil DNA Kit試劑盒法(D5625，美國(guó)Omega公司)，提取土樣的總DNA。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA提取質(zhì)量，采用Nano Drop ND-1000紫外分光光度計(jì)(美國(guó)Nano Drop公司)對(duì)DNA進(jìn)行定量測(cè)定。各樣品的5份DNA樣品隨機(jī)取3份等量混均，分別制成3個(gè)平行樣品，于-20 ℃保存?zhèn)溆?。使用的引物為ITS1FI2(5’-GTGARTCATCGAATCTTTG-3’)和ITS2 (5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)，對(duì)真菌ITS2可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)目標(biāo)片段進(jìn)行回收，采用 AxyPrep PCR Cleanup Kit回收試劑盒。純化后的PCR產(chǎn)物采用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit在Qbit熒光定量系統(tǒng)上對(duì)文庫(kù)進(jìn)行定量，合格的文庫(kù)濃度應(yīng)在2 nM以上。將合格的文庫(kù)(Index序列不可重復(fù))梯度稀釋后，根據(jù)所需測(cè)序量按相應(yīng)比例混合，并經(jīng)NaOH變性為單鏈進(jìn)行上機(jī)測(cè)序，使用NovaSeq測(cè)序儀進(jìn)行2×250 bp的雙端測(cè)序[5]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

經(jīng)過 QIIME( V1.8.0) 軟件過濾、拼接、去除嵌合體后，聚類為用于物種分類的OTU，并將所有樣品進(jìn)行抽平。采用 RDP classifier 貝葉斯算法對(duì)97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析，置信度閾值為0.7，選用Silva數(shù)據(jù)庫(kù)，得到分類學(xué)信息[6]。

2 結(jié)果與分析

2.1 門水平上感病與未感病植株根際土壤真菌優(yōu)勢(shì)菌群

經(jīng)檢測(cè)，獼猴桃未感病植株根際土壤真菌的第一優(yōu)勢(shì)門為擔(dān)子菌門，其他依次為子囊菌門、未分類菌門和接合菌門。感病植株根際土壤真菌的第一優(yōu)勢(shì)門為子囊菌門，其他的依次為擔(dān)子菌門、未分類菌門和接合菌門。感病植株的子囊菌門的相對(duì)豐度為96.55%，比未感病植株高51.79%，為極顯著性差異(P<0.01)。感病植株的擔(dān)子菌門、接合菌門的相對(duì)豐度分別為2.71%和0.18%，比未感病植株低48.05%和0.94%，為極顯著性差異(P<0.01)。

2.2 綱水平上感病和未感病植株根際土壤真菌優(yōu)勢(shì)菌群

在綱水平上，獼猴桃根腐病感病植株根際土壤真菌的第一優(yōu)勢(shì)菌綱為糞殼菌綱，其他的依次為座囊菌綱、散囊菌綱、傘菌綱。未感病植株的第一優(yōu)勢(shì)菌綱為傘菌綱，其他的依次為糞殼菌綱、座囊菌綱、盤菌綱。感病植株的糞殼菌綱相對(duì)豐度90.22%，比未感病植株高52.64%，為極顯著性差異(P<0.01)。感病植株與未感病植株的座囊菌綱相對(duì)豐度差異不顯著。感病植株的散囊菌綱相對(duì)豐度為1.23%，比未感病植株高0.77%，為極顯著性差異(P<0.01)。感病植株的傘菌綱、盤菌綱相對(duì)豐度分別為1.20%、0.94%，比未感病植株分別低49.36%、1.76%，均為極顯著性差異(P<0.01)。

2.3 目水平上感病和未感病植株根際土壤真菌優(yōu)勢(shì)菌群

在目水平上，獼猴桃根腐病感病植株根際土壤真菌的第一優(yōu)勢(shì)菌目為肉座菌目，相對(duì)豐度84.89%，比未感病植株增加了66.24%，為極顯著性差異(P<0.01)。其他的依次為Sordariales、小囊菌目、散囊菌目。未感病植株根際土壤真菌的第一優(yōu)勢(shì)菌目為未分類的傘菌綱，其他的依次為肉座菌目、Sordariales、Trexhisporales、小囊菌目。感病植株根際土壤Sordariales的相對(duì)豐度為3.09%，比未感病植侏低了7.17%，為極顯著性差異(P<0.01)。

2.4 科水平上感病和未感病植株根際土壤真菌優(yōu)勢(shì)菌群

在科水平上，獼猴桃根腐病感病植株根際土壤真菌的第一優(yōu)勢(shì)菌科為赤殼科，相對(duì)豐度81.15%，比未感病植株高72.35%，為極顯著性差異(P<0.01)。其他依次為假散囊菌科、肉座菌科、毛球殼科、囊菌科。未感病植株根際土壤真菌的第一優(yōu)勢(shì)菌群為未分類的傘菌綱，相對(duì)豐度38.78%，其他的依次為刺孢菌科、赤殼科、毛球殼科、囊菌科。感病植株的毛球殼科、囊菌科相對(duì)豐度分別為2.38%、1.75%，比未感病植株降低6.27%、5.04%，均為極顯著性差異(P<0.01)。

圖1 科水平上感病和未感病植株根際土壤真菌優(yōu)勢(shì)群落

2.5 屬水平上感病與未感病植株根際土壤真菌優(yōu)勢(shì)菌群

在屬水平上，獼猴桃根腐病感病植株根際土壤真菌的第一優(yōu)勢(shì)菌屬為赤霉菌屬，相對(duì)豐度27.86%，比未感病植株高19.79%，為極顯著性差異(P<0.01)。其他的依次為叢赤殼屬、鐮刀菌屬、假裸囊菌屬、肉座菌屬、枝鼻菌屬。未感病植株根際土壤真菌的第一優(yōu)勢(shì)菌群為未分類菌綱，其相對(duì)豐度為38.78%，其他的依次為粗糙孔菌屬、赤霉菌屬、枝鼻菌屬、Ophiocordyceps,枝孢屬等。感病植株根際土壤叢赤殼屬、鐮刀菌屬的相對(duì)豐度分別為24.88%、6.19%，比未感病植株高857.93倍、88.43倍，為極顯著性差異(P<0.01)。

圖2 屬水平上感病和未感病植株根際土壤真菌優(yōu)勢(shì)群落

3 小結(jié)與討論

農(nóng)田土壤中的子囊菌門包含了很多作物病原菌。謝玉清等[7]采用高通量測(cè)序法分析了新疆吉木薩爾縣大蒜根腐病發(fā)生時(shí)其植株根際土壤真菌的群落結(jié)構(gòu)變化特征，認(rèn)為高豐度的子囊菌門菌群與大蒜根腐爛病害發(fā)生有著密切的關(guān)系，在根腐病發(fā)生最嚴(yán)重的大蒜抽苔期，感染根腐病的大蒜植株根際土壤維持著較高豐度的接合菌門。宋旭紅等[8]采用Illumina高通量測(cè)序技術(shù)分析了黃連根腐病根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)組成，發(fā)現(xiàn)病株土壤中子囊菌門菌群的相對(duì)豐度顯著高于健康株的，而接合菌門菌群在病株土壤中的相對(duì)豐度則顯著低于健康植株的。

本研究發(fā)現(xiàn)獼猴桃植株感染根腐病后，其根際土壤真菌子囊菌門(Ascomycota)的相對(duì)豐度比未感病植株根際土壤多115.71%，而擔(dān)子菌門(Basidiomycota)和接合菌門(Zygomcota)的相對(duì)豐度分別少94.66%和83.93%。本研究結(jié)果與上述學(xué)者[7，8]的研究結(jié)果相一致，表明獼猴桃健康植株根系分泌物能夠抑制子囊菌門的繁殖，促進(jìn)接合菌門和擔(dān)子菌門的繁殖，而根腐病感病植株根系與根際土壤微生物之間的平衡互作關(guān)系遭到破壞，促進(jìn)了根際土壤子囊菌門的繁殖。

本研究中獼猴桃感染根腐病植株的被孢霉屬(Mortierella)的相對(duì)豐度明顯低于未感病植株。土壤中被孢霉屬是一類益生真菌菌群，可以產(chǎn)生多種生物活性物質(zhì)。此外，未感病獼猴桃植株根際土壤真菌枝鼻菌屬(Cladorrhinum)、粗糙孔菌屬(Trechispora)、線蟲菌屬(Ophiocordyceps)等益生真菌屬菌群的相對(duì)豐度顯著高于感病植株的，這些菌屬很可能具有生防功能，說明感病后，根際土壤中的該真菌屬菌群遭到了破壞。

鐮刀菌屬?gòu)V泛分布于自然界，某些菌株能夠產(chǎn)生植物刺激素、植保素和類生長(zhǎng)素等促進(jìn)植物生長(zhǎng)，也能引起很多作物發(fā)生赤霉菌病和枯萎病[9]。本研究中獼猴桃根腐病感病植株根際土壤鐮刀菌屬的相對(duì)豐度比未感病植株的高87.43倍，說明鐮刀菌屬也是引起獼猴桃根腐病的主要病菌之一。獼猴桃感染根腐病后，植株體內(nèi)產(chǎn)生的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可能有利于鐮刀菌屬的生長(zhǎng)，從而導(dǎo)致鐮刀菌屬相對(duì)豐度增加。

本研究表明，與未感病植株相比，獼猴桃植株感染根腐病后其根際土壤真菌的群落結(jié)構(gòu)和相對(duì)豐度發(fā)生了顯著變化，打破了植物根際土壤微生態(tài)系統(tǒng)中原有的微生物拮抗平衡關(guān)系，形成了新的真菌群落關(guān)系。與未感病植株根際土壤相比，在門分類水平上，感病植株根際土壤子囊菌門相對(duì)豐度增高，而接合菌門和擔(dān)子菌門的相對(duì)豐度降低。在綱分類水平上，感病植株根際土壤糞殼菌綱的相對(duì)豐度增高，傘菌綱、盤菌綱的相對(duì)豐度降低。在目分類水平上，感病植株根際土壤肉座菌目的相對(duì)豐度增多，而Sordaihales,Trechnsporales、小殼菌目的相對(duì)豐度降低。在科分類水平上，感病植株根際土壤赤殼科的相對(duì)豐度增加，而毛球殼科、囊菌科的相對(duì)豐度降低。在屬分類水平上，感病植株根際土壤的赤霉菌屬、叢赤殼屬的相對(duì)豐度增高。與未感病植株相比，在各分類水平上感病植株根際土壤各菌群的相對(duì)豐度差異基本上都達(dá)極顯著水平。