袁先鈴，鄭貽丹，羅燚，林洪斌

（1.四川輕化工大學生物工程學院，四川宜賓 644005）（2.西華大學食品與生物工程學院，四川成都 610039）

自貢冷吃兔，是自貢乃至川南地區(qū)的一種特色傳統(tǒng)肉制品，以鮮兔肉為原料，輔以辣椒、花椒、姜等香辛料，經(jīng)預煮、腌制、炒制等工藝加工而成[1]，其色澤亮黃，具有川菜特有的麻辣鮮香，嚼勁十足且爽口不綿。2014年，自貢冷吃兔成為國家地理標志保護產(chǎn)品，2020年，發(fā)布行業(yè)標準《地理標志產(chǎn)品自貢冷吃兔》[2]。以兔肉為原料的自貢冷吃兔產(chǎn)品營養(yǎng)豐富，但自貢冷吃兔加工與生產(chǎn)環(huán)節(jié)為開放式，并且多采用巴氏殺菌，容易出現(xiàn)微生物污染，導致產(chǎn)品在流通、儲藏過程中易腐敗變質(zhì)，造成自貢冷吃兔貨架期短，從而限制了企業(yè)的發(fā)展、產(chǎn)品的流通銷售等。

作為自貢冷吃兔的原料兔肉，近年來頗受大眾歡迎，是人們攝取營養(yǎng)物質(zhì)的優(yōu)秀來源[3-5]。目前，兔產(chǎn)業(yè)因新冠疫情有所影響，但肉兔產(chǎn)業(yè)預計將繼續(xù)維持上升趨勢，兔產(chǎn)業(yè)整體發(fā)展也將持續(xù)上升[6]。研究調(diào)查顯示中國對兔肉的消費主要取決于加工水平，而在國外更加在意兔肉的來源[7]。目前對兔肉的研究主要集中在提升兔肉品質(zhì)[8,9]，兔肉結(jié)構特性[10]分析以及兔的飼養(yǎng)[11]等。在熟肉中常見污染微生物有乳酸菌、肉毒梭狀芽孢桿菌、沙門氏菌、蠟樣芽孢桿菌、熱殺索絲菌和大腸桿菌等[12-14]。李冉等[15]對氣調(diào)包裝獅子頭冷藏過程中微生物變化及菌群結(jié)構分析，發(fā)現(xiàn)獅子頭腐敗時期的菌群結(jié)構主要腸桿菌屬（Enterobacterspp.）、乳酸菌屬（Lactobacillusspp.）以及嗜冷桿菌屬（Psychrobacterspp.）等組成。彭先杰等[16]發(fā)現(xiàn)腐生葡萄球菌、巴氏葡萄球菌、雞葡萄球菌和枯草芽孢桿菌是香辣仔鵝的特征腐敗菌。在冷吃兔整個生產(chǎn)工藝中，生產(chǎn)原輔料是主要的微生物污染來源，其原帶菌數(shù)是生產(chǎn)工藝中關鍵控制點，原輔料本身就存在衛(wèi)生狀況較差的現(xiàn)狀，風險較高，不僅可能造成終產(chǎn)品的食品安全問題，還有存在交叉污染的風險，因此要嚴格把控原輔料帶菌數(shù)，從源頭降低微生物污染[17-19]。

本研究對自貢冷吃兔的原料和主要輔料中的微生物數(shù)量進行測定，采用傳統(tǒng)培養(yǎng)法結(jié)合16S rDNA測序技術鑒定，確定原料和各種輔料中細菌的主要種屬，建立潛在污染細菌庫，并進行溯源分析。為從冷吃兔生產(chǎn)源頭控制細菌種類與數(shù)量提供理論依據(jù)，從而延長自貢冷吃兔的貨架期，擴大產(chǎn)品的流通范圍。同時，也為川菜工業(yè)化產(chǎn)品細菌控制提供參考，為川菜產(chǎn)品走向全國、乃至全世界提供一定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

冷鮮兔、辣椒、花椒、八角、芝麻、孜然、山奈、香料、桂皮、生產(chǎn)用水，自貢市某食品有限公司；氯化鈉（分析純），上海源葉生物科技有限公司；PCA平板計數(shù)瓊脂、Baird-Parker瓊脂基礎、結(jié)晶紫中性紅膽鹽葡萄糖瓊脂（VRBGA）、MRS培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、亞蹄酸鹽卵黃增菌液，青島海博生物技術有限公司；甘油，上海麥克林生化科技有限公司；1×TSE101金牌mix、TSINGKE高純度低電滲瓊脂糖、DNA凝膠回收試劑盒、DL5000 Marker，Tsingke公司。

HLD-30002型電子天平，杭州友恒稱重設備有限公司；DK-98-11型萬用電爐，北京科偉永興儀器有限公司；LS-75HD型立式壓力蒸汽滅菌器，江陰濱江醫(yī)療設備有限公司；101-3AB型數(shù)顯恒溫鼓風干燥箱，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；DZKW-D-2型電熱恒溫水浴鍋，上海科恒實業(yè)發(fā)展有限公司；Hws-250B型恒溫恒濕培養(yǎng)箱，天津市宏諾儀器有限公司；SW-CJ-2FD型凈化工作臺，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；QYC-2102型雙層小容量全溫恒溫搖床，上海?，斣囼炘O備有限公司；3730XL型測序儀，Applied Biosystems；Legend Micro17型離心機，Thermo；2720 thermal cycler型PCR儀，Applied Biosystems；JY300C型電泳儀、JYDF(定制)型電泳槽、JY04S-3C型凝膠成像儀，君意東方；DFD-700型水浴鍋，北京中興偉業(yè)；L550型板式離心機，cence湘儀。

1.2 試驗方法

1.2.1 取樣及處理

1.2.1.1 樣品來源

真空冷吃兔樣品及冷吃兔生產(chǎn)原料取自自貢市某食品有限公司，未添加任何防腐保鮮劑，采用同一批次隨機取樣，每一種原料或輔料，設立三個平行，在真空密封低溫的條件下運輸至實驗室檢測及保存。

1.2.1.2 真空包裝冷吃兔生產(chǎn)工藝流程

選擇原輔料→兔肉切丁→焯水→腌制→炒制→真空包裝→滅菌→成品

1.2.1.3 腐敗樣品預處理

將樣品置于25 ℃貯藏至產(chǎn)生氣泡、脹袋，得到腐敗終點樣品。

1.2.2 原輔料的數(shù)量測定

參照GB 4789.2-2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數(shù)測定》[20]、GB 4789.35-2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗》[21]、GB 4789.41-2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 腸桿菌科檢驗》[22]和GB 4789.10-2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 金黃色葡萄球菌檢驗》[23]對原輔料進行菌落總數(shù)、乳酸菌數(shù)量、腸桿菌數(shù)數(shù)量、金黃色葡萄球菌數(shù)量測定。

表1 細菌的培養(yǎng)條件 Table 1 Bacterial culture conditions

1.2.3 原輔料細菌的分離純化

挑選菌落數(shù)量測定后菌落數(shù)量在30～300的培養(yǎng)基，觀察菌落的顏色、大小、形態(tài)、邊緣結(jié)構、隆起程度、光澤度及透明度等特征。挑選典型菌落，進行革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察，并進行劃線分離純化，至少進行3次劃線，直至得到純化單菌落。挑取純菌落于LB培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)，加入終濃度為20%的甘油，-20 ℃保藏、備用。

1.2.4 細菌的分子鑒定

1.2.4.1 擴增與測序

取1 mL保藏的菌液轉(zhuǎn)接于LB培養(yǎng)基，37 ℃過夜培養(yǎng)，4 ℃，8000 r/min離心10 min，棄上清，獲得細菌菌體沉淀。采用TSINGKE植物DNA提取試劑盒（通用型）提取純化菌株的DNA，以提取的DNA樣品作為模版，采用16S rDNA細菌通用引物27F：5’-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3’，1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’為引物，PCR擴增反應體系為25 μL：上下游引物各1 μL，模版2 μL，10 μL 2×Tap Master Mix，補ddH2O至25 μL。反應程序為：98 ℃預變性2 min，38個循環(huán)（98 10 s℃ ，55 ℃15 s，72 15 s℃ ），72 ℃延伸5 min。PCR擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送至北京擎科生物科技有限公司進行測序。

1.2.4.2 16S rDNA序列同源性分析

將返回的16S rDNA基因測序結(jié)果通過美國國家生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫對各菌株進行Blast相似序列檢索，一般來講，在種分類等級上，如果2個分類單位間的16S rDNA序列同源性大于97.5%，則認為屬于同一個種。

1.2.4.3 系統(tǒng)發(fā)育樹的構建

以確定的細菌16S rDNA序列為構建系統(tǒng)發(fā)育樹的參考菌株，用未知序列與已知序列進行序列對比后，通過MEGA X軟件中Neighbor Join法構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組試驗均進行3次及以上平行測定，采用Microsoft Excel 2016、SPSS Statistics 22和Oringin 2019對試驗數(shù)據(jù)進行處理、統(tǒng)計和制圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同原輔料中細菌數(shù)量分析

由表2主要原輔料細菌檢測結(jié)果可知：不同原輔料菌落總數(shù)從大到小為：兔肉＞孜然＞辣椒＞香料＞生產(chǎn)用水＞山奈＞八角＞桂皮＞花椒＞芝麻；未在生產(chǎn)用水中檢出乳酸菌屬細菌，其余原輔料中均檢出乳酸菌屬細菌，其中兔肉、辣椒、孜然、香料含乳酸菌數(shù)目大；金黃色葡萄球菌存在于兔肉、辣椒、孜然、山奈、香料，其中兔肉中高達6.02 lg(CFU/g)；腸桿菌屬細菌在兔肉、辣椒、孜然、香料中檢出，兔肉與孜然中腸桿細菌含量高。生產(chǎn)所用原輔料中，兔肉、辣椒、孜然、香料帶菌量大，且均存在乳酸菌、金黃色葡萄球菌、腸桿菌；花椒、八角、芝麻、桂皮中主要存在乳酸菌，山奈中存在乳酸菌和金黃色葡萄球菌；生產(chǎn)用水雖未檢出乳酸菌、金黃色葡萄球菌、腸桿菌，其菌落總數(shù)為2.89 lg(CFU/mL)（GB 5749-2006《生活飲用水衛(wèi)生標準》規(guī)定車間生產(chǎn)用水菌落總數(shù)應≤100 CFU/mL且不得檢出大腸菌群[24]）。自貢冷吃兔生產(chǎn)所用兔肉、辣椒、孜然、香料為潛在細菌污染源，生產(chǎn)用水超標，采用超標的生產(chǎn)用水清洗，可能對兔胴體起不到清洗減菌作用，且會增加交叉污染的可能性。應當嚴格控制原輔料的采購，對運輸、儲存、生產(chǎn)條件進行標準、規(guī)范、衛(wèi)生管理。

表2 主要原輔料細菌檢測結(jié)果 Table 2 Bacterial detection results of main raw materials

2.2 細菌生理形態(tài)特征分析

通過4種選擇培養(yǎng)基對自貢冷吃兔生產(chǎn)原料及各種輔料中的細菌進行稀釋涂布篩選，至少3次平板劃線得到單菌落，共分離到76株菌，針對每種原輔料選取菌落數(shù)量最多的菌株進行菌落形態(tài)特征描述，見表3。

表3 原輔料中部分細菌的菌落形態(tài)特征 Table 3 Colony morphological characteristics of some bacteria in raw materials

2.3 16S rDNA PCR擴增產(chǎn)物電泳圖譜

采用通用引物27F/1492R對76株菌16S rDNA擴增，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，其中部分菌株電泳圖如圖1。

圖1 部分菌株16S rDNA PCR擴增產(chǎn)物電泳圖譜 Fig.1 Electrophoresis patterns of 16S rDNA PCR amplification products of some strains

如圖1所示，電泳圖譜顯示均得到大約1500 bp的PCR擴增片段，條帶明亮清晰，滿足后續(xù)測序要求，隨后進行測序。

2.4 鑒定結(jié)果

用ContigExpress拼接測序結(jié)果，并去除兩端不準的部分，將拼接好的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫（blast.ncbi.nlm.nih.gov）中進行比對，選取同源性（≥99%）最高的菌株序列，結(jié)果如表4至11所示。

2.4.1 原料兔肉中的主要細菌

由表4可知，從冷鮮兔中分離出的11株菌，分布于8個屬，其中2株（菌株號TR1、TR5）與土生拉烏爾菌（Raoultella terrigena）[25]相似度高達99%、TR2與擴展短桿菌（Brevibacterium linens）[26]相似度高達99%、TR3為蜂房哈夫尼菌（Hafnia alvei）[27]、TR4為河生萊略特氏菌（Lelliottia amnigena）[28]、TR6為弗氏檸檬酸桿菌（Citrobacter freundii）[29]、TR7為液化沙雷氏菌（Serratia liquefaciens）[30]、TR9為Empedobacter falsenii[31]、2株（TR8、TR11）解鳥氨酸拉烏爾菌（Raoultella ornithinolytica）[32]、TR10為乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）[33]。

表4 冷鮮兔肉中主要細菌的鑒定 Table 4 Identification of main bacteria in chilled rabbit meat

2.4.2 辣椒中的主要細菌

從辣椒中分離到10株菌，屬于4個屬，其中2株（LJ4、LJ8）鑒定為霍氏腸桿菌（Enterobacter hormaechei）[34]，2株（LJ6、LJ10）腸桿菌（Enterobactersp）[35]，LJ1為陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）[36]，LJ2為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）[37]，LJ3為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[38]，LJ5為甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus）[39]，LJ7為Siccibacter colletis[40]，LJ9為棲熱菌（Thermussp）[41]。

2.4.3 花椒與八角中的主要細菌

從花椒中分離得到4株菌，分布于2個屬，HJ1為水管致黑棲熱菌（Thermus scotoductus）[42]，HJ2為蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）[43]，HJ3為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[38]，HJ4為巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）[44]。

從八角中分離到8株菌，屬于2個屬，2株（菌株號BJ6、BJ7）與巨大芽孢桿菌相似度最高，BJ1為芽孢桿菌（Bacillussp）[45]，BJ2為水管致黑棲熱菌（Thermus scotoductus）[42]，BJ3為萎縮芽孢桿菌（Bacillus atrophaeus）[46]，BJ4為短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）[47]，BJ5為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[38]，BJ8為阿氏芽孢桿菌（Bacillus aryabhattai）[48]。

2.4.4 芝麻和孜然中的主要細菌

從芝麻中分離到3株菌，分別鑒定為短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）[47]，乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）[49]，地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）[37]。從孜然中分離到4株菌，分別為惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）[50]，Siccibacter colletis，陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae）[36]，考氏科薩克氏菌（Kosakonia cowanii）[51]。

表5 生產(chǎn)所用辣椒中主要細菌的鑒定 Table 5 Identification of main bacteria in pepper used in production

表6 生產(chǎn)所用花椒與八角主要細菌的鑒定 Table 6 Identification of main bacteria in prickly ash and aniseed used in production

表7 生產(chǎn)所用芝麻和孜然主要細菌的鑒定 Table 7 Identification of main bacteria of sesame and cumin used in production

表8 生產(chǎn)所用山奈中主要細菌的鑒定 Table 8 Identification of main bacteria of Sanai used in production

2.4.5 山奈中的主要細菌

從山奈中分離純化得到6株菌，全屬于芽孢桿菌屬（Bacillussp），其中SN1與SN5枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[38]，SN2為甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus）[39]，SN3、SN4為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）[52]，SN6為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）[37]。

2.4.6 香料中的主要細菌

從香料中分離出15株菌，屬于3個屬，其中3株（XL6、XL7、XL11）為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[38]，3株（XL2、XL14、XL15）屬于Mixta calida，2株（XL1、XL9）熱生泛菌（Pantoea calida）[53]，XL4為沙福芽孢桿菌（Bacillus safensis）[54]，XL5為芽孢桿菌（Bacillus sp）[45]，XL8為短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）[47]，XL10為克勞氏芽孢桿菌（Bacillus clausii）[55]，XL12為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）[56]，XL12為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）[37]。

2.4.7 桂皮中的主要細菌

從桂皮中分離純化得到12株菌，屬于2個屬，其中4株（GP1、GP5、GP6、GP11）枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[38]，GP2為短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）[47]，GP3為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）[52]，GP4為甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus）[39]，GP7為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）[56]，GP8為死亡谷芽孢桿菌（Bacillus vallismortis）[57]，GP9為棲熱菌（Thermus scotoductus）[41]，GP10高地芽孢桿菌（Bacillus altitudinis）[58]，GP12為東京芽孢桿菌（Bacillus toyonensis）[59]。

2.4.8 生產(chǎn)用水中的主要細菌

從生產(chǎn)用水中分離3株菌，分別為類芽孢桿菌（Paenibacillussp）[60]，離中不粘柄菌（Asticcacaulis excentricus）[61]，沃氏葡萄球菌（Staphylococcus warneri）[62]。

表9 生產(chǎn)所用香料中主要細菌的鑒定 Table 9 Identification of main bacteria of fragrances used in production

表10 生產(chǎn)所用桂皮中主要細菌的鑒定 Table 10 Identification of main bacteria of cinnamon used in production

表11 生產(chǎn)用水主要細菌的鑒定 Table 11 Identification of main bacteria in production water

表12 腐敗冷吃兔中細菌鑒定結(jié)果 Table 12 Bacteria identification results in spoilage Leng-Chi rabbits

2.4.9 腐敗冷吃兔中的細菌

從腐敗終點樣品（25 ℃貯藏至產(chǎn)生氣泡、脹袋）共篩選16株菌，分屬于3個屬，11株（FB-1、FB-2、FB-4、FB-6、FB-7、FB-8、FB-9、FB-12、FB-14、FB-15、FB-16）表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）[63]、1株（FB-5）地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）[64]、1株（FB-3）Rummeliibacillus stabekisii[65]、2株（FB-10、FB-11）Bacillus paralicheniformis[66]、1株（FB-13）蔬菜芽孢桿菌（Bacillus oleronius）[67]。

2.5 腐敗細菌與原輔料細菌同源性分析

將從腐敗冷吃兔篩選得到的16株腐敗菌和原輔料中細菌進行多序列比對，采用NJ法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，去除低置信度分支。根據(jù)圖2可知，從腐敗樣品中分離的芽孢桿菌屬細菌Bacillus licheniformis、Bacillus paralicheniformis分別與芝麻（在炒制結(jié)束時加入，未達到完全滅菌狀態(tài)）中的細菌Bacillus licheniformis、山奈中的細菌Bacillus licheniformis處于一個分支，且具有較高同源性，說明了真空包裝自貢冷吃兔芽孢桿菌屬細菌的污染極有可能來源于輔料芝麻和山奈。芝麻含有大量的脂肪和蛋白質(zhì)，追溯生產(chǎn)工藝發(fā)現(xiàn)芝麻是先經(jīng)行炒熟再在自貢冷吃兔炒制末尾時加入，而此時炒制溫度逐漸降低，存在潛在污染風險；山奈具有藥食兩用的特點，含有豐富的活性物質(zhì)，需放置干燥通風處，在工廠生產(chǎn)時可能由于儲存不當而導致污染。腐敗樣品中葡萄球菌屬細菌與生產(chǎn)用水中Staphylococcus warneri同源性高，表明生產(chǎn)用水是冷吃兔產(chǎn)品葡萄球菌屬細菌重要的污染來源，通過分析發(fā)現(xiàn)是由于生產(chǎn)廠家對生產(chǎn)用水進行了儲存，在儲存期間導致生產(chǎn)用水受到沃氏葡萄球菌污染。冷吃兔產(chǎn)品經(jīng)100 ℃殺菌處理25 min以后，其貯藏期能達到10周，而Bacillus licheniformis耐熱性極強，其生長不受處理時間和溫度影響[68]；Bacillus paralicheniformis在高溫處理后，依然有良好的耐受性，存活率均在60%以上[69]；Staphylococcus warneri耐熱性強，巴氏殺菌條件下不易殺死[70]。

圖2 腐敗細菌與原輔料細菌同源性系統(tǒng)發(fā)育樹 Fig.2 Phylogenetic tree of homology between spoilage bacteria and raw material bacteria

在生產(chǎn)工藝中，選擇帶菌量少的原輔料不僅可以從源頭降低微生物污染，還可以有效防止交叉污染；對原輔料進行清洗、焯水時，應選擇純凈水，減少水源二次污染；通過腌制、炒制、滅菌可將原輔料中大部分細菌殺滅，但少量細菌耐受性較強，仍會導致自貢冷吃兔產(chǎn)品保質(zhì)期不長，可針對性的對部分輔料進行滅菌后再使用。

3 結(jié)論

3.1 通過對自貢冷吃兔生產(chǎn)所需的原料兔肉及主要輔料：辣椒、花椒、八角、芝麻、孜然、山奈、香料、桂皮、生產(chǎn)用水的細菌數(shù)量進行測定，采用傳統(tǒng)培養(yǎng)法結(jié)合16S rDNA測序?qū)ζ渲泻械闹饕哼M行鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)自貢冷吃兔生產(chǎn)所用的原料肉、辣椒、孜然、香料含菌量高，其中原料肉細菌總數(shù)對數(shù)值高達7 CFU/g以上，辣椒、孜然、香料細菌總數(shù)對數(shù)值位于4～5 CFU/g，是自貢冷吃兔產(chǎn)品潛在的細菌污染源；花椒、八角、芝麻和桂皮清潔度較高，符合GMP規(guī)定原輔料要求；生產(chǎn)用水菌落總數(shù)超標，不符合企業(yè)衛(wèi)生標準。從自貢冷吃兔生產(chǎn)所用原輔料中共分離76株菌，分布于20個屬，其中芽孢桿菌屬在輔料中普遍存在，從山奈中分離鑒定的6株菌全屬于芽孢桿菌屬。根據(jù)不同原輔料菌落總數(shù)從大到小為：兔肉＞孜然＞辣椒＞香料＞生產(chǎn)用水＞山奈＞八角＞桂皮＞花椒＞芝麻；屬水平數(shù)量排序為：原料肉＞辣椒、孜然＞香料、生產(chǎn)用水＞花椒、八角、芝麻、桂皮＞山奈；種水平數(shù)量排序為：原料肉、香料、桂皮＞辣椒＞八角＞山奈、花椒＞芝麻、孜然、生產(chǎn)用水。通過同源性分析，確定腐敗樣品中芽孢桿菌屬細菌來源于芝麻、山奈，葡萄球菌屬細菌來源于生產(chǎn)用水，原料兔肉是乳桿菌屬的主要污染源。

3.2 本研究豐富了自貢冷吃兔原輔料中細菌數(shù)據(jù)庫，為自貢冷吃兔微生物控制提供了理論支撐，同時也為川菜工業(yè)化產(chǎn)品腐敗菌多樣性研究提供參考。下一步研究，可根據(jù)潛在細菌污染源，在實際生產(chǎn)中制定合理有效的消殺措施，從源頭與過程把控產(chǎn)品初始菌數(shù)量與種類；針對優(yōu)勢腐敗菌，探討合理高效的防腐保鮮技術，提高產(chǎn)品貨架期。