楊玲雙，謝新強，李瀅，張菊梅，丁郁，吳清平*，王涓

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州 510642）（2.廣東省科學(xué)院微生物研究所，廣東省微生物安全與健康重點實驗室，華南應(yīng)用微生物國家重點實驗室，廣東廣州 510075）

甘氨酸或?；撬峤Y(jié)合膽汁酸被稱為膽鹽[1]，是哺乳動物消化脂質(zhì)所必需的。膽鹽水解酶（bile salt hydrolase，BSH），也稱為結(jié)合BSH（conjugated bile salt hydrolase，CBSH）、結(jié)合膽汁酸水解酶（conjugated bile acid hydrolase，CBAH）和膽酰甘氨酸水解酶（cholylglycine hydrolase，CGH），屬于N端親核水解酶家族[2]，是一種催化甘氨酸/牛磺酸結(jié)合膽汁酸水解為去結(jié)合膽汁酸和氨基酸殘基的酶[3]。BSH主要來源于梭菌（Clostridium）、擬桿菌（Bacteroides）、乳桿菌（Lactobacillus）、李斯特菌（Listeria）、腸球菌（Enterococcus）、雙歧桿菌（Bifidobacterium）等[4]。具有BSH活性的微生物能耐受膽汁、在胃腸道定殖、維持宿主代謝和能量獲取的能力[5]。BSH酶能將結(jié)合膽鹽水解成去結(jié)合形式和釋放游離氨基酸，而去結(jié)合膽鹽的可溶性較差，不被腸細(xì)胞吸收而隨糞便排出體外；另一方面則是促進(jìn)膽汁酸合成，因膽固醇為膽汁酸的前體，故能降低血清膽固醇[6]。益生菌對膽鹽的水解能力經(jīng)常被列入益生菌菌株篩選的標(biāo)準(zhǔn)之一，但不同微生物的BSHs具有不同的蛋白結(jié)構(gòu)和底物特異性，潛在BSH抑制劑的鑒定依賴于BSH的晶體結(jié)構(gòu)的可用性[7,8]。不同種屬之間BSH的亞基組成、大小、最適溫度、pH均存在差異性，但BSH有6個嚴(yán)格的保守催化位點，其中Cys2埋藏在所有Ntn酶保守的αββα核心中形成活性位點，另外還有5個重要的催化殘基（Arg18、Asp21、Asn82、Asn175、Arg228）[9]。乳桿菌和雙歧桿菌作為有益微生物的代表，其BSH酶被廣泛研究，比如植物乳桿菌WCFS1發(fā)現(xiàn)有4個bsh基因[10]，約氏乳桿菌PF01發(fā)現(xiàn)3個bsh基因[11]，嗜酸乳桿菌NCFM發(fā)現(xiàn)2個bsh基因，且均顯示不同的底物特異性[12]。在唾液乳桿菌JCM1046和UCC118中也發(fā)現(xiàn)了2個bsh基因，其中第二個基因在分類水平上被重新編碼為青霉素V?；福≒VA）[13]。屎腸球菌廣泛存在禽類腸道中，是腸道中重要的菌類，因其能產(chǎn)生乳酸，故歸屬于乳酸菌。近年來，益生屎腸球菌越來越受到關(guān)注，益生腸球菌對維持平衡起到關(guān)鍵作用，近年來廣泛應(yīng)用在幼齡動物的腸道保健和疾病防疫上[14]。屎腸球菌還能產(chǎn)生抗菌肽，抑制致病菌的生長，在食品中添加能延長食品保質(zhì)期等功能，但對其BSH研究相對較少。本團(tuán)隊前期對屎腸球菌132全基因組序列注釋結(jié)果發(fā)現(xiàn)，屎腸球菌132含有膽酰甘氨酸水解酶（EC 3.5.1.24）基因。并且在體內(nèi)能降低SD大鼠體重、血清膽固醇、甘油三酯、緩解肝損傷[15]。有綜述報道抑制腸道BSH活性會增加脂質(zhì)代謝和獲取能量，從而提高飼料動物的生長性能和飼料效率[16]，故對BSH研究具有重要意義。本研究對屎腸球菌132bsh基因進(jìn)行異源表達(dá)純化，探究不同底物、pH、以及溫度對酶活力的影響，為進(jìn)一步研究屎腸球菌相關(guān)膽鹽水解酶以及潛在降膽固醇機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

屎腸球菌132（Enterococcus faeciumstrain 132）、大腸桿菌ATCC 8739（Escherichia coliATCC 8739）、pET-28a (+)質(zhì)粒由廣東省微生物研究所微生物安全與健康發(fā)展中心團(tuán)隊保藏提供。DH5α、BL21大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞購自生工生物工程（上海）有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS（de Man，Rogosa and Sharpe）固體和液體培養(yǎng)基、LB（Luria-Bertani）固體和液體培養(yǎng)基，購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；

發(fā)酵培養(yǎng)基：35 g/L胰蛋白胨、20 g/L酵母粉、5 g/L NaCl。

1.1.3 主要生化試劑

甘氨酸、?；撬帷⒏拾蹦懰徕c（GCA）、甘氨脫氧膽酸鈉（GDCA）、甘氨鵝脫氧膽酸鈉（GCDCA）、?；悄懰徕c（TCA）、?；敲撗跄懰徕c（TDCA）、?；蛆Z脫氧膽酸鈉（TCDCA）、DMSO、β-巰基乙醇，上海麥克林生物科技有限公司；CaCO3、檸檬酸三鈉、EDTA（Ethylene Diamine Tetraacetic Acid），咪唑，廣州化學(xué)試劑廠；茚三酮顯色液，上海羅恩試劑；DL2000 DNA Marker，廣州東盛生物有限公司；Nhe Ⅰ、Xho Ⅰ限制性內(nèi)切酶、Pushion master mix、T4DNA Ligase、cut@smart buffer，美國NEB公司；PCR產(chǎn)物純化試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒，美國omega公司；SDS-PAGE上樣緩沖液、標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker，上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

裂解液（g/L）：NaCl 5.60 g、NaH2PO40.63 g、咪唑4.76 g，pH 7.60～7.80。

洗脫液（g/L）：NaCl 8.40 g、NaH2PO42.18 g、咪唑13.60 g，pH 7.20。

交換液（g/L）：NaCl 5.60 g、NaH2PO42.18 g、pH 7.20。

1.2 儀器與設(shè)備

WBK-4B型電熱恒溫水浴鍋，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；Seven CompactTMS210型數(shù)字pH計，美國Mettler Toledo公司；Microfuge?16臺式冷凍離心機，美國Beckman Coulter公司；EPOCH2酶標(biāo)儀，美國Biotek公司；C150凝膠成像系統(tǒng)，美國Azure Biosystems公司；Biometra DNA擴增循環(huán)儀，德國Biometra公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 膽鹽水解酶活力分析

MRS固體培養(yǎng)基中加0.20%?；敲撗跄懰徕c、0.37 g/L CaCl2，121 ℃滅菌20 min，倒平板晾干。再將無菌濾紙片均勻放入平板上，每個濾紙片均勻滴加10 μL菌液，37 ℃厭氧培養(yǎng)72 h。觀察濾紙周圍有無沉淀圈出現(xiàn)[17]。若平板中出現(xiàn)沉淀圈，說明菌株可能具有潛在膽鹽水解酶活性。

菌體膽鹽水解酶的定量分析[18]：將屎腸球菌132接種于MRS肉湯中，大腸桿菌ATCC 8739接種于LB肉湯中37 ℃培養(yǎng)18 h，培養(yǎng)液經(jīng)8000 ×g離心5 min后收集菌體，用無菌的PBS緩沖液洗滌兩遍后將菌體重懸于PBS緩沖液中。取1 mL菌懸液，加1 μL 1 mol/L維生素C進(jìn)行破碎（30%功率，6 s停4 s，100 min），13000 ×g離心3 min收集上清，即為粗酶液。利用改良Bradford蛋白濃度試劑盒測定粗酶液蛋白濃度，并繪制蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。粗酶液對甘膽酸鈉解離體系如表1所示。

表1中溶液溫和渦旋混勻后于37 ℃孵育30 min，置于高溫使酶失活，于16000 ×g離心10 min，吸取250 μL茚三酮顯色液加入750 μL上清中，同時配制標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品濃度（0、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mmol/L）；將樣品、對照、空白1、空白2、標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品于顯色液振蕩混勻，沸水浴15 min，冰浴3 min，靜置5 min后于OD570處測吸光度。實際吸光度值=樣品吸光度值-空白1吸光度值-空白2吸光度值。

表1 膽鹽水解酶酶促反應(yīng) Table 1 Bile salt hydrolysase enzymatic reaction

BSH總酶活定義為：單位時間內(nèi)、單位體積的酶液使結(jié)合型膽鹽水解產(chǎn)生氨基酸的微摩爾數(shù)，單位μmol/(min·mL)；1U=μmol/min。

BSH比酶活定義為：單位時間內(nèi)、單位質(zhì)量的總蛋白中的酶液使結(jié)合型膽鹽水解產(chǎn)生氨基酸的微摩爾數(shù)，單位μmol/(min·mg)。

1.3.2 DNA的提取和引物設(shè)計

利用團(tuán)隊前期全基因組測序信息中找到相關(guān)bsh基因（GenBank登錄號：MZ031135），總片段長度為975 bp，以NheⅠ和XhoⅠ為雙酶切位點，引物為BSHf：5’-AAAAAAGCTAGCATGTGTACGTCTATTA CTTATGTAAC-3’，和BSHr：5’-GTGGTGCTCGAGC TAATTTATATATTTAATTTGTTG-3’，引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。將培養(yǎng)好的菌體，按照廣州美基生物技術(shù)有限公司細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒方法，提取基因組DNA。

1.3.3 目的基因的克隆、表達(dá)載體的構(gòu)建

利用上述基因組DNA和引物進(jìn)行PCR擴增，擴增體系（50 μL）：上下游引物各2.5 μL（10 μmol/L）、DMSO 1.5 μL、Pushion master mix 25 μL、模板DNA 1 μL、滅菌超純水補足50 μL。反應(yīng)條件：98 ℃預(yù)變性30 s；98 ℃ 10 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 40 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳中進(jìn)行驗證。利用美國omaga公司產(chǎn)物純化試劑盒（D6492-03）進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化，選取pET-28a (+)質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，酶切體系（50 μL）：Nhe Ⅰ2 μL、Xho Ⅰ2 μL、cut@smart buffer 5 μL、pET-28a (+)質(zhì)粒/PCR產(chǎn)物25 μL，滅菌超純水補足50 μL，酶切2 h后對酶切PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，利用Omega公司膠回收試劑盒（D2500-02）對酶切質(zhì)粒進(jìn)行膠回收。利用T4連接酶對酶切PCR產(chǎn)物和回收質(zhì)粒進(jìn)行酶連反應(yīng)，16 ℃過夜連接并導(dǎo)入DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，利用抗性基因（卡那霉素）平板篩選進(jìn)行菌落PCR、雙酶切驗證，提取質(zhì)粒送至蘇州金唯智生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序，利用DNAMAN 9軟件進(jìn)行同源比對，確定插入序列是否正確，命名正確的質(zhì)粒為pET-28a-BSH。最后將提取得到的正確質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞用于異源表達(dá)。

圖1 重組質(zhì)粒構(gòu)建示意圖 Fig.1 Schematic diagram of recombinant plasmid construction

1.3.4 BSH的異源表達(dá)和純化

將含有pET-28a-BSH的大腸桿菌BL21接種于含卡那霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min，培養(yǎng)4 h后調(diào)整溫度為18 ℃，加終濃度至0.4 mmol/L IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)48 h后，10000 ×g，離心20 min，收集菌體重懸于含0.1%溶菌酶裂解液中，放-80 ℃中備用。

將菌體進(jìn)行冰浴超聲破碎（30%功率，6 s停4 s，30 min），4 ℃離心取上清，過0.8 μm濾膜即得到粗酶液。粗酶液過HisTrap Fast Flow鎳柱[19]（Cyctiva廠家，美國丹納赫集團(tuán)），用裂解液洗脫雜質(zhì)蛋白，再利用洗脫液洗脫目的蛋白，30 ku超濾管濃縮目的蛋白，交換液重懸和離心除去咪唑，用蛋白濃度測定試劑盒進(jìn)行蛋白定量，純化蛋白中加20%甘油，保存于-80 ℃冰箱，備用。

1.3.5 BSH酶的底物特異性分析

反應(yīng)體系：20 μL酶液、0.5 μL 1 mol/L維生素C溶液、100 μL pH=6、6 mmol/L膽酸鹽、80 μL的雙蒸水，輕輕充分混勻后置于37 ℃恒溫水浴鍋中孵育30 min，反應(yīng)結(jié)束后置于高溫使酶失活，于16000×g離心10 min，上清加入60 μL茚三酮顯色液，迅速置于沸水浴中反應(yīng)15 min，冰浴3 min，靜置5 min后于570 nm處測吸光度，以不加酶液為對照。樣品實際吸光度值=吸光度值-對照吸光度值。根據(jù)甘氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線計算生成的氨基酸的量，計算比酶活，以最高酶活力為100%，計算相對酶活，重復(fù)三次實驗。

膽酸鹽分別為6 mmol/L GCA、6 mmol/L GDCA、6 mmol/L GCDCA、6 mmol/L TCA、6 mmol/L TDCA、6 mmol/L TCDCA。

1.3.6 BSH的最適pH和pH穩(wěn)定性

以6 mmol/L GCA為底物，將反應(yīng)體系（詳見1.3.5）分別置于不同pH（3.0、4.0、5.0、5.5、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0）下反應(yīng)按1.3.5方法計算相對酶活。

以6 mmol/L GCA為底物，將不加底物的反應(yīng)體系分別置于不同pH（3.0、4.0、5.0、5.5、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0）下孵育1 h，置于1.3.5方法進(jìn)行反應(yīng)并計算相對酶活。

1.3.7 BSH的最適溫度和熱穩(wěn)定性

6 mmol/L GCA為底物，將反應(yīng)體系（詳見1.3.5）分別置于不同溫度（4、20、30、40、50、60、70 ℃）下反應(yīng)，按1.3.5方法計算相對酶活。

6 mmol/L GCA為底物，將不加底物的反應(yīng)體系分別置于不同溫度（4、20、30、40、50、60、70 ℃）下孵育1 h，置于1.3.5方法進(jìn)行反應(yīng)并計算相對酶活。

1.3.8 不同金屬離子對BSH活力的影響

6 mmol/L GCA為底物，反應(yīng)體系（詳見1.3.5）中分別加入終濃度為5 mmol/L不同金屬離子（NaCl、CaCl2、MgSO4、MnCl2·4H2O、FeSO4·7H2O、LiCO3、Al2(SO4)3·8H2O、NiSO4·6H2O、CoSO4·7H2O、ZnSO4），測定相對酶活，以未加金屬離子的比酶活為100%。

1.3.9 BSH反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)的測定

將不同濃度（2、4、6、8、10、20 mmol/L）的GCA加入1.3.5反應(yīng)體系中反應(yīng)30 min，按1.3.5方法計算相對酶活。利用GraphPad Prism 8.4.3軟件，根據(jù)米氏方程（Michaelis-Menten）擬合數(shù)據(jù)，并計算BSH最大反應(yīng)速率（Vmax），米氏常數(shù)（Km）值。

1.3.10 數(shù)據(jù)處理

結(jié)果以實驗的均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，每次實驗3次重復(fù)。采用Microsoft Excel 365軟件計算平均值和SD值，Graph Pad 8.4.3進(jìn)行繪圖。利用在線軟件Swiss Model對BSH的3-D結(jié)構(gòu)進(jìn)行了同源模擬。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌體破碎液膽鹽水解酶活力的測定

屎腸球菌132在含?；敲撗跄懰徕cMRS平板上具有明顯的沉淀圈（圖2），推測屎腸球菌132可能具有膽鹽水解酶活性。經(jīng)膽鹽水解酶定量分析結(jié)果表明，屎腸球菌132總酶活為0.20 U/mL，比酶活為0.55 U/mg。先前有研究報道，張芬[20]利用茚三酮法，以GDCA為底物，測定10株腸球菌的比酶活在0.11～1.86 U/mg，本研究屎腸球菌132比酶活力處于中等水平。

圖2 屎腸球菌132膽鹽水解酶定性分析 Fig.2 Qualitative analysis of bile salt hydrolyase in E. faecium strain 132

2.2 表達(dá)載體的構(gòu)建和BSH的純化

目的基因經(jīng)過克隆、重組質(zhì)粒到質(zhì)粒導(dǎo)入BL21感受態(tài)細(xì)胞后進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，利用超聲破碎菌體收集上清并過鎳柱純化。如圖3a所示，在1000 bp左右，出現(xiàn)一條清晰的目的條帶，表明BSH克隆成功；純化蛋白經(jīng)SDS-PAGE蛋白凝膠實驗得到一條清晰明亮的條帶（圖3b），條帶大小約為37 ku，為常見BSH蛋白條帶，說明BSH蛋白被成功表達(dá)并純化。有研究報道屎腸球菌包含兩個bsh基因，且這兩個基因長度均為975 bp，條帶大小在37 ku左右[20]，而本研究bsh基因，條帶大小與之一致。

圖3 純化的BSH蛋白SDS-PAGE Fig.3 Purified SDS-PAGE of purified recombinant BSH protein

2.3 BSH的底物特異性

為探究BSH的底物特異性，利用茚三酮顯色法對6種結(jié)合膽鹽進(jìn)行底物特異性分析。結(jié)果如圖4所示，pH=6對GCA解離中酶活達(dá)4.93 U/mg，相比于粗酶液，酶活力增加了近10倍（每次比酶活/粗酶液比酶活）。BSH對GCA、TCA均較高的酶活力，對GDCA、GCDCA、TDCA的相對酶活能達(dá)到80%，TCDCA特異性最差，達(dá)60%。不同種屬酶的活性位點、底物特異性稍有差異。有研究報道，屎腸球菌WEFA23對GDCA水解能力較強[20]，與本研究結(jié)果較為一致，對甘氨膽酸類水解能力較強。而另一個研究則報道屎腸球菌NW2對TDCA水解最強，但對GCA的水解也能達(dá)到82%[21]，而本研究對這兩種結(jié)合膽酸的水解均都大于80%，與之結(jié)果較為類似。BSH的底物特異性也可能歸因于酰胺鍵附近的空間位阻，隨著酰胺鍵附近空間位阻的增加，膽鹽水解速率降低[22]。BSH對底物特異性有所差異，對甘氨結(jié)合膽酸活性最高，故選取GCA為底物進(jìn)行酶學(xué)特性研究。

圖4 BSH的底物特異性 Fig.4 Substrate specificity of recombinant BSH

2.4 BSH最適pH及pH穩(wěn)定性

在不同pH條件下反應(yīng)并測定BSH的相對酶活，結(jié)果如圖5a所示，在pH=5.50時達(dá)到最高比酶活，達(dá)6.59 U/mg，與文獻(xiàn)報道的屎腸球菌NW2中BSH2最適pH相一致[21]；當(dāng)pH=5時，BSH相對酶活下降至80%；pH＞7時酶活開始急劇下降；pH=10時下降至20%；pH＜4時BSH酶活幾乎喪失。BSH適應(yīng)pH范圍較廣，在pH=5～10均有一定的活性。當(dāng)酶經(jīng)1 h的不同pH緩沖液孵育后，pH＜4時BSH酶活幾乎喪失，與乳桿菌屬100-100菌株來源的BSH（pH 3.80～4.50）差別較大[23]，說明其穩(wěn)定性較差；在pH為5～7時，酶穩(wěn)定性較好，與長雙歧桿菌SBT2928來源的BSH（pH 5～7）較為一致[24]；pH＞7時酶活開始急劇下降；pH=10時下降至20%，穩(wěn)定性開始下降，可能由于結(jié)構(gòu)遭到破壞造成穩(wěn)定性差，表明該酶對高酸堿均不耐受。任婧[25]在綜述中提到，甘氨類膽鹽在酸性條件下有非常強的毒性，此時BSH則優(yōu)先水解甘氨類膽鹽，因其大部分研究BSH的最適條件都是以甘氨類膽鹽為底物，故會得出BSH傾向微酸性條件（pH=5～6）。

圖5 BSH最適pH及pH穩(wěn)定性 Fig.5 The optimal pH and the pH stability of BSH

2.5 BSH最適溫度及熱穩(wěn)定性

測定不同溫度條件下BSH的相對酶活，結(jié)果如圖6a所示，在30 ℃表現(xiàn)出最高酶活力，與屎腸球菌NW2中BSH2相一致[21]，當(dāng)溫度在4～60 ℃范圍時均有較高的酶活力，4～60 ℃酶活力均大于60%；當(dāng)溫度高于60 ℃時，酶活力迅速下降，當(dāng)溫度達(dá)70 ℃時，相對酶活下降至20%。故BSH在4～60 ℃均有較高酶活。將酶置于不同溫度下孵育1 h，再按1.3.5體系進(jìn)行反應(yīng)并測定相對酶活。從圖6b可以看出，當(dāng)溫度4～30 ℃范圍時，相對酶活達(dá)80%，這與雙歧桿菌來源的重組BSH熱穩(wěn)定性較為一致[19]；而當(dāng)溫度＞40 ℃時，酶活急劇下降至20%，熱穩(wěn)定性較差。與植物乳桿菌[26]BSH相比，本研究的BSH耐受pH和熱穩(wěn)定性范圍較窄，這可能是由于不同來源和結(jié)構(gòu)所導(dǎo)致。結(jié)果表明BSH不耐受高溫，為常溫酶。

圖6 BSH最適溫度及熱穩(wěn)定性 Fig.6 The optimal temperature and thermal stability for BSH

2.6 不同金屬離子對BSH活力的影響

不同的金屬離子往往對酶會產(chǎn)生激活或者抑制作用，通常作為酶的激活劑或者抑制劑，故本研究在酶反應(yīng)體系中加入不同金屬離子，探究其對酶的競爭或者抑制作用。結(jié)果如表2所示，Na+、Ca2+、Mg2+均對酶活有激活作用，為該酶的激活劑；Mn2+、Fe2+對酶活影響不大；但Ni2+、Al3+、Li2+、Co2+、Zn2+均對酶活有強抑制作用，酶活幾乎喪失，為該酶抑制劑。趙瑞香[27]等研究嗜酸乳桿菌BSH對Mn2+、Fe2+、Ca2+、Mg2+對BSH活性有促進(jìn)作用，周羅雄等[21]研究屎腸球菌NW2BSH活力時發(fā)現(xiàn)Co2+抑制BSH活性，與本研究均具有較好的一致性。這可能是因為不同離子對酶結(jié)構(gòu)存在破壞作用，影響穩(wěn)定性。

表2 不同金屬離子對BSH活力的影響 Table 2 The effect of different metal ions on the activity of recombinant BSH

2.7 BSH反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)的測定

以GCA為底物，測定BSH反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)。Km值是底物親和常數(shù)，Vmax為酶促反應(yīng)最大反應(yīng)速率，利用米氏方程擬合曲線。結(jié)果如圖7所示，米氏曲線呈S型，酶與底物在催化反應(yīng)時表現(xiàn)出不同的協(xié)同作用。根據(jù)擬合曲線算出Km值為3.16 mmol/L，Vmax為6.44 μmol/(min·mg)。與報道的干酪乳桿菌[28]（Km值=4.57 mmol/L）相近，而與脆弱擬桿菌[29]（Km值=0.35 mmol/L）有明顯差別，不同菌株BSH的Km值差異較大，可能由于不同底物、不同來源菌株或者不同BSH結(jié)構(gòu)所造成，這一現(xiàn)象為揭示酶與底物的作用機理和酶的空間結(jié)構(gòu)關(guān)系提供參考。

圖7 BSH反應(yīng)動力學(xué) Fig.7 Kinetics of recombinant BSH reaction

2.8 BSH 3-D結(jié)構(gòu)同源模擬

利用在線軟件Swiss Model對BSH的3-D結(jié)構(gòu)進(jìn)行了同源模擬，結(jié)果如圖8所示，該酶有324個氨基酸殘基組成，與來源于糞腸球菌膽鹽水解酶Cys2Ala突變體晶體同源性最高，達(dá)82.04%。用計算絕對模型質(zhì)量的函數(shù)QMEAN評估模擬得到的模型的可靠性[30]。QMEAN范圍為0～1，得到的值越大，說明模型越可靠，該模型QMEAN值為0.77、全球模型質(zhì)量評估（Global model quality estimate，GMQE）值為0.94，說明模擬的BSH的3-D結(jié)構(gòu)是較為可靠的。

圖8 BSH 3-D結(jié)構(gòu)同源模擬結(jié)構(gòu)模型 Fig.8 Three-dimensional homology simulation of recombinant BSH structure model

3 結(jié)論

基于本研究前期發(fā)現(xiàn)屎腸球菌132具有降膽固醇功能且改善大鼠相關(guān)脂質(zhì)代謝，通過全基因組測序發(fā)現(xiàn)其含有一個bsh基因，首先確定其細(xì)胞破碎液具有膽鹽水解酶活力，并且構(gòu)建了bsh基因表達(dá)載體。通過在大腸桿菌BL21中表達(dá)并純化得到BSH，對其進(jìn)行酶學(xué)特性研究。研究結(jié)果表明，BSH偏好水解甘氨酸類膽酸鹽，但是對?；撬犷惸懰猁}水解也能達(dá)60%～90%；當(dāng)以GCA為底物、pH=5.50、溫度為30 ℃時達(dá)最適反應(yīng)條件，BSH在偏酸中性中能保持較高的酶活但是該酶熱穩(wěn)定性較差；不同金屬離子對酶活有不同影響，且該酶反應(yīng)動力學(xué)得出該酶的Vmax為6.44 μmol/(min·mg)，Km值為3.16 mmol/L。本研究主要探討屎腸球菌132體外BSH活性，通過構(gòu)建BSH表達(dá)載體，探究pH、溫度、不同金屬離子對該酶酶活的影響，后續(xù)可進(jìn)一步研究BSH空間結(jié)構(gòu)和潛在活性位點的關(guān)系，或選用食品級乳酸菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)bsh基因，為在飼料和食品行業(yè)中應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。