吉思璇， 吳 迪， 白曼莫

動(dòng)脈瘤性蛛網(wǎng)膜下腔出血（aneurysmal subarachnoid hemorrhage，aSAH） 是顱內(nèi)動(dòng)脈瘤破裂引發(fā)的一種腦出血性疾病，致殘率和致死率均較高［1-2］。 據(jù)報(bào)道，aSAH 患者接受及時(shí)治療后1 年內(nèi)病死率高達(dá)50%，遠(yuǎn)期病死率仍高達(dá)10%～24%［3-5］。 探究可評(píng)估aSAH 預(yù)后的指標(biāo)有著重要意義， 可輔助臨床治療方案的制定。 瞬時(shí)受體電位通道M2（transient receptor potential melastatin 2，TRPM2） 是瞬時(shí)受體電位蛋白超家族中一員，作為一種重要的離子通道介導(dǎo)多種細(xì)胞反應(yīng)，如通過(guò)其鈣離子可調(diào)節(jié)過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，還會(huì)促進(jìn)單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌趨化因子，加劇炎癥反應(yīng)［6］。Pan 等［7］研究表明，干擾TRPM2 表達(dá)可降低氧化應(yīng)激損傷、 細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度及核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白（NLRP）3 炎性小體激活，從而抑制葡萄糖剝奪誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞凋亡。 基于上述研究， 有理由認(rèn)為T(mén)RPM2 參與了aSAH 進(jìn)展過(guò)程，是其預(yù)后評(píng)估的潛在生物標(biāo)志物。 目前鮮有研究分析TRPM2 與aSAH預(yù)后的關(guān)系， 本研究選取接受介入治療的aSAH 患者作為研究對(duì)象， 分析TRPM2 與aSAH 預(yù)后的關(guān)系，以期為aSAH 預(yù)后評(píng)估提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2019 年8 月至2021 年5 月在三亞市中醫(yī)院參照《中國(guó)蛛網(wǎng)膜下腔出血診治指南2019》［8］、經(jīng)血管造影確診并接受介入治療的aSAH 患者作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：①首次發(fā)病，且在發(fā)病12 h 內(nèi)接受支架聯(lián)合彈簧圈動(dòng)脈瘤栓塞術(shù)治療； ②年齡≤70 歲；③隨訪資料完整；④簽署手術(shù)知情同意書(shū)。 排除標(biāo)準(zhǔn)：①非動(dòng)脈瘤破裂誘發(fā)的腦出血；②有冠心病史、腦卒中史、神經(jīng)退行性疾病史、下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥史或惡性腫瘤史等；③心肝腎功能異常；④生命體征不穩(wěn)定； ⑤國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比值＞1.4 或血小板計(jì)數(shù)＜100×109/L。 本研究符合《赫爾辛基宣言》，已獲醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2021-006）。

1.2 介入治療

手術(shù)在全身麻醉下進(jìn)行，采用Seldinger 技術(shù)穿刺股動(dòng)脈，置入6 F 導(dǎo)管，全身肝素化， DSA 造影測(cè)量動(dòng)脈瘤大小，選擇適宜支架；將支架導(dǎo)管置入距動(dòng)脈瘤遠(yuǎn)端1 cm 處，Echolon 導(dǎo)管送至動(dòng)脈瘤體1/2 處，釋放彈簧圈，同時(shí)半釋放支架覆蓋動(dòng)脈瘤頸至彈簧圈填塞致密后退出導(dǎo)管， 完全釋放支架［9］；即刻造影確定栓塞程度、支架位置等。 若術(shù)中出現(xiàn)腦血管痙攣給予靜脈注射用鹽酸罌粟堿（30～120 mg/次，山東北大高科華泰制藥公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20052331）處理。

1.3 外周血中單個(gè)核細(xì)胞提取

用Ficoll 密度梯度離心法分離外周血中單個(gè)核細(xì)胞，操作如下：分別于介入治療前和治療24 h內(nèi)抽取aSAH 患者空腹肘部靜脈血10 mL，用磷酸鹽緩沖溶液進(jìn)行稀釋?zhuān)⑾♂屢旱稳隖icoll 分離液中，4℃2 000 r/min 離心20 min，吸取單個(gè)核細(xì)胞層細(xì)胞； 再次用磷酸鹽緩沖溶液稀釋細(xì)胞，4℃1 500 r/min 離心10 min，吸取細(xì)胞，重復(fù)該操作2 次［10］。

1.4 TRPM2 水平檢測(cè)

用蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)TRPM2 水平， 操作如下：用含放射免疫沉淀試驗(yàn)（RIPA）溶液裂解細(xì)胞，離心后提取蛋白，二辛可酸（BCA）試劑盒定量；凝膠電泳（電壓80～120 V）至溴酚藍(lán)跑出膠面，漂洗、 轉(zhuǎn)膜后用脫脂奶粉室溫封閉2 h； 一抗兔抗人TRPM2 多克隆抗體和兔抗人3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）多克隆抗體（武漢益普生物科技公司）4℃孵育過(guò)夜，二抗山羊抗兔IgG 多克隆抗體（武漢菲恩生物科技公司）室溫孵育2 h；電化學(xué)發(fā)光（ECL）液顯影，Image J 1.8.0 軟件讀取蛋白質(zhì)免疫印跡圖像［11］。計(jì)算TRPM2 相對(duì)內(nèi)參GAPDH 的表達(dá)水平。

1.5 預(yù)后隨訪和評(píng)價(jià)

采用門(mén)診和電話方式隨訪，評(píng)估aSAH 患者治療90 d 后改良Rankin 量表（mRS）評(píng)分。 本研究隨訪截止時(shí)間為2021 年9 月5 日。 mRS 評(píng)分≤2 分為預(yù)后良好，＞2 分為預(yù)后不良［12］。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用4.1.0 版R 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)， 組內(nèi)治療前后比較用配對(duì)樣本t 檢驗(yàn)；非正態(tài)分布的計(jì)量資料以M（P25，P75）表示，兩組間比較用Mann-Whitney U 檢驗(yàn)。 計(jì)數(shù)資料用例和率（%）表示，組間比較用χ2檢驗(yàn)。 采用受試者工作特征曲線 （receiver operating characteristic curve，ROC）評(píng)價(jià)TRPM2 判斷aSAH 預(yù)后的價(jià)值，logisti回歸分析影響aSAH 預(yù)后的因素。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

符合納入標(biāo)準(zhǔn)的aSAH 患者共165 例， 術(shù)后獲隨訪148 例，隨訪率為89.7%。 148 例中男57 例，女91 例； 年齡范圍40～64 歲， 中位年齡46（45，49）歲；體質(zhì)量指數(shù)（BMI）為（25.45±2.36） kg/m2；有高血壓史71 例，高脂血癥史55 例，糖尿病史33 例；動(dòng)脈瘤位于前循環(huán)67 例，后循環(huán)34 例，前后循環(huán)47例；Hunt-Hess 分級(jí)Ⅰ、 Ⅱ級(jí)86 例， Ⅲ級(jí)62 例；Fisher 分級(jí)Ⅰ、Ⅱ級(jí)139 例，Ⅲ級(jí)9 例；腦血管痙攣29 例；Glasgow 昏迷量表（GCS）評(píng)分為6（4，7）分。隨訪結(jié)束后，mRS 評(píng)分≤2 分107 例（預(yù)后良好組），＞2 分41 例（預(yù)后不良組）。

兩組間性別構(gòu)成、BMI、高血壓史占比、糖尿病史占比、高脂血癥史占比、動(dòng)脈瘤位置構(gòu)成和Fisher分級(jí)構(gòu)成差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），預(yù)后良好組年齡、Hunt-Hess 分級(jí)Ⅲ級(jí)占比、腦血管痙攣占比和GCS 評(píng)分均低于預(yù)后不良組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 兩組基線資料比較

預(yù)后良好組治療前后TRPM2 水平分別為（0.45±0.09） g/L、（0.25±0.05） g/L， 均低于預(yù)后不良組（0.51±0.13） g/L、（0.34±0.06） g/L，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.645，P=0.011；t=7.768，P＜0.01）。預(yù)后良好組、 預(yù)后不良組治療后TRPM2 水平均低于治療前，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=20.208、9.806，均P＜0.01）； 治療前后TRPM2 水平變化值分別為0.19（0.12，0.27）和0.13（0.08，0.27），差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=1.652，P=0.098）。 見(jiàn)圖1。

圖1 aSAH 患者治療前后TRPM2 水平

治療前TRPM2 判斷aSAH 患者預(yù)后的ROC 曲線下面積（AUC）、最佳截?cái)帱c(diǎn)、靈敏度和特異度分別為0.622（95%CI：0.511～0.734）、0.55、41.46%和87.85%，治療后TRPM2 判斷aSAH 患者預(yù)后的AUC、最佳截?cái)帱c(diǎn)、靈敏度和特異度分別為0.885（95%CI：0.822～0.947）、0.28、82.93%和80.37%，治療后TRPM2 判斷aSAH 患者預(yù)后的AUC 高于治療前TRPM2，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=4.672，P＜0.01）。

將aSAH 患者預(yù)后作為因變量， 年齡、GCS 評(píng)分、 治療后TRPM2、Hunt-Hess 分級(jí)、Fisher 分級(jí)和腦血管痙攣?zhàn)鳛樽宰兞考{入線性回歸分析（變量賦值見(jiàn)表2），結(jié)果顯示上述因素的容忍度均大于0.1，方差膨脹因子均小于10，見(jiàn)表3；提示上述因素不存在共線性。將上述因素納入多因素logistic 回歸分析，結(jié)果顯示GCS 評(píng)分高、治療后TRPM2＞0.28 和Hunt-Hess 分級(jí)Ⅲ級(jí)是aSAH 患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05），見(jiàn)表4。

表2 變量賦值

表3 各變量共線性檢驗(yàn)結(jié)果

表4 logistic 分析aSAH 患者預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)因素

3 討論

準(zhǔn)確評(píng)估aSAH 預(yù)后具有重要意義， 有助于制定患者后續(xù)治療方案。 目前臨床主要應(yīng)用Hunt-Hess分級(jí)評(píng)價(jià)aSAH 患者預(yù)后［13］，但該分級(jí)各等級(jí)間劃分標(biāo)準(zhǔn)的界限不清晰，受主觀因素影響較大［14-15］，因此亟需探究評(píng)價(jià)aSAH 患者預(yù)后的新指標(biāo)。 TRPM2是一種非選擇性鈣離子可滲透的陽(yáng)離子通道，在機(jī)體內(nèi)廣泛分布，對(duì)氧化應(yīng)激的激活高度敏感［16］。 氧化應(yīng)激損傷一般多通過(guò)破壞細(xì)胞內(nèi)離子穩(wěn)態(tài)誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。 多數(shù)研究表明TRPM2 在介導(dǎo)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，包括腦缺血-再灌注損傷、β-淀粉樣蛋白寡聚體相關(guān)神經(jīng)毒性和記憶障礙、 神經(jīng)毒素1-甲基-4-苯基吡啶離子/1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡和破壞血管內(nèi)皮功能［17-20］等。

本研究結(jié)果顯示，預(yù)后良好組治療前后TRPM2水平均低于預(yù)后不良組，提示TRPM2 與aSAH 患者預(yù)后有關(guān)，是評(píng)估其預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物；結(jié)果還顯示預(yù)后良好組和預(yù)后不良組治療后的TRPM2水平均低于治療前， 提示介入治療會(huì)影響aSAH 患者TRPM2 水平，但其具體原因仍需研究探明。 本研究用AUC 評(píng)價(jià)TRPM2 判斷aSAH 患者預(yù)后的價(jià)值，結(jié)果顯示治療后TRPM2 判斷aSAH 患者預(yù)后的AUC、 靈敏度和特異度分別為0.885、82.93%和80.37%， 治療后TRPM2 判斷aSAH 患者預(yù)后的AUC 高于治療前TRPM2，表明治療后TRPM2 判斷aSAH 患者預(yù)后有一定價(jià)值，可輔助臨床決策。

既往有研究表明，TRPM2 與炎性反應(yīng)、 氧化應(yīng)激及調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度等有關(guān)，并通過(guò)上述機(jī)制參與神經(jīng)元凋亡［6-7］。 本研究中多因素logistic 回歸分析結(jié)果顯示，治療后TRPM2＞0.28 是aSAH 患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素， 推測(cè)其原因是治療后TRPM2 水平與神經(jīng)元凋亡、腦部炎癥和氧化應(yīng)激損傷、細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度及NLRP3 炎性小體激活等有關(guān)， 上述因素均與神經(jīng)元的功能和生存狀態(tài)有關(guān)，因此可反映患者預(yù)后；研究結(jié)果還顯示GCS 評(píng)分高和Hunt-Hess Ⅲ級(jí)是aSAH 患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，這與既往研究［21-22］報(bào)道一致。 張鵬等［23］研究表明， 腦血管痙攣和Fisher 分級(jí)與aSAH 患者預(yù)后不良有關(guān)。 本研究結(jié)果顯示腦血管痙攣并非aSAH 患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，推測(cè)其原因與研究樣本量大小有關(guān)，還需開(kāi)展大樣本研究予以驗(yàn)證。

綜上所述，aSAH 患者介入治療后TRPM2 水平高與預(yù)后不良有關(guān)。本研究尚存在一定不足，如僅分析治療前后兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的TRPM2 水平與aSAH 患者預(yù)后的關(guān)系， 后續(xù)將增加時(shí)間梯度，進(jìn)一步探究； 此外， 對(duì)于接受外科手術(shù)治療后患者TRPM2 是否可用于預(yù)后評(píng)估及其臨床價(jià)值，還需進(jìn)一步研究。