徐琳杰，李夢雅，許 凱，徐 燕，紀(jì)德華，王文磊，陳昌生，謝潮添

(集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，福建 廈門 361021)

0 引言

大型海藻主要分布在潮間帶，接受的光照強度和波長會隨著混合層深度及海水透光性的變化而發(fā)生改變。因此，大型海藻必須具備光適應(yīng)機制，以滿足自身對光照的需求。壇紫菜由葉狀體(配子體)和絲狀體(孢子體)兩個世代構(gòu)成異形世代交替生活史，兩個世代在形態(tài)及生活環(huán)境等方面都差異顯著[7]。在自然環(huán)境中，絲狀體生長在低潮區(qū)或潮下帶的貝殼等石灰?guī)r基質(zhì)的內(nèi)部，葉狀體附著在中高潮區(qū)的巖礁上生長[8]。這種生活環(huán)境的差異表明壇紫菜的兩個世代對光強的要求可能不同[9]。為此，研究人員分析了光強對壇紫菜生長的影響[10-12]：在50 μmol·m-2·s-1光強下，壇紫菜葉狀體的生長和光合速率都高于絲狀體；當(dāng)光強高于100 μmol·m-2·s-1時，壇紫菜絲狀體生長受到抑制；而在550 μmol·m-2·s-1光強下，葉狀體生長速率沒有受到顯著抑制。

壇紫菜生長的基礎(chǔ)是光合作用，即以光能為能量來源，吸收無機碳并合成有機物。理論上光與無機碳利用的關(guān)系非常緊密，但以往研究并不認(rèn)可這一點[13]。為此，本研究擬分析壇紫菜葉狀體及絲狀體在不同光照條件下生長和無機碳利用上的差異。本研究擬通過室內(nèi)培養(yǎng)實驗，分析在10，50，500 μmol·m-2·s-1三種光強下，壇紫菜光合速率、生長、色素、無機碳吸收速率和碳酸酐酶活性等應(yīng)答光照強度的變化，有利于進(jìn)一步了解壇紫菜光合生理及無機碳利用的差異。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗材料為壇紫菜Z-61品系，由集美大學(xué)壇紫菜團(tuán)隊通過雜交方法選育獲得，以自由絲狀體形式保存在福建省壇紫菜種質(zhì)資源庫。藻體培養(yǎng)溫度為21 ℃，光周期為12 L∶12 D，光照強度為50 μmol·m-2·s-1，培養(yǎng)液每2 d更換一次，以保證生長過程中有充足的營養(yǎng)鹽。葉狀體培養(yǎng)至15 cm 左右，剪成2～3 cm長的片段。絲狀體用茶漏匙收集。藻體用無菌紗布吸干表面水分備用。將藻體分別放入1 L培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)2 d(短期)和7 d(長期)，設(shè)置10，50，500 μmol·m-2·s-1三種光強，每種處理設(shè)置三個生物學(xué)重復(fù)。

1.2 熒光參數(shù)的測定

將藻體放置于21 ℃溫度恒定的培養(yǎng)室內(nèi)，暗處理15 min，隨后用Diving-PAM(Walz,Germany)分別測定絲狀體和葉狀體的光系統(tǒng) Ⅱ 最大光化學(xué)效率Fv/Fm，其飽和脈沖光強為8000 μmol·m-2·s-1。

1.3 凈光合速率的測定

采用黑白瓶法測定凈光合放氧速率。用紗布輕壓絲狀體和葉狀體去除表面的水分，稱量其鮮重(WF)。然后將藻體放入玻璃溶氧瓶中，以不加藻體的作為空白瓶。白瓶置于對應(yīng)生長光強下培養(yǎng)4 h。測定培養(yǎng)前后的溶解氧濃度。溶解氧測定方法參考國家標(biāo)準(zhǔn)(GB 7489—1987)，用G20電位滴定儀(METTLER-TOLEDO)自動檢測滴定終點并識別等當(dāng)點。白瓶和空白瓶的溶解氧差值用于計算凈光合速率。

1.4 CA的測定

參照Wilbur[14]的方法測定eCA及總碳酸酐酶(total CA)活性。取適量藻體稱量鮮重(WF)，并用無碳海水沖洗三遍。無碳海水的配置方法：加入鹽酸使新鮮海水培養(yǎng)基的pH值小于3，在冰浴條件下，充氮氣 30 min，隨后加入Tris試劑使最終質(zhì)量濃度為6 g·L-1，繼續(xù)充氮氣30 min，然后添加NaOH將海水pH值調(diào)整為8.1。將漂洗后的藻體放入5 mL無碳海水中，迅速加入2.5 mL CO2飽和海水，立即計時，記錄混合液pH值從8.1降到7.2的時間(T藻樣)。同時記錄不加藻體的無碳海水pH值下降時間(T空白)，并依照公式E(eCA)=(T空白÷T藻樣-1)÷WF計算eCA的活性E(eCA)。

對于總碳酸酐酶活性，取適量藻體，用2 mL無CO2海水研磨粉碎，將1 mL勻漿與4 mL無碳海水及2.5 mL CO2飽和海水迅速于燒杯中混合。記錄T藻樣和T空白，并依照公式E(total CA)=(T空白÷T藻樣-1)÷(0.5×WF)計算總碳酸酐酶的活性E(tatal CA)。

1.5 色素含量的測定

用紗布吸掉藻體表面水分，稱其鮮重。取3份藻體置于55 ℃烘箱中烘2 h，稱其干重(WD)。測定藻體的含水率(WC)。

參照J(rèn)ensen[15]的方法測定葉綠素a(Chla)含量。將藻體在4 ℃的90%(體積分?jǐn)?shù))丙酮中研磨粉碎，將組織勻漿放入50 mL(V)磨口瓶中。室溫下，遮光萃取24 h，離心后取上清液，用分光光度計測定其在666 nm和730 nm處的吸光度值(A)。Chla質(zhì)量比(mg/g)的計算公式為：w(Chla)=(A666-A730)×10V÷890×[WF(1-WC)]。

參照高洪峰[16]的方法測定藻膽蛋白含量。將藻體在4 ℃的0.05 mol·L-1PBS(pH=6.8)緩沖液中研磨粉碎。將組織勻漿放入-20 ℃冰箱冷凍，待完全冷凍后取出放置在室溫下解凍，反復(fù)凍融6次，然后于4 ℃冰箱中過夜。離心后取上清液，用分光光度計測定其在565,615，650，615，730 nm處的吸光度值(A)。每克藻體中藻紅蛋白(PE)、藻藍(lán)蛋白(PC)、別藻藍(lán)蛋白(APC)質(zhì)量比w(mg/g)的計算公式[16]為：

w(PE)=[0.123(A565-A730)-0.068(A615-A730)+0.015(A650-A730)]×V÷[WF(1-WC)],

w(PC)=[0.162(A615-A730)-0.001(A565-A730)-0.098(A650-A730)]×V÷[WF(1-WC)],

w(APC)=[0.171(A650-A730)-0.006(A565-A730)-0.004(A615-A730)]×V÷[WF(1-WC)]。

1.6 光合-無機碳響應(yīng)曲線(P-C曲線)

配置不同無機碳濃度的海水：往無碳海水中加入NaHCO3，配制無機碳濃度為0,0.05,0.1,0.5,1,2,4,10 mmol·L-1的海水。取適量藻體置于不同無機碳濃度海水中，培養(yǎng)4 h，測量10,50,500 μmol·m-2·s-1三種光照強度下的放氧速率。通過Michaelis-Menten方程v=vmax×[s]/(Km+[s])，求得最大光合速率(vmax)。其中：[s]為無機碳濃度；v為該無機碳濃度下的凈光合速率；Km為最大光合速率一半時的無機碳濃度。

1.7 比生長速率

用紗布吸干藻體表面水分，稱量培養(yǎng)前后藻體鮮重，分別記為WF0、WFt。計算比生長速率μ的公式為：μ=(lnWFt-lnWF0)÷t,其中t為培養(yǎng)時間(d)。

1.8 數(shù)據(jù)分析

用t檢驗、單因素方差分析和雙因素方差分析法，分析光強對壇紫菜兩個世代的影響和差異。設(shè)定顯著性差異為P<0.05，極顯著差異為P<0.001，所用軟件為SPSS statistics 22.0。

2 結(jié)果分析

2.1 光強對Fv/Fm的影響

三種光強下，葉狀體的Fv/Fm均明顯高于絲狀體(P<0.05，見圖1)。其中，在10 μmol·m-2·s-1光強下，差異極顯著(P<0.001)。隨著光強的增加，絲狀體和葉狀體的Fv/Fm都明顯下降，即與光強呈負(fù)相關(guān)。在500 μmol·m-2·s-1光強下，葉狀體與絲狀體的Fv/Fm降幅都超過了55%。

2.2 光強對光合效率的影響

培養(yǎng)時間相同時，光強升高可以增大藻體的凈光合速率,并且葉狀體比絲狀體的增幅更大(見圖2)。與10 μmol·m-2·s-1相比，光強提高到500 μmol·m-2·s-1，葉狀體和絲狀體凈光合速率分別增加2.8和7.1以上。無論培養(yǎng)2 d或7 d，在10 μmol·m-2·s-1下，葉狀體與絲狀體的凈光合速率沒有明顯差異(P>0.05)；提高光強后，葉狀體凈光合速率均顯著高于絲狀體(P<0.05)。

2.3 光強及無機碳濃度對光合速率的影響

如圖3所示，壇紫菜葉狀體和絲狀體的光合放氧速率都先隨無機碳濃度(DIC)的升高而增加，趨近飽和后不再增加。無論培養(yǎng)2 d或7 d，光強為50,500 μmol·m-2·s-1時，葉狀體的凈光合速率總是極顯著高于絲狀體(P<0.001)。這說明壇紫菜絲狀體的光補償點比葉狀體低，更容易達(dá)到飽和。

如表1所示，絲狀體和葉狀體的最大光合速率(vmax)隨光照強度顯著增加(P<0.001)，說明光照強度可以影響壇紫菜的光合固碳能力。在50 μmol·m-2·s-1及500 μmol·m-2·s-1的光強下，無論培養(yǎng)2 d或7 d，絲狀體的vmax無顯著差異(P>0.05)。隨光強的增加，葉狀體vmax逐漸大于絲狀體，尤其在500 μmol·m-2·s-1下，葉狀體的vmax極顯著高于絲狀體(P<0.001)，達(dá)到6倍以上，說明壇紫菜不同世代對無機碳的利用能力存在較大差異。

表1 三種光強下壇紫菜的

2.4 光強對色素含量的影響

不論培養(yǎng)2 d或7 d，絲狀體和葉狀體的Chla含量隨光照強度的增加而呈極顯著降低(P<0.001)。絲狀體和葉狀體中， PE含量在38～65 mg·g-1范圍內(nèi)，遠(yuǎn)高于其他色素。葉狀體PE含量隨光強的增加而降低(P<0.05)；但在絲狀體中，PE含量僅在培養(yǎng)7 d下與光強呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。整體而言，光強對PC和APC含量的影響較小(P>0.05)。僅在培養(yǎng)7 d后，葉狀體中PC含量與光強呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.05)(見圖4)。

2.5 光強對碳酸酐酶活性的影響

由圖5所示，培養(yǎng)2 d或7 d，total CA和eCA活性均與光強呈正相關(guān)(P<0.001)。與10 μmol·m-2·s-1相比，在500 μmol·m-2·s-1光強下，葉狀體和絲狀體的total CA和eCA活性增幅均超過40%。在10 μmol·m-2·s-1光強下培養(yǎng)7 d，total CA存在世代差異(P<0.05)，但在其他光照與培養(yǎng)時間下，壇紫菜的total CA和eCA均無顯著的世代差異(P>0.05)(見圖5)。

2.6 光強對生長的影響

如圖6可見，壇紫菜絲狀體和葉狀體的生長對光強的響應(yīng)存在差異。培養(yǎng)2 d或7 d，葉狀體生長和光強均呈正相關(guān)，相比于10 μmol·m-2·s-1，在500 μmol·m-2·s-1光強下葉狀體的生長增加670%以上(P<0.001)。而絲狀體截然相反，相比于10 μmol·m-2·s-1，在500 μmol·m-2·s-1光強下培養(yǎng)2 d，絲狀體的生長降低了90%(P<0.001)。在50，500 μmol·m-2·s-1光強下培養(yǎng)，壇紫菜的生長存在明顯的世代差異(P<0.05)，尤其在500 μmol·m-2·s-1光強下培養(yǎng)2 d，葉狀體的比生長速率μ比絲狀體高了近42倍。然而，在10 μmol·m-2·s-1光強下培養(yǎng)7 d，絲狀體μ比葉狀體高了近5倍。

3 討論

3.1 無機碳利用的世代差異對光強的應(yīng)答

藻體對無機碳的利用會影響光合速率，因此最大光合速率vmax是判斷藻類無機碳親和力的重要參數(shù)。本研究結(jié)果表明，隨著無機碳濃度的提高，壇紫菜絲狀體的vmax比葉狀體更容易達(dá)到峰值，表明葉狀體對無機碳利用能力更強(見圖3)。此外，葉狀體與絲狀體的vmax均與光強呈正相關(guān)(見表1)，這與Takashi[20]在衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)中的研究結(jié)果相一致，這表明光強可以影響CCM。凈光合速率是碳捕獲能力的最終體現(xiàn)。本研究中，相比于光強10 μmol·m-2·s-1，壇紫菜在光強500 μmol·m-2·s-1下培養(yǎng)2 d和7 d后，絲狀體和葉狀體的凈光合放氧速率提高至2.8倍和7.1倍(見圖2)。這些結(jié)果說明光強的增加可以提高無機碳的利用能力，從而對壇紫菜的光合作用產(chǎn)生促進(jìn)效果。

綜上，壇紫菜兩個世代的無機碳利用對光強的應(yīng)答存在明顯差異。

3.2 光強對光合作用和生長的影響及世代差異

光是影響大型海藻生長的重要環(huán)境因素之一，光強變化會影響藻類的光合作用、色素合成、營養(yǎng)物質(zhì)積累及生長速率[21]。Fv/Fm是一種準(zhǔn)確、靈敏的光響應(yīng)檢測指標(biāo)，能反映藻體受到光抑制的程度[22]。在強光下，能量過載和對PS Ⅱ的損傷是Fv/Fm降低的主要原因[23]。在本研究中，隨著光強的增加，壇紫菜的兩個世代Fv/Fm均逐漸降低，說明強光對葉狀體和絲狀體的光合系統(tǒng)均產(chǎn)生抑制作用(見圖1)。高等植物會改變捕光色素的濃度和比例，在強光下減少色素含量以減弱光抑制，而在弱光下提高色素含量以提高捕光效率[23-24]。壇紫菜的捕光色素不僅有葉綠素，還有大分子藻膽蛋白。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著光照增加，壇紫菜Chla和PE含量顯著降低，但PC和APC含量沒有顯著變化(見圖4)。這說明壇紫菜的色素對光強的應(yīng)答比高等植物更復(fù)雜。Harb等[25]發(fā)現(xiàn)，增加光強，紅藻擬雞毛菜(Pterocladiellacapillacea)的PC含量減少，但Chla和APC含量沒有明顯變化，而PE含量是先增加后減少。龍須菜(Gracilarialemaneiformis)隨光強的增加，PC和Chla含量不變，而PE及APC含量減少[26]。由此可知，壇紫菜、龍須菜和擬雞毛菜三種紅藻對光的響應(yīng)并不相同。

光合作用是光合生物干物質(zhì)積累的基礎(chǔ)，因此決定了經(jīng)濟(jì)海藻的產(chǎn)量[27]。但是不適宜的光強會抑制或減弱光合作用，從而抑制植株的生長。趙振魯?shù)萚28]和Wang等[3]通過對蟲黃藻(Symbiodiniumvoratum)、綠藻(Botryococcusbraunii)的研究發(fā)現(xiàn)，藻體生長速率隨光強增加呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。研究[10-12，29]表明，壇紫菜葉狀體比絲狀體更喜強光，但兩個世代來自不同的品系。本研究中，通過比較來自同一品系的葉狀體和絲狀體，發(fā)現(xiàn)：相較于光強50 μmol·m-2·s-1，高光強500 μmol·m-2·s-1下絲狀體的生長速率降低了90%，而葉狀體則升高了38%；低光強10 μmol·m-2·s-1下，絲狀體生長速率下降了25%，葉狀體卻下降了85%(見圖6)。這說明強光對壇紫菜葉狀體生長有促進(jìn)作用，但抑制絲狀體生長；壇紫菜絲狀體更適應(yīng)低光，而葉狀體更適應(yīng)高光，兩個世代的光合作用和生長，以及對光強的應(yīng)答存在明顯差異。

綜上所述，壇紫菜兩個世代對光強的應(yīng)答在無機碳利用、光合作用以及生長上存在差異。壇紫菜的生長速率不完全與光化學(xué)反應(yīng)和固碳效率相一致。因此，在壇紫菜高產(chǎn)新品系的選育與評估時，生長速率才是衡量產(chǎn)量的重要指標(biāo)，凈光合速率只能作為輔助參考。在壇紫菜絲狀體育苗、葉狀體養(yǎng)殖以及種質(zhì)保存期間，應(yīng)選擇適宜的光照強度進(jìn)行培育以滿足生產(chǎn)需求。