李晨依，喻奇?zhèn)?，羅貞寶，朱紫童，康 俊，賈宏昉*

（1河南農(nóng)業(yè)大學煙草學院，河南鄭州 450002；2貴州省煙草公司畢節(jié)市公司，貴州畢節(jié) 551700）

0 引言

【研究意義】煙草（L.）是一種喜鉀經(jīng)濟作物，其生長發(fā)育和品質(zhì)形成與鉀元素密切相關(guān)，但我國大部分煙葉鉀含量僅1.5%左右（羅華元等，2010），遠低于優(yōu)質(zhì)煙葉鉀含量的最低標準（2%）（楊鐵釗等，2002）。因此，提高煙葉鉀含量是我國煙草產(chǎn)業(yè)發(fā)展亟待解決的問題。植物高親和鉀轉(zhuǎn)運蛋白（High affinity kalium transporter，HAK）屬于K轉(zhuǎn)運載體KUP/HAK/KT家族蛋白，該家族成員主要參與低鉀條件下植物對K的吸收與轉(zhuǎn)運，還可通過調(diào)節(jié)植物體內(nèi)Na/K平衡來提高植物抗逆性（王北辰和伍國強，2021）。因此，克隆煙草基因并分析其在不同脅迫下的表達模式，以期揭示該基因在煙草抵御低鉀脅迫等非生物脅迫中的功能和作用機制，對培育K高效吸收優(yōu)質(zhì)煙草新品種具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】植物吸收利用K主要是通過K通道蛋白和K轉(zhuǎn)運蛋白來完成（Wang and Wu，2013）。根據(jù)K轉(zhuǎn)運蛋白的序列和結(jié)構(gòu)特征，K轉(zhuǎn)運蛋白可分為四大家族，分別為KUP/HAK/KT家族、HKT/Trk/Ktr家族、CHX家族和KEA家族（He et al.，2012；Song et al.，2019）。其中，KUP/HAK/KT家族最大，成員最多，分布最廣（Ahn et al.，2004）。目前已在大麥（Santa-María et al.，1997）、擬南芥（He et al.，2012）、玉米（Nieves-Cordones et al.，2016）、水稻（Chen et al.，2015）和谷子（Zhang et al.，2018）中鑒定出多個KUP/HAK/KT家族基因。研究發(fā)現(xiàn)，大麥和基因均受低鉀脅迫誘導(dǎo)表達量明顯升高，其中過表達基因可顯著增加葉片鉀含量（Boscari et al.，2009）；擬南芥基因受低鉀脅迫誘導(dǎo)表達量明顯升高（Rubio et al.，2014）；水稻中過表達基因能顯著提高轉(zhuǎn)基因水稻K的轉(zhuǎn)運效率（Chen et al.，2015），且基因參與調(diào)控K從根部向地上部的轉(zhuǎn)運，在維持水稻Na/K平衡方面發(fā)揮關(guān)鍵作用（Feng et al.，2019）；谷子基因受低鉀誘導(dǎo)表達量明顯升高，有效促進植株對K的吸收利用，而基因?qū)Φ外浢{迫不敏感，主要參與正常供鉀條件下K的吸收（Zhang et al.，2018）；玉米的2個高親和鉀轉(zhuǎn)運蛋白ZmHAK1和ZmHAK5均參與調(diào)控K的轉(zhuǎn)運，且ZmHAK5轉(zhuǎn)運能力強于ZmHAK1（Qin et al，2019）。有關(guān)煙草基因研究發(fā)現(xiàn)，普通煙草可能有41個基 因 家 族 成 員，僅 有、、和等少數(shù)基因被克隆鑒定，初步證實基因不響應(yīng)低鉀脅迫（魯黎明和楊鐵釗，2011），但可通過協(xié)調(diào)Na/K平衡提高煙株抗逆性（秦利君等，2015；張祎等，2017）；、和基因在煙草幼苗根系中表達，且在低鉀脅迫下表達量升高（Song et al.，2019）?！颈狙芯壳腥朦c】雖然已證實家族基因在植物K吸收和轉(zhuǎn)運過程中發(fā)揮重要作用，但目前有關(guān)煙草基因的研究報道較少，尚未見有關(guān)煙草基因克隆及其在不同脅迫下表達模式分析的研究報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】基于煙草基因組和轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，克隆基因，并對其生物學信息、亞細胞定位和表達模式進行分析，進而揭示基因在煙草抵御低鉀脅迫及其他非生物脅迫的作用，為探究煙草在非生物脅迫下對K的吸收和轉(zhuǎn)運機制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試的煙草品種為普通烤煙品種K326。Eastep Super Total RNA Extraction Kit試劑盒購自上海普洛麥格生物產(chǎn)品有限公司；HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit（+gDNA wiper）試劑盒、Pro Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒以及大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞購自南京諾唯贊生物技術(shù)有限公司。主要儀器設(shè)備：光照培養(yǎng)箱（RXZ-1000，中國寧波江南儀器廠）、PCR儀（Analytikjena，德國）、Fluo View FV1000 激光共聚焦顯微鏡（Olympus，日本）。

1.2 樣品培養(yǎng)及脅迫處理

將煙草種子放入霍格蘭營養(yǎng)液后置于培養(yǎng)箱［光/暗周期為16 h/8 h，溫度為28 ℃/22 ℃，光強度為300 μmol/（m·s），相對濕度60%］中培養(yǎng)，待種子露白后，先使用1/4霍格蘭營養(yǎng)液培養(yǎng)3 d，再使用1/2霍格蘭營養(yǎng)液培養(yǎng)3 d，最后使用霍格蘭營養(yǎng)液培養(yǎng)4 d后，對幼苗進行非生物脅迫處理（尹卓然等，2022），包括低鉀脅迫處理（0.1 mmol/L K）、干旱脅迫處理（10% PEG-6000）、鹽脅迫處理（150 mmol/L NaCl）、低氮脅迫處理（0.25 mmol/L NO）、低磷脅迫處理（0.1 mmol/L PO）和冷害脅迫處理（4 ℃），以未脅迫處理（正常供鉀2 mmol/L K）的植株樣品為對照（CK）。其中，冷害脅迫處理3 h后整株取樣，其余脅迫處理7 d后整株取樣，用于檢測不同脅迫下基因的表達情況。

用霍格蘭營養(yǎng)液培養(yǎng)煙苗21 d后進行低鉀（0.1 mmol/L K）脅迫處理7 d，然后取根、莖、新葉（從上往下數(shù)完全展開的第2片葉）和老葉（從上往下數(shù)第7片葉），用于檢測基因在煙草不同組織的表達模式。以正常供鉀（2 mmol/L K）的植株組織為對照（CK）。

1.3 目的基因克隆

從NCBI數(shù)據(jù)庫搜索獲取基因的參考序列（GenBank登錄號XM_016628407.1），利用Primer Premier 6設(shè)計基因編碼區(qū)（CDS）序列的特異擴增引物，以低鉀脅迫處理的煙草葉片cDNA為模板進行PCR擴增。反應(yīng)體系（50 μL）：5×PCR Buffer 10 μL，100 ng/μL cDNA 模 板2 μL，Primer Star DNA聚合酶1 μL，10 μmol/L上、下游引物2 μL；2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，ddHO補足至50 μL。擴增程序：94 ℃5 min；94 ℃30 s，58 ℃30 s，72 ℃2.5 min，進行35個循環(huán)，72 ℃延伸5 min。利用DNA連接酶將擴增獲得的目的片段和pMD19-T載體連接，送武漢伯遠生物科技有限公司進行測序，從而獲得目的基因序列信息。

1.4 生物信息學分析

利用NCBI數(shù)據(jù)庫的ORFfinder將基因序列翻譯成氨基酸序列；利用NetPhos 2.0 Serve預(yù)測NtHAK5的磷酸化位點；利用DNAMAN 9.0將NtHAK5蛋白與煙草、擬南芥、玉米和水稻的HAK家族蛋白進行氨基酸序列分析；利用ExPASy網(wǎng)站的ProtParam和SWISS-MODEL分析蛋白的理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)；使用TMPRED預(yù)測NtHAK5蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域（黃化剛等，2016）。

1.5 啟動子順式作用元件分析

以基因CDS序列作為探針，利用Sol Genomics Network中的Blast程序查詢該基因序列全長，并利用PlantCARE網(wǎng)站對其起始密碼子上游2000 bp序列進行啟動子順式作用元件分析（曾露桂等，2020）。

1.6 亞細胞定位分析

參考尹卓然等（2022）的方法構(gòu)建植物表達載體pBWA（V）HS--GLosgfp，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)染煙草表皮細胞，然后置于培養(yǎng)箱（溫度22 ℃）中培養(yǎng)30～60 h。通過激光共聚焦顯微鏡觀察細胞中熒光蛋白的位置。以不含基因序列的pBWA（V）HS-GLosgfp空載體為對照。

1.7 基因表達分析

參照Pro Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒說明進行實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測，選擇煙草核糖體蛋白編碼基因（）（GenBank登錄號L18908.1）作為內(nèi)參基因，設(shè)3次重復(fù)。采用2算法計算目的基因的相對表達量（黃化剛等，2016），并利用DPS7.0和Origin 2018進行數(shù)據(jù)分析及作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 NtHAK5基因的PCR擴增結(jié)果

以普通煙草K326的葉片cDNA作為模板擴增基因全長CDS序列，結(jié)果（圖1）顯示，擴增條帶長度約為2500 bp。將其測序結(jié)果與基因參考序列（XM_016628407.1）進行比對，結(jié)果顯示，兩者的核苷酸序列相似性達100%，表明克隆獲得的序列為基因CDS序列，長度為2418 bp，編碼805個氨基酸殘基。

2.2 NtHAK5蛋白的理化性性質(zhì)及結(jié)構(gòu)域預(yù)測結(jié)果

NtHAK5蛋白由805個氨基酸組成，分子式為CHNOS，分子量為89874.00 Da，理論等電點（pI）為8.65，含有70個酸性氨基酸和77個堿性氨基酸；不穩(wěn)定性指數(shù)（Ⅱ）為33.70，屬于穩(wěn)定蛋白。該蛋白的二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋占40.12%，延伸鏈占24.97%，無規(guī)則卷曲占26.21%，β-折疊占8.70%。NtHAK5蛋白包含45個絲氨酸、19個蘇氨酸和11個酪氨酸，推測磷酸化可能發(fā)生在以上位點，且其包含12個疏水跨膜區(qū)，第二和第三區(qū)域間存在1個帶電荷中央親水環(huán)，并將其分成2組，具有典型的植物HAK家族跨膜結(jié)構(gòu)域（圖2）。

2.3 NtHAK5蛋白的氨基酸序列比對及系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果

NtHAK5與煙草NtHAK1和黃花煙草NrHAK1蛋白的氨基酸相似性分別為40.69%和40.44%，與擬南芥AtHAK5、玉米ZmHAK5和水稻OsHAK1蛋白的氨基酸相似性為58.26%、56.24%和52.47%（圖3）。根據(jù)氨基酸序列的相似性構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，結(jié)果（圖4）顯示NtHAK5蛋白與AtHAK5蛋白聚在一個分支，推測煙草NtHAK5蛋白具有與擬南芥AtHAK5蛋白相似的功能，故推測NtHAK5蛋白介導(dǎo)高親和性K吸收并參與調(diào)控煙草K轉(zhuǎn)運過程。

2.4 NtHAK5基因啟動子順式作用元件分析結(jié)果

由圖5可知，在基因啟動子中包含2個參與厭氧誘導(dǎo)響應(yīng)的順式作用元件（ARE）；2個與脫落酸（ABA）響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件（ABRE），其能與轉(zhuǎn)錄因子有效結(jié)合，從而促進或抑制ABA誘導(dǎo)基因的表達，致使植株衰老速度加快或減緩；1個參與低溫響應(yīng)的順式作用元件（LTR），1個參與干旱響應(yīng)的順式作用元件（MBS），可分別增強植物的抗寒和抗干旱能力；1個參與防御和應(yīng)激響應(yīng)的順式作用元件（TC-rich repeats）；2個參與茉莉酸甲酯（MeJA）響應(yīng)的順式作用元件（CGTCA-motif和TGACG-motif），其能響應(yīng)植物損傷，外源使用MeJA可誘導(dǎo)防御基因表達，從而激發(fā)植物的化學防御，推測基因在逆境脅迫響應(yīng)和延緩植物衰老過程中發(fā)揮作用。

2.5 NtHAK5蛋白的亞細胞定位結(jié)果

將構(gòu)建的植物表達載體pBWA（V）HS--GLosgfp通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)染煙草表皮細胞后，利用熒光共聚焦顯微鏡觀察侵染后的葉片，結(jié)果（圖6）發(fā)現(xiàn)葉片細胞的細胞膜中有熒光信號，表明NtHAK5蛋白定位于煙草葉片的細胞膜上。

2.6 低鉀脅迫下NtHAK5基因的組織表達特性分析

利用qRT-PCR檢測低鉀脅迫處理（0.1 mmol/L K）下不同組織基因的相對表達量，以正常供鉀（2 mmol/L K）的植株組織為對照（CK），結(jié)果如圖7所示。低鉀脅迫處理下和正常供鉀（CK）條件下，基因在煙草根、莖、老葉和新葉中均有表達，且均以老葉中相對表達量最高，表明基因主要在葉片尤其是老葉中高表達，具有明顯組織表達特異性。在低鉀脅迫處理下，煙草根、莖、老葉和新葉中基因的相對表達量均顯著高于CK（＜0.05，下同），說明基因受低鉀脅迫誘導(dǎo)過表達，可能參與煙草抵御低鉀脅迫的過程，屬于典型的家族基因，不僅參與K的吸收，還參與了煙草葉片中K再利用過程。

2.7 非生物脅迫下NtHAK5基因的表達特性分析

為了研究基因?qū)Ψ巧锩{迫的響應(yīng)，以無脅迫處理（正常供鉀2 mmol/L K）的植株為對照（CK），通過qRT-PCR 檢測不同非生物脅迫下的基因的表達情況，結(jié)果如圖8所示，基因在干旱脅迫、冷害脅迫、鹽脅迫和低鉀脅迫下的相對表達量顯著高于CK，但在低氮脅迫和低磷脅迫下的相對表達量與CK無顯著差異（＞0.05），說明基因參與煙草植株對干旱脅迫、冷害脅迫、鹽脅迫和低鉀脅迫的響應(yīng)。

3 討論

家族基因已在多種植物中被克隆和鑒定，其主要參與植物對K的吸收、轉(zhuǎn)運與再利用，且大部分基因受低鉀脅迫信號的調(diào)控（蘇文等，2020）。本研究對基因進行克隆及生物信息學分析，結(jié)果表明基因編碼蛋白共有12個疏水跨膜區(qū)，第二和第三區(qū)域間存在1個帶電荷中央親水環(huán)，與已報道的HAK蛋白結(jié)構(gòu)高度相似（Véry and Sentenac，2003），證明NtHAK5蛋白具有HAK家族成員特征。氨基酸序列對比結(jié)果顯示，NtHAK5蛋白與擬南芥AtHAK5蛋白的氨基酸序列相似性最高。將NtHAK5與其他植物的HAK蛋白進行系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果表明NtHAK5與擬南芥AtHAK5聚在一個分支，證明兩者親緣關(guān)系最近，基因具有基因相似的生物學功能。由于AtHAK5是擬南芥中重要的高親和鉀轉(zhuǎn)運蛋白（Ahn et al.，2004），故推測NtHAK5蛋白在煙草K吸收轉(zhuǎn)運過程中發(fā)揮重要作用。啟動子的順式作用元件能調(diào)控基因的表達模式（Saeed et al.，2006），且與多種脅迫響應(yīng)密切相關(guān)（Walther et al.，2007）。本研究發(fā)現(xiàn)基因啟動子不僅包含多個參與防御、低溫響應(yīng)、應(yīng)激反應(yīng)和干旱誘導(dǎo)等順式作用元件，還含有響應(yīng)ABA誘導(dǎo)的核心元件ABRE，由于ABA在植物響應(yīng)逆境脅迫中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用（張彥桃等，2014），因此，推測受ABA信號的調(diào)控參與各種非生物脅迫。本研究亞細胞定位結(jié)果顯示，NtHAK5蛋白主要定位于細胞膜，與其他植物HAK家族蛋白的亞細胞定位一致，如水稻中的OsHAK1、OsHAK2和OsHAK5蛋白定位于細胞膜（柴薇薇等，2019）。由于植物蛋白質(zhì)的亞細胞定位結(jié)果暗示其功能特性，故推測NtHAK5蛋白通過細胞膜參與煙草植株的K吸收與轉(zhuǎn)運。綜上所述，初步推測NtHAK5是具有吸收和轉(zhuǎn)運K功能的膜蛋白，并參與多種非生物脅迫過程。

本研究對基因在煙草不同組織中的表達水平進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)基因在根、莖和葉中均有表達，尤其在老葉中相對表達量最高，可能該基因通過調(diào)控老葉中K的再利用參與煙草生長發(fā)育過程，表明基因具有組織特異性。本研究進一步分析了基因在煙草非生物脅迫下的表達模式，并結(jié)合啟動子順式作用元件分析結(jié)果，推測基因參與了非生物逆境脅迫（低鉀、干旱、高鹽和冷害）下K的吸收和再利用過程，尤其是通過調(diào)控老葉中K的再利用從而提高煙草的鉀素利用效率。轉(zhuǎn)錄調(diào)控在植物體內(nèi)普遍存在，主要用于響應(yīng)外界環(huán)境刺激。目前已有大量研究證明，K轉(zhuǎn)運體基因主要在轉(zhuǎn)錄水平受到調(diào)節(jié)，如擬南芥中的轉(zhuǎn)錄因子ARF2和RAP2.11可直接結(jié)合到基因啟動子上，從而調(diào)節(jié)該基因轉(zhuǎn)錄水平，區(qū)別在于ARF2是基因的負向調(diào)控因子，并在低鉀條件下發(fā)生磷酸化，從而解除對基因的轉(zhuǎn)錄抑制（趙帥，2016），而RAP2.11正向調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄水平，從而響應(yīng)低鉀脅迫（王欣等，2013）。此外，植物響應(yīng)低鉀脅迫還受Ca、活性氧（ROS）和茉莉酸等信號物質(zhì)的影響，推測低鉀脅迫下基因表達可能受以上或其他轉(zhuǎn)錄因子及信號物質(zhì)調(diào)控，且調(diào)控機制尚待研究。目前擬南芥、水稻等模式植物中多個基因已被證實可響應(yīng)低鉀脅迫、高鹽脅迫和干旱脅迫等，例如、和基因在鹽脅迫下表達上調(diào)，通過維持水稻中的Na/K平衡從而增強水稻的耐鹽性（Yang et al.，2014；Chen et al.，2015；Shen et al.，2015）；擬南芥、和基因參與調(diào)控擬南芥的耐鹽反應(yīng)（Aleman et al.，2014）；擬南芥基因通過正向調(diào)節(jié)鉀含量促進植物響應(yīng)干旱和滲透脅迫（Brauer et al.，2016）；在煙草中過表達基因可提高轉(zhuǎn)基因煙草的耐旱性等（張祎等，2017）。因此，今后可通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)深入解析基因在煙草K吸收與再利用過程中的生物學功能。

4 結(jié)論

屬于基因家族成員，具有明顯組織表達特異性，參與煙草植株對干旱脅迫、冷害脅迫、鹽脅迫和低鉀脅迫等非生物脅迫響應(yīng)，推測其編碼的蛋白在煙草組織中作為K轉(zhuǎn)運體參與非生物脅迫下K的吸收、轉(zhuǎn)運和再利用。