蘇曉雪，黎靜，趙威，劉林玲，劉素君，農(nóng)騰川，譚機(jī)永，△

慢性應(yīng)激可通過導(dǎo)致內(nèi)皮功能紊亂，從而誘發(fā)和加劇心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展［1］。應(yīng)激相關(guān)內(nèi)皮功能障礙是嚴(yán)重心血管疾病的早期危險(xiǎn)因素之一［2］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，心理應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂及線粒體損傷［3］，然而其損傷機(jī)制尚未明確。研究表明，微小RNA（microRNA，miRNA）能夠參與調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞的生物學(xué)功能［4］。心理應(yīng)激可導(dǎo)致血漿外泌體miRNA表達(dá)譜改變［5］。本研究通過探討心理應(yīng)激后血漿外泌體miR-184-3p對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響，挖掘心理應(yīng)激相關(guān)疾病早期診斷的分子標(biāo)志物，旨在闡明心理應(yīng)激誘發(fā)和加劇心血管疾病的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 6～8周齡SPF級(jí)C57BL/6雄性小鼠，體質(zhì)量約20 g，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，購自廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（桂）2020-0003；小鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞（MPVEC）購自上海奧陸生物科技有限公司；過表達(dá)陰性對(duì)照物（NC mimic）、miR-184-3p過表達(dá)類似物（miR-184-3p mimic）、riboFECT Cp Transfection Kit（166T）、外泌體提取試劑盒購自廣州銳博生物技術(shù)有限公司；miRNA第一鏈cDNA合成（加尾法）試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司；BeyoClick?EdU-594細(xì)胞增殖檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；SYBR Green PCR Master Mix及Trizol購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.2 動(dòng)物學(xué)實(shí)驗(yàn)

1.2.1 分組及應(yīng)激處理 將60只小鼠通過隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組（30只）和心理應(yīng)激組（30只）。心理應(yīng)激組給予21 d慢性不可預(yù)知性心理應(yīng)激刺激。每天隨機(jī)給予1種應(yīng)激刺激，應(yīng)激源包括：禁水24 h、40℃熱水游泳5 min、束縛實(shí)驗(yàn)1 h、夾尾實(shí)驗(yàn)5 min、濕墊料24 h、夜間光照12 h、水平搖床10 min。除了喂食和鼠籠清理以外，對(duì)照組不做任何應(yīng)激處理。第21天應(yīng)激結(jié)束后，每組各隨機(jī)抽取11只小鼠進(jìn)行行為學(xué)實(shí)驗(yàn)來分析心理應(yīng)激模型效果。

1.2.2 曠場實(shí)驗(yàn) 模型建立后對(duì)小鼠進(jìn)行曠場實(shí)驗(yàn)。曠場實(shí)驗(yàn)箱由邊長50 cm、高40 cm開口向上的不透明結(jié)構(gòu)制成，側(cè)壁和底面為白色。在底面正中心位置畫一個(gè)邊長為25 cm的正方形中心區(qū)域。實(shí)驗(yàn)過程中，將小鼠放置在實(shí)驗(yàn)箱的角落，通過攝像機(jī)記錄5 min內(nèi)小鼠停留在中心區(qū)域的總時(shí)間。

1.2.3 高架十字迷宮實(shí)驗(yàn) 高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)可檢測與焦慮相關(guān)的行為變化。由2個(gè)不透明的相對(duì)閉合臂和2個(gè)相對(duì)開放臂（50 cm×10 cm×50 cm）構(gòu)成，距離地面50 cm，呈現(xiàn)“十”字狀。實(shí)驗(yàn)過程中，將小鼠置于中央?yún)^(qū)域（邊長10 cm的正方形），通過攝像機(jī)記錄5 min內(nèi)小鼠在開放臂停留時(shí)間。

1.2.4 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)過程中，將小鼠放入水溫（25±2）℃、水深25 cm的透明桶內(nèi)。通過攝像機(jī)記錄8 min內(nèi)小鼠的行為，其中前2 min為適應(yīng)時(shí)間，統(tǒng)計(jì)后6 min的漂浮不動(dòng)時(shí)間。

1.2.5 提取血漿外泌體及形態(tài)觀察 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，采用眼球取血法收集全部小鼠全血，4℃、2 000×g離心5 min，收集上清液。采用外泌體提取試劑盒提取血漿外泌體，用PBS溶解沉淀，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩⑸鲜龇椒ㄌ崛〉难獫{外泌體在PBS中重懸，滴加在碳覆膜銅網(wǎng)上吸附90 s，醋酸鈾染液負(fù)染30 s，置于透射電子顯微鏡下觀察形態(tài)。

1.2.6 qPCR檢測血漿外泌體中miR-184-3p的相對(duì)表達(dá)量 采用Trizol法提取血漿外泌體中的RNA并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，采用熒光定量qPCR檢測miRNA表達(dá)水平，每個(gè)樣本重復(fù)測量3次。cel-miR-39-3p上游引物5′-TCACCGGGTGTAAATCAGCTTG-3′，mmu-miR-184-3p上游引物5′-CCTGGACGGAGAACTGATAAGGGT-3′。采用試劑盒提供通用下游引物，以cel-miR-39-3p為外參，通過2-ΔΔCt法計(jì)算mmu-miR-184-3p的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 將MPVEC用含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待生長融合度至80%時(shí)，將該細(xì)胞以1×105個(gè)/孔接種至6孔板，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中過夜，次日進(jìn)行干預(yù)和轉(zhuǎn)染。在外泌體干預(yù)實(shí)驗(yàn)中，用BCA試劑盒對(duì)PBS中的外泌體進(jìn)行定量。分別取20μg對(duì)照組和心理應(yīng)激組小鼠血漿外泌體轉(zhuǎn)入MPVEC，分為陰性對(duì)照（C-EXO）組和干預(yù)（S-EXO）組，干預(yù)24 h后收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中，分別將NC mimics及miR-184-3p mimic轉(zhuǎn)染至MPVEC，分為陰性對(duì)照（NC mimic）組和miR-184-3p mimic組，嚴(yán)格按照轉(zhuǎn)染試劑盒說明書要求操作，轉(zhuǎn)染24 h后各組細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 劃痕實(shí)驗(yàn) 干預(yù)內(nèi)皮細(xì)胞24 h后，用直尺和10μL的吸頭垂直于6孔板進(jìn)行劃痕，做等間距的3條豎線，用PBS清洗去除劃下的細(xì)胞后加入無外泌體血清培養(yǎng)基，用普通光學(xué)顯微鏡記錄0 h和12 h時(shí)細(xì)胞的遷移情況。通過Image J計(jì)算劃痕遷移率，劃痕遷移率=（0 h劃痕面積-12 h劃痕面積）/0 h劃痕面積×100%。

1.3.3 EdU增殖染色實(shí)驗(yàn) 干預(yù)內(nèi)皮細(xì)胞24 h后，加入EdU反應(yīng)液，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h標(biāo)記細(xì)胞，加入Click反應(yīng)液室溫避光孵育30 min染色細(xì)胞質(zhì)，Hoechst 33342溶液室溫避光孵育10 min染色細(xì)胞核，最后在熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞。通過Image J軟件計(jì)算細(xì)胞增殖率，細(xì)胞增殖率=Azide596紅染細(xì)胞數(shù)/Hoechst藍(lán)染細(xì)胞數(shù)×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Graphpad Prism 8.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)檢測結(jié)果 曠場實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，心理應(yīng)激組小鼠在曠場中央?yún)^(qū)域停留的時(shí)間顯著短于對(duì)照組（P＜0.01）；高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，心理應(yīng)激組小鼠在開放臂停留時(shí)間與對(duì)照組比較顯著縮短（P＜0.05）；強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，心理應(yīng)激組小鼠在水面漂浮不動(dòng)的時(shí)間顯著長于對(duì)照組（P＜0.01），見表1。

Tab.1 Changes of behavioral test indexes in two groups of mice表1 2組小鼠行為學(xué)檢測指標(biāo)的變化（n=11，s，±s）

Tab.1 Changes of behavioral test indexes in two groups of mice表1 2組小鼠行為學(xué)檢測指標(biāo)的變化（n=11，s，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。

組別對(duì)照組心理應(yīng)激組t曠場實(shí)驗(yàn)（中央?yún)^(qū)域停留時(shí)間）12.18±5.41 6.36±1.32 3.454＊＊高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)（開放臂停留時(shí)間）114.50±12.51 104.50±8.94 2.176＊游泳實(shí)驗(yàn)（漂浮不動(dòng)時(shí)間）241.70±18.70 313.50±8.28 11.650＊＊

2.3 血漿外泌體miR-184-3p水平分析 qPCR結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，心理應(yīng)激組血漿外泌體中

2.2 超微電鏡分析外泌體形態(tài) 在超微透射電鏡下觀察，可見清晰完整的雙層膜囊泡狀結(jié)構(gòu)，直徑為30～200 nm。見圖1。miR-184-3p水 平 顯 著 升 高（1.25±0.13vs.1.00±0.01，t=3.178，P＜0.05）。

Fig.1 Morphology and structure of plasma exosomes under ultratransmission electron microscopy(×15 000)圖1 超微透射電鏡下血漿外泌體的形態(tài)結(jié)構(gòu)（×15 000）

2.4 血漿外泌體對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、增殖的影響 劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與C-EXO組相比，S-EXO組的血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移率顯著降低（P＜0.01），見圖2，表2。EdU增殖染色結(jié)果顯示，與C-EXO組相比，S-EXO組細(xì)胞陽性增殖率顯著下降（P＜0.01），見圖3，表2。

Fig.2 Scratch test of vascular endothelial cells after plasma exosome intervention(×10)圖2 血漿外泌體干預(yù)后血管內(nèi)皮細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)（×10）

Tab.2 Comparison of migration and proliferation of vascular endothelial cells between two groups表2 2組血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和增殖能力比較（n=3，%，±s）

Tab.2 Comparison of migration and proliferation of vascular endothelial cells between two groups表2 2組血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和增殖能力比較（n=3，%，±s）

＊＊P＜0.01。

組別C-EXO組S-EXO組t劃痕遷移率57.53±8.66 4.31±2.64 10.180＊＊EdU增殖率69.67±1.53 53.33±5.51 4.950＊＊

Fig.3 EdU staining of vascular endothelial cells after plasma exosome intervention(×20)圖3 血漿外泌體干預(yù)后血管內(nèi)皮細(xì)胞EdU增殖染色情況（×20）

2.5 miR-184-3p對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖能力的影響 劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相比NC mimic組，miR-184-3p mimic組的血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力顯著下降（P＜0.05），見圖4，表3。EdU增殖染色結(jié)果顯示，與NC mimic組相比，miR-184-3p mimic組的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖率顯著下降（P＜0.05），見圖5，表3。

Fig.4 Effects of miR-184-3p on the scratch experiment of vascular endothelial cells(×20)圖4 miR-184-3p對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)的影響（×20）

Tab.3 Comparison of migration and proliferation of vascular endothelial cells between two groups表3 2組血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和增殖能力比較（n=3，%，±s）

Tab.3 Comparison of migration and proliferation of vascular endothelial cells between two groups表3 2組血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和增殖能力比較（n=3，%，±s）

＊P＜0.05。

組別NC mimic組miR-184-3p mimic組t EdU增殖率55.80±1.91 45.60±4.62 3.534＊?jiǎng)澓圻w移率58.30±6.33 42.97±1.86 4.025＊

3 討論

心血管疾病是全球高發(fā)性疾病，其發(fā)病率和病死率不斷增加，心理應(yīng)激已被證明與心血管疾病存在密切的聯(lián)系［6］。本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建具有多種刺激因素的慢性不可預(yù)知性心理應(yīng)激小鼠模型，希望能借此模擬人類社會(huì)壓力。筆者通過曠場實(shí)驗(yàn)、高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)及強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)等實(shí)驗(yàn)分析小鼠在心理應(yīng)激后的行為學(xué)變化，結(jié)果表明心理應(yīng)激后小鼠對(duì)未知事物的探索行為顯著減少，在應(yīng)激環(huán)境中表現(xiàn)出絕望抑郁狀態(tài)，提示本研究心理應(yīng)激模型建立成功。相關(guān)研究結(jié)果也證實(shí)，心理應(yīng)激后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有焦慮和抑郁類行為改變［7］。

血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)維持血管正常生理功能有重要作用，其作為血管壁的重要組成部分與心血管疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［8］。血管內(nèi)皮的完整性受到內(nèi)皮細(xì)胞增殖和凋亡的影響，血管內(nèi)皮細(xì)胞的異常增殖和凋亡是動(dòng)脈粥樣硬化性疾病共同的病理生理基礎(chǔ)［9］。血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移能力的下降可抑制血管內(nèi)膜的新生，妨礙損傷后修復(fù)和血管生成［10］。本研究發(fā)現(xiàn)，心理應(yīng)激源性血漿外泌體能夠降低血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和增殖能力，影響了血管內(nèi)皮細(xì)胞的正常生理功能，提示心理應(yīng)激可能通過外泌體途徑損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，這可能是心理應(yīng)激誘發(fā)和加劇心血管疾病的重要機(jī)制。

Fig.5 Effects of miR-184-3p on proliferation and EdU staining of endothelial cells（×20）圖5 miR-184-3p對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞EdU增殖染色的影響（×20）

外泌體是一類由細(xì)胞分泌的胞外囊泡，可通過傳遞miRNAs等生物分子介導(dǎo)細(xì)胞間信號(hào)通訊［11］。研究發(fā)現(xiàn)，抑郁癥可導(dǎo)致大鼠血漿外泌體特異性miRNAs顯著升高，這些miRNAs可能是診斷和預(yù)測壓力相關(guān)性精神疾病的生物標(biāo)志物［5］。已有研究證實(shí)，外泌體miRNAs可以通過促進(jìn)血管生成、維持內(nèi)皮細(xì)胞穩(wěn)定性、抑制內(nèi)皮遷移和增殖等病理生理過程來影響心血管病的發(fā)生發(fā)展［12］。例如，外泌體miR-155表達(dá)下調(diào)可以抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移［13］；miR-26a-5p表達(dá)下調(diào)可以促進(jìn)冠狀動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡［14］；低表達(dá)的miR-186-5p可減輕炎癥反應(yīng)和血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷［15］。本研究發(fā)現(xiàn)，心理應(yīng)激組小鼠血漿外泌體可以顯著抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移功能，同時(shí)心理應(yīng)激小鼠血漿外泌體中miR-184-3p顯著升高。進(jìn)一步將血管內(nèi)皮細(xì)胞miR-184-3p過表達(dá)后，能夠顯著抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移功能。相關(guān)研究也證實(shí)，高表達(dá)的miR-184-3p能夠通過抑制肺血管發(fā)育來破壞正常的肺發(fā)育和功能［16］；局部對(duì)角膜注射miR-184可以顯著降低角膜新生重建、抑制增殖和遷移等［17］。這些研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)miR-184-3p具有抑制正常血管內(nèi)皮細(xì)胞功能和抗血管生成的特性。miRNAs可在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)其靶基因的表達(dá)發(fā)揮負(fù)性調(diào)控作用［18］。miR-184能夠直接靶向促血管生成因子Gata2（FOG2）來調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的表達(dá)，從而影響血管的生成［17］。因此筆者推測，心理應(yīng)激后血漿外泌體可能通過介導(dǎo)miR-184-3p靶向調(diào)節(jié)VEGF信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)來影響血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移功能。

綜上所述，心理應(yīng)激可能通過外泌體途徑導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞的miR-184-3p的表達(dá)上調(diào)，靶向調(diào)節(jié)VEGF信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)，從而抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移功能，這可能是心理應(yīng)激誘發(fā)心血管疾病的重要原因。這也提示血漿外泌體miRNA-184-3p有可能是心理應(yīng)激相關(guān)疾病早期診斷的重要分子標(biāo)志物。