周天旭，羅文磊，笪 俊，吳 瓊，余春艷，李化炳

(1:南京信息工程大學(xué)，南京 210044) (2:中國(guó)科學(xué)院南京地理與湖泊研究所湖泊與環(huán)境國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210008) (3:中國(guó)科學(xué)院撫仙湖高原深水湖泊研究站，玉溪 652500) (4:安徽師范大學(xué)生態(tài)與環(huán)境學(xué)院，蕪湖 241002) (5:河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，保定 071002)

水體因水溫季節(jié)性變化引起的垂向分層是深水湖泊的重要特征之一，這種現(xiàn)象的形成對(duì)湖泊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以及水生生物的分布具有重要影響. 由于水具有不良導(dǎo)熱性以及4℃時(shí)密度最高的物理學(xué)特性，深水湖泊水體在溫度較高的季節(jié)往往形成溫度均勻混合的表層變溫層、溫度變化較快的中層溫躍層和溫度較穩(wěn)定的底層均溫層“三層式”溫度垂直結(jié)構(gòu)[1-2]. 湖泊水體的分層將嚴(yán)重影響水體溶解氧(DO)、溶解性有機(jī)碳(DOC)、營(yíng)養(yǎng)鹽的垂向運(yùn)移與分布[3-6]，進(jìn)而導(dǎo)致浮游藻類群落結(jié)構(gòu)組成及其多樣性在垂向上的差異性[7-10]. 穩(wěn)定的湖泊水體分層使得湖泊上層變溫層營(yíng)養(yǎng)鹽含量較低、光線充足、DO濃度較高，而底層均溫層營(yíng)養(yǎng)鹽濃度較高、光線匱乏、DO較低. 顯然，揭示水體垂向分層對(duì)深水湖泊生態(tài)系統(tǒng)的影響是了解深水湖泊生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)鍵.

水體細(xì)菌既是消費(fèi)者，又是生產(chǎn)者，在水生生態(tài)系統(tǒng)生物地球化學(xué)循環(huán)中發(fā)揮著不可替代的作用[11]，是深入了解湖泊等生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)鍵. 作為消費(fèi)者，水體細(xì)菌可以分解和利用水生生態(tài)系統(tǒng)中的有機(jī)物進(jìn)行異養(yǎng)生長(zhǎng)；作為生產(chǎn)者，它們能夠利用真核藻類所無(wú)法吸收的可溶性無(wú)機(jī)物，將之轉(zhuǎn)化為顆粒有機(jī)物進(jìn)行“二次生產(chǎn)”. 細(xì)菌合成的物質(zhì)和能量可被微型原生動(dòng)物(主要是異養(yǎng)鞭毛蟲(chóng)和纖毛蟲(chóng))所攝取而完成微食物環(huán)循環(huán)；而微型食植動(dòng)物的生物量又可通過(guò)橈足類等浮游動(dòng)物進(jìn)入傳統(tǒng)食物鏈[12-14]. 可見(jiàn)，了解湖泊水體垂向分層對(duì)水體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和功能的影響是了解深水湖泊生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)的關(guān)鍵.

目前有關(guān)深水湖泊水體分層對(duì)水體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成和多樣性的研究相對(duì)較少，有關(guān)機(jī)制仍不清楚. Paganin等[15]運(yùn)用變性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)技術(shù)，發(fā)現(xiàn)不同水層水體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成因水體環(huán)境因子的不同而異，而細(xì)菌物種多樣性(DGGE條帶數(shù))在各水層無(wú)明顯差異. 與之相反，Yang等[16]利用高通量測(cè)序技術(shù)在水庫(kù)中研究發(fā)現(xiàn)，均溫層水體細(xì)菌物種多樣性和豐富度均高于變溫層，這與Liu等[17]在高原深水湖泊中的研究結(jié)果一致. Yu等[4]的研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，水庫(kù)中均溫層水體細(xì)菌RNA∶DNA的比值顯著高于變溫層水體，指示變溫層和均溫層水體中水體細(xì)菌的群落功能可能存在差異. 然而，上述零星的報(bào)道只是對(duì)水體一個(gè)采樣點(diǎn)進(jìn)行的調(diào)查，未考慮水體細(xì)菌及水體環(huán)境的空間異質(zhì)性，深水湖泊水體垂向分層與對(duì)流引起的水體環(huán)境中可影響浮游細(xì)菌群落的上行因素、下行因素以及理化環(huán)境因素的空間分布差異勢(shì)必對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成和多樣性產(chǎn)生不同影響，但有關(guān)研究較少，相關(guān)機(jī)制仍不清楚，有待進(jìn)一步研究.

撫仙湖位于云南省玉溪市，南北長(zhǎng)31.5 km，東西向平均寬度6.7 km，水域面積212 km2，平均水深89.7 m，最大水深155 m，每年1、2 月水體垂向混合， 3-12月，溫躍層經(jīng)歷了一個(gè)形成、發(fā)展和消失的過(guò)程，垂向混合期只有一個(gè)， 水體分層時(shí)間較長(zhǎng)[18]，是研究水體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和功能對(duì)水體垂向分層響應(yīng)的理想場(chǎng)所. 已有研究結(jié)果表明，即使在水體垂向混合期，深水撫仙湖水體細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)和功能也存在垂向差異[19]. 但是，水體垂向分層期間，撫仙湖水體細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)組成和多樣性的空間分布特征目前仍不得而知. 本研究運(yùn)用Illumina Miseq高通量測(cè)序技術(shù)，結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析研究撫仙湖水體垂向分層期間水體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成和多樣性的水平、垂向分布特征及其與環(huán)境因子的相關(guān)性，以期了解深水湖泊水體垂向分層期間影響水體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成和多樣性變化的機(jī)制.

圖1 撫仙湖采樣點(diǎn)分布Fig.1 Distribution of sampling sites in Lake Fuxian

1 材料和方法

1.1 樣品的采集和預(yù)處理

本研究以北部湖區(qū)S1為起點(diǎn)，在撫仙湖縱截面上每隔5 km設(shè)置1個(gè)采樣點(diǎn)、共設(shè)置5個(gè)采樣點(diǎn)(S1～S5，圖1). 2013年8月25日在這5個(gè)采樣點(diǎn)采集水樣：在S1采樣點(diǎn)分9層采樣，分別在水面以下0.5、10、20、30、40、50、60、100、130 m各設(shè)置1個(gè)采樣層；其余4個(gè)采樣點(diǎn)只在水面以下0.5 m處采樣. 現(xiàn)場(chǎng)使用YSI6600多參數(shù)水質(zhì)監(jiān)測(cè)儀(YSI Inc., USA)原位測(cè)定各采樣點(diǎn)、不同水層水體的溫度(Temp)、pH、氧化還原電位(ORP)、電導(dǎo)率(Cond)、DO和濁度(Turb). 在各水層分別用采水器采集水樣3次放于水桶內(nèi)等體積混勻，然后用混合水樣將10 L白色塑料桶潤(rùn)洗后裝至9.8 L作為1個(gè)水樣，每層水樣采集3個(gè)平行樣，將水樣置于放有冰袋的保溫箱內(nèi)，在1 h內(nèi)帶回中國(guó)科學(xué)院撫仙湖高原深水湖泊研究站進(jìn)行測(cè)定.

1.2 樣品的處理

水體細(xì)菌樣本收集：約1 L水樣負(fù)壓(<20 m bar)過(guò)濾在孔徑為0.2 μm的聚碳酸酯膜(DuraporeTMMillipore，USA)上[21]以收集水體細(xì)菌. 在提取基因組DNA前，濾膜保存在-80℃超低溫冰箱中.

1.3 水體細(xì)菌DNA提取

用改進(jìn)的酚-氯仿提取、乙醇沉淀的方法從富集水體細(xì)菌的0.2 μm孔徑的聚碳酸酯膜上提取細(xì)菌基因組DNA[22].

1.4 細(xì)菌16S rRNA基因高通量測(cè)序

利用前端引物515F(5’-GTGCCAGCMGCCGCGG-3’)和末端引物806R (5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)對(duì)所有樣品基因組DNA進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增，并使用Illumina Miseq平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序[23]. PCR擴(kuò)增反應(yīng)使用的是Gene Amp PCR-System?9700 (Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA，USA)儀器，每個(gè)PCR反應(yīng)體系中共有25 μL，其中包括：0.4 μmol/L的前端引物和0.4 μmol/L的末端引物，10 ng的DNA模板，2.5 μL的10X AccuPrimeTMPCR 緩沖液Ⅱ，0.5單位的AccuPrimeTMTaq 高保真DNA聚合酶(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA). PCR擴(kuò)增條件為：初始溫度94℃保持1 min，后在94℃溫度下保持20 s(變性)；在53℃下保持25 s(退火)；在68℃下保持45 s(延伸)，該過(guò)程重復(fù)30次后，再在68℃下保持10 min，PCR反應(yīng)完成. 所有的樣品均進(jìn)行3次PCR擴(kuò)增，以減少PCR過(guò)程中生成產(chǎn)物的隨機(jī)誤差. 將3次的PCR產(chǎn)物聚集在一起，用瓊脂糖凝膠電泳法分析其純度，用QIAquick 凝膠提取試劑盒(Qiagen，Germantown，MD，USA)純化PCR 產(chǎn)物，并使用PicoGreen(BMG Labtech，Jena，Germany)進(jìn)行進(jìn)一步的純化. 在每個(gè)樣品的DNA克隆文庫(kù)純化后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(擴(kuò)增子)中添加PhiX(Illumina，San Diego，CA，USA)后，使用Illumina MiSeq平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序.

1.5 溫躍層相關(guān)特征描述

依據(jù)王銀珠和濮培民[24]對(duì)溫躍層相關(guān)特征的定義，本研究關(guān)注的溫躍層特征為：(1)溫躍層：溫度垂向梯度≥0.2℃/m 的水層；(2)溫躍層頂界(HT)及頂界溫度(TT)：自湖面向下溫度垂向梯度開(kāi)始≥0.2℃/m 的深度及該深度上的水溫，℃；(3)溫躍層底界(HB)及底界溫度(TB)：自湖面向下溫度垂向梯度開(kāi)始≤0.2℃/m 的深度及該深度上的水溫，℃；(4)溫躍層厚度(D)：溫躍層底界與頂界之差，即頂界與底界之間的距離，m，D=HT-HB；(5)溫躍層強(qiáng)度(θ): 溫躍層整層的平均溫度梯度，℃/m；θ=(TT-TB)/D；(6)最大溫度垂向梯度(θmax)及其所在深度(Hmax)：溫躍層內(nèi)最大的溫度垂向梯度，一般位于溫躍層中部溫度廓線的拐點(diǎn)處；(7)上溫躍層(ST)：溫躍層頂界到最大溫度垂向梯度所在深度內(nèi)的水層；(8)下溫躍層(SB)：最大溫度垂向梯度所在深度到溫躍層底界的水層.

1.6 數(shù)據(jù)分析

1.6.1 細(xì)菌16S rRNA基因序列處理及分析 在Galaxy Pipeline (http://zhoulab5.rccc.ou.edu:8080)上對(duì)Illumina MiSeq高通量測(cè)序獲得的16S rRNA基因原始序列(raw sequences)進(jìn)行質(zhì)量控制，將高質(zhì)量的序列進(jìn)行聚類，在97%的相似度下生成樣品的OTU(operational taxonomic unit)文件，并獲得OTU代表序列，使用SILVA138 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)每個(gè)OTU進(jìn)行細(xì)菌物種注釋；剔除在所有樣品中僅出現(xiàn)1次的OTU，計(jì)算每個(gè)樣品中的序列總數(shù)，以最少序列數(shù)對(duì)所有樣品進(jìn)行抽平，然后進(jìn)行后續(xù)數(shù)據(jù)分析[23]. 使用OTU數(shù)目[25]和Faith’s系統(tǒng)發(fā)育多樣性[26](Faith’s phylogenetic diversity，F(xiàn)aith’s PD)表征各樣品水體細(xì)菌的α多樣性.

1.6.2 統(tǒng)計(jì)分析 應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件，以單因子方差分析法(One-way ANOVA)分別對(duì)不同位點(diǎn)及S1采樣點(diǎn)不同水層環(huán)境因子、水體細(xì)菌群落及alpha多樣性的差異顯著性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，用SNK-q檢驗(yàn)法對(duì)有顯著性差異的樣本均數(shù)間進(jìn)行多重比較.

用R軟件(http://www.r-project.org)的Vegan 2.5-7 包[27]對(duì)水體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成進(jìn)行非線性多維標(biāo)度(nonmetric multidimensional scaling，NMDS)分析，對(duì)于不同位點(diǎn)及S1采樣點(diǎn)不同水層水體的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成差異性進(jìn)行ANOSIM分析；降趨對(duì)應(yīng)分析(detrended correspondence analysis，DCA)結(jié)果顯示，樣品矩陣第一、二軸的長(zhǎng)度均大于2，因此本研究假定物種與環(huán)境間具有非線性的相關(guān)關(guān)系，選擇典范對(duì)應(yīng)分析(canonical correspondence analysis, CCA)來(lái)分析環(huán)境因子與細(xì)菌群落組成變化的相關(guān)性.

2 結(jié)果

2.1 撫仙湖水體分層期間水體理化因子的空間分布特征

本研究中，采樣點(diǎn)S1現(xiàn)場(chǎng)測(cè)定結(jié)果顯示該點(diǎn)水體存在明顯的分層現(xiàn)象：溫躍層在水深15～40 m 處，溫度由22.64℃驟降至14.67℃；溫躍層強(qiáng)度為0.32℃/m；最大垂向梯度為1.27℃，發(fā)生在22 m水深處；上、下溫躍層分別在水深15～22、22～40 m 處(圖2a). 該采樣點(diǎn)的pH、電導(dǎo)率的垂向變化趨勢(shì)與溫度相同，均在溫躍層隨著水深的增加逐漸降低，分別從8.7、0.298 mS/cm降低到8.2、0.258 mS/cm，此后在均溫層分別維持在8.10、0.256 mS/cm(圖2b，d)；DO濃度的垂向變化趨勢(shì)與此類似，但其從表層的8.70 mg/L降低到上溫躍層底部的20 m處的4.5 mg/L后逐漸升高到56 m處的6.69 mg/L，之后有所降低，但維持在4.7 mg/L的水平(圖2c). 而ORP的變化趨勢(shì)與溫度相反，在溫躍層從-160 mV逐漸升高到-114 mV后趨于穩(wěn)定(圖2e).

圖2 撫仙湖S1采樣點(diǎn)水體現(xiàn)場(chǎng)測(cè)定的環(huán)境因子的垂向差異 (灰色、斜線陰影分別表示上、下溫躍層所在位置)Fig.2 The vertical difference of environmental factors measured in situ at the S1 site in Lake Fuxian (The gray and slant lines shades indicate the location of the upper and lower thermocline, respectively)

圖3 撫仙湖各采樣點(diǎn)水體理化環(huán)境因子的差異(同一環(huán)境因子柱狀圖頂端不同字母表示多重比較 (SNK-q)檢驗(yàn)具有顯著性差異；灰色、斜線陰影分別表示上、下溫躍層所在位置)Fig.3 Differences in physical and chemical environmental factors among the sites in Lake Fuxian (Different letters at the top of the histogram of the same environmental factor indicate that the multiple comparison (SNK-q) test is significantly different. The gray and slant lines shades indicate the location of the upper and lower thermocline, respectively)

2.2 撫仙湖水體分層期間水體細(xì)菌多樣性及群落結(jié)構(gòu)組成的空間分布特征

2.2.1 撫仙湖水體細(xì)菌alpha多樣性的水平、垂向分布特征 本研究結(jié)果表明，撫仙湖水體細(xì)菌alpha多樣性(OTU數(shù)、PD值)在水平、垂向上均存在顯著性差異，且在水平方向上alpha多樣性顯著低于垂向上的多樣性(圖4). 單因素方差分析表明，在水平方向上，S5點(diǎn)水樣中水體細(xì)菌的OTU數(shù)、PD值(分別為1960、83.66)均高于其余4采樣點(diǎn)的表層水樣，而S3點(diǎn)水體細(xì)菌alpha多樣性最低(P<0.01；圖4a，b). 在垂向上，S1點(diǎn)alpha多樣性隨著采樣水深的增加呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)：水體細(xì)菌alpha多樣性在表層(0.5 m水層)最低(分別為1653、61.42；圖4a，b)，10、20 m水層次之，在30和40 m水層最高(OTU數(shù)分別為2411、2409，PD值分別為101.74、97.81；圖4a，b).T檢驗(yàn)結(jié)果表明，水體細(xì)菌在水平方向(S1～S5表層水樣)的OTU數(shù)、PD值均顯著低于垂向(S1點(diǎn)各水層水樣)(P<0.01；圖4c，d).

圖4 撫仙湖水體細(xì)菌alpha多樣性的水平、垂向分布特征(同一alpha多樣性指數(shù) 柱狀圖頂端不同字母表示多重比較(SNK-q)(a和b)或T檢驗(yàn)(c和d)具有顯著性差異)Fig.4 Horizontal and vertical distribution differences of bacterioplankton alpha diversity in Lake Fuxian (Different letters at the top of the histogram of the same alpha diversity index indicate that the multiple comparison (SNK-q) (a and b) test or T-test (c and d) are significantly different)

2.2.2 撫仙湖水體細(xì)菌beta多樣性的水平、垂向分布特征 水體細(xì)菌16S rRNA基因組成在不同采樣點(diǎn)、同一采樣點(diǎn)的不同水層間均存在差異，且后者差異較大(圖5). 基于OTU水平和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的水體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成的NMDS分析均表明：同一樣品的不同重復(fù)間的差異均小于不同樣品間的差異；相對(duì)于垂向水樣，表層水樣間的組成更相似；S1點(diǎn)20 m水層水體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成顯著有別于其它樣品(圖5a，b). T檢驗(yàn)表明，基于OTU水平和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的水體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成在水平方向的差異(分別為24.07%±0.57%和46.93%±0.23%)均顯著低于垂向(分別為51.33%±0.28%和52.19%±0.26%；P< 0.01；圖5c，d).

圖5 撫仙湖水體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成的非度量多維尺度(NMDS；a和b)圖及其在水平、 垂向上差異性的比較(c和d)(a和c：基于OTU；b和d：基于系統(tǒng)發(fā)育樹(shù). 同一群落結(jié)構(gòu)組成差異柱狀圖頂端不同字母表示T檢驗(yàn)具有顯著性差異)Fig.5 Non-metric multi-dimensional scale (NMDS; a and b) diagrams of the bacterioplankton community composition in Lake Fuxian and their differences in the horizontal and vertical directions (c and d) (a and c: based on OTU; b and d: Based on phylogenetic tree. Different letters at the top of the histogram of the same bacterioplankton community dissimilarity index indicate that the T-test are significantly different)

2.2.3 撫仙湖水體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成的水平、垂向分布特征 通過(guò)對(duì)39個(gè)水體細(xì)菌樣品16S rRNA基因高通量測(cè)序原始數(shù)據(jù)的拼接、過(guò)濾、去嵌合體、剔除僅出現(xiàn)1次OTU等處理后，共獲得1535377條高質(zhì)量序列且平均長(zhǎng)度為250 bp. 測(cè)序條數(shù)最少的樣品含有20808條，最多的樣品含有58217條. 將所有樣品resample至一個(gè)相同測(cè)序深度(每個(gè)樣品20808條序列)，共獲得10165個(gè)有97%相似度的OTUs. 經(jīng)比對(duì)分析，所有的高質(zhì)量序列經(jīng)resample之后，765579(94.34%)條序列可分類至門水平. 在門水平上，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)在水平、垂直水樣間均存在較高的相似性，優(yōu)勢(shì)菌群主要包括：放線菌門(Actinobacteria)(所有序列的36.59%)、變形菌門(Proteobacteria)(32.67%)、藍(lán)藻門(Cyanobacteria)(11.10%)、擬桿菌門(Bacteroidetes)(7.55%)、浮霉菌門Planctomycetes)(2.48%)、疣微菌門(Verrucomicrobia)(1.24%)、綠彎菌門(Chloroflexi)(1.19%)、厚壁菌門(Firmicutes)(0.63%)、裝甲菌門(Armatimonadetes)(0.27%)、衣原體門(Chlamydiae)(0.22%)等18大類群(圖6a). 各樣品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成最大差異表現(xiàn)在綠彎菌門在S1點(diǎn)60、100和130 m水層中的相對(duì)豐度較高，分別為6.64%、4.36%和4.26%，而其在其余各樣品中的相對(duì)豐度均低于0.1%(圖6a).

相對(duì)于門水平，各水樣水體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)在目(order)水平的組成差異較大，其相對(duì)豐度在水平、垂向水樣間均存在差異，且在垂向上的差異相對(duì)較大. 本研究結(jié)果表明，各水樣的水體細(xì)菌主要由相對(duì)豐度大于0.5%的菌群的組成，其相對(duì)豐度之和平均為89.62%(83.82%～93.22%；圖6b). 這些細(xì)菌主要包括：放線菌目(Actinomycetales)、鞘脂桿菌目(Sphingobacteriales)、未確定分類的綠彎菌綱(unidentified Chloroflexi)、未確定分類的藍(lán)細(xì)菌(unidentified Cyanobacteria)、芽孢桿菌目(Bacillales)、浮霉菌目(Planctomycetales)、柄桿菌目(Caulobacterales)、紅桿菌目(Rhodobacterales)、紅螺菌目(Rhodospirillales)、伯克氏菌目(Burkholderiales)、未確定分類的beta變形菌(unidentified Betaproteobacteria)、未確定分類的gamma 變形菌(unidentified Gammaproteobacteria)、假單胞菌目(Pseudomonadales)等18個(gè)目(圖6b).

圖6 撫仙湖不同采樣點(diǎn)水體細(xì)菌群落在門(a)和目(b)水平上的組成Fig.6 The composition of bacterioplankton communities at phylum level (a) and order level (b) at the different sites in Lake Fuxian

在本研究中的5個(gè)采樣點(diǎn)表層水樣中，水體細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)菌群類似，只是具體的菌群的相對(duì)豐度存在差異：Actinomycetales的相對(duì)豐度最高，其平均占39.75%，在點(diǎn)S3中最高(48.34%)，在S5中最低(26.87%)；其次為unidentified Cyanobacteria，其相對(duì)豐度平均為16.04%，其相對(duì)豐度最大值出現(xiàn)在S5點(diǎn)(20.42%)，其最低值出現(xiàn)在S1點(diǎn)(8.15%)；再次為Burkholderiales，其相對(duì)豐度平均為9.17%，其相對(duì)豐度最大值出現(xiàn)在S5點(diǎn)(12.17%)，其最低值出現(xiàn)在S3點(diǎn)(6.77%)；Sphingobacteriales 在表層水樣中的相對(duì)豐度平均為6.41%，其最大值出現(xiàn)在S1點(diǎn)(8.72%)，其最低值出現(xiàn)在S3點(diǎn)(3.94%).

與表層水樣相比，S1點(diǎn)垂向水樣中水體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成在優(yōu)勢(shì)菌群的相對(duì)豐度及其類別上均存在較大變化. 10和20 m處的水體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成變化最大：S1點(diǎn)10 m水層水體細(xì)菌相對(duì)豐度增加最大的是隸屬于gamma 變形菌的Pseudomonadales(從0.08%增加到17.89%)，其次是隸屬于alpha 變形菌的Caulobacterales(從0.48%增加到2.46%)；而unidentified Cyanobacteria、Actinomycetales、Sphingobacteriales、Burkholderiales的相對(duì)豐度卻有所降低，分別降低了10.36%、2.78%、0.87%、0.24%(圖6b). S1點(diǎn)20 m水層Pseudomonadales的相對(duì)豐度高達(dá)31.66%，成為該樣品相對(duì)豐度最大的菌群；Caulobacterales的相對(duì)豐度增加了近9倍(從0.48%增加到3.93%)，酸微菌目(Acidimicrobiales)的相對(duì)豐度增加了近1倍(從3.04%增加到6.22%)(圖6b). 與此相反，Actinomycetales的相對(duì)豐度(8.49%)減小了31.26%，Burkholderiales和Sphingobacteriales的相對(duì)豐度(分別為3.01%、0.49%)分別降低了6.16%、5.93%(圖6b). 在40 m及以下的水層中，變化最大的是60、100和130 m水層樣品中的unidentified Chloroflexi的相對(duì)豐度(4.24%～6.23%)明顯高于其它水層樣品(最高為0.04%)(圖6b). 在其它的優(yōu)勢(shì)菌群中，Actinomycetales再次成為相對(duì)豐度最高的水體細(xì)菌(均大于26.77%)；其次為Burkholderiales，其相對(duì)豐度為6.97%～14.14%；再次為Sphingobacteriales，其相對(duì)豐度為4.48%～8.53%；Caulobacterales的相對(duì)豐度也顯著大于表層水樣(2.15%～6.74%)(圖6b).

圖7 撫仙湖環(huán)境因子與水體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化的典范對(duì)應(yīng)分析Fig.7 Canonical correspondence analysis of environmental factors and changes in the bacterioplankton community compositions in Lake Fuxian

3 討論

3.1 撫仙湖水體分層期間水體理化因子在垂向與水平方向上的差異

本研究發(fā)現(xiàn)，撫仙湖在水體分層期間，水體理化因子的垂向差異大于水平方向的差異. 例如，垂向上最大的溫度、pH以及DO濃度的差別分別為9.23℃、0.92、4.26 mg/L，而在距離跨度近20 km的不同采樣點(diǎn)表層水體間相應(yīng)環(huán)境因子的最大差別分別為1.22℃、0.36、0.66 mg/L(圖2，3). 這與蘇黎世湖(最大水深136 m)在水體分層期間的觀測(cè)結(jié)果一致[35].

3.2 撫仙湖水體分層期間水體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成在垂向上的變化

已有的結(jié)果表明，大型深水湖泊水體分層期間水體理化環(huán)境因子空間上的差異導(dǎo)致水體細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成在變溫層、溫躍層和均溫層中的多樣性分布[33,37-38]. 本研究也發(fā)現(xiàn)類似的變化趨勢(shì)，但是撫仙湖各水層的優(yōu)勢(shì)菌群與這些湖泊不盡相同. 在撫仙湖水體分層期間，變溫層水體細(xì)菌主要由Actinomycetales、unidentified Cyanobacteria、Burkholderiales和Sphingobacteriales組成. Actinobacteria在深水湖泊不同水層均被發(fā)現(xiàn)且在變溫層和溫躍層中的相對(duì)豐度較高[33,37-38]，本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)該細(xì)菌門中的Actinobacteria在撫仙湖各水層中均被發(fā)現(xiàn)且在變溫層中的相對(duì)豐度較高(圖6b)，這與利用宏基因測(cè)序技術(shù)在水體完全混合期對(duì)撫仙湖水體細(xì)菌的研究結(jié)果一致[19]. Actinobacteria在撫仙湖中存在這種分布特征的原因可能是一些Actinobacteria 種群具有可以吸收陽(yáng)光的放線菌視紫紅質(zhì)[39]且體積小(體表面積與體積的比率大)，可以有效利用水體較低的營(yíng)養(yǎng)鹽等優(yōu)勢(shì)得以迅速繁殖的緣故[37,40]. Cyanobacteria不僅可以進(jìn)行光合作用，而且具有固氮的能力，其在不同營(yíng)養(yǎng)水平的深水湖泊和水庫(kù)的變溫層中被大量發(fā)現(xiàn)[4,33,35,41-42]. 已有的研究表明，Burkholderiales不僅在表層水體是優(yōu)勢(shì)菌群[41]，而且其在DO濃度差別不大的不同水體中也大量存在[43]. 類似地，Burkholderiales在撫仙湖在不同水體的相對(duì)豐度均較高，這可能與其生態(tài)位較寬有關(guān)[43]. Sphingobacteriales可以適應(yīng)低營(yíng)養(yǎng)鹽、低DOC濃度的水體環(huán)境[44]，因此其成為深水湖泊——撫仙湖和Grand 湖表層水體中的優(yōu)勢(shì)菌群[45].

隨著水體深度的增加，撫仙湖溫躍層中水體細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)組成也發(fā)生了變化. 其中變化最明顯的是Pseudomonadales迅速成為優(yōu)勢(shì)種群(在10和20 m水層處的平均相對(duì)豐度為24.77%，圖6b). 一些Pseudomonadales菌群具有多種代謝能力，可以生活在多種水生真核生物的體表或體內(nèi)，如魚(yú)類[46]、淡水海綿[47]、淡水浮游甲殼動(dòng)物[48]，而且不同的Pseudomonadales菌群在浮游甲殼動(dòng)物從生長(zhǎng)到死亡、分解過(guò)程中表現(xiàn)出不同的種群增長(zhǎng)趨勢(shì)[49]. 有趣的是，本研究發(fā)現(xiàn)，Pseudomonadales相對(duì)豐度較高的水層(10、20 m)中浮游甲殼動(dòng)物豐度也很高(未發(fā)表數(shù)據(jù)). 然而，本研究中的Pseudomonadales菌群是否與浮游甲殼動(dòng)物有關(guān)，需要利用宏基因組、原位熒光探針(fluorescenceinsituhybridization followed by catalyzed reporter deposition, CARD-FISH)等分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)一步研究.

與表層和溫躍層水體相比，撫仙湖有氧均溫層水體的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成發(fā)生了顯著變化，其中既有均溫層特有細(xì)菌種群的出現(xiàn)，也有在上層水體中存在的細(xì)菌種群的相對(duì)豐度的較大改變. 這與在不同溫度、不同營(yíng)養(yǎng)水平的有氧均溫層中的研究結(jié)果一致[38]. Okazaki等[38]研究發(fā)現(xiàn)，Chloroflexi是普遍存在于深水湖泊有氧均溫層水體中的優(yōu)勢(shì)種群. 與此類似，本研究也發(fā)現(xiàn)unidentified Chloroflexi在撫仙湖60 m及以下的水層中大量存在. 更多的研究表明，一些在表層和溫躍層水體中出現(xiàn)的細(xì)菌是均溫層水體中的優(yōu)勢(shì)菌群[38,50-51]. 這一方面可能是因?yàn)檫@些細(xì)菌種群功能多樣、世代時(shí)間短，例如本研究中的Actinomycetales[40,52]和Burkholderiales[43]；另一方面可能是因?yàn)橐恍└街?xì)菌隨著上層水體有機(jī)物碎屑以及浮游生物殘?bào)w在均溫層的累積[35-36]而富集. 例如，與浮游甲殼動(dòng)物死亡分解相關(guān)的Pseudomonadales菌的相對(duì)豐度在本研究的100和130 m水層樣品顯著升高(圖6b). 然而，必須注意的是，這些在目水平上相同的細(xì)菌不一定完全相同，最新的研究發(fā)現(xiàn)，即使隸屬于同一OTU的細(xì)菌間也存在功能及基因水平的差異，即同一OTU內(nèi)部存在微多樣性[38,50,53].

3.3 撫仙湖水體分層期間水體細(xì)菌多樣性在垂向與水平方向上的差異比較

盡管本研究中表層采樣點(diǎn)間的水平距離(至少5 km)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于分層采樣點(diǎn)不同水層間的距離(10～130 m)，但是水體細(xì)菌多樣性(alpha和beta多樣性)在垂向上的差異明顯大于水平方向上的差異(圖5，6). 深水湖泊水體分層期間，水體細(xì)菌多樣性的變化主要受水體分層導(dǎo)致的上行因素如DOC濃度和組成，下行因素如捕食作用，以及環(huán)境因素如水體溫度、光照、DO等的影響[4,16,18]. 而且已有的研究發(fā)現(xiàn)，不同湖泊中細(xì)菌多樣性的差異與水體環(huán)境因子的差異呈正比[23]. 本研究發(fā)現(xiàn)，在撫仙湖水體分層期間水體理化因子在垂向上的差異顯著大于在水平方向上的差異(圖2，3)，這可能是導(dǎo)致水體細(xì)菌在垂向上多樣性大于水平方向上多樣性的主要原因(圖5). 此外，在冬季對(duì)撫仙湖北部一個(gè)采樣點(diǎn)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，即使在水體完全混合期，水體理化因子及細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成也存在垂向上的差異[19]. 由此看來(lái)，撫仙湖水體常年無(wú)法完全混合，這不僅會(huì)阻礙水體細(xì)菌的垂向混合，而且始終不混合的下層水體中嚴(yán)苛的環(huán)境條件將對(duì)細(xì)菌產(chǎn)生持續(xù)選擇作用，進(jìn)一步維持細(xì)菌多樣性的垂向差異. 然而，影響不同水層細(xì)菌間多樣性差異的主要環(huán)境因子卻有所差異. 例如，DO濃度是導(dǎo)致表層水體與S1點(diǎn)30 m處水層細(xì)菌間的差異的主要環(huán)境因素，而DOC、營(yíng)養(yǎng)鹽濃度是導(dǎo)致S1點(diǎn)其余水層細(xì)菌間差異的主要環(huán)境因子(圖7). 在海洋生態(tài)系統(tǒng)中的研究發(fā)現(xiàn)，隨著水深的增加溶解性有機(jī)物的可利用性較低，進(jìn)而導(dǎo)致同一屬內(nèi)細(xì)菌在垂向的生態(tài)位分化[54]. 然而，撫仙湖水體DOC組成的垂向差異及其與細(xì)菌群落多樣性的關(guān)系有待進(jìn)一步研究.