文鑫鑫，萬(wàn)力華，龍 瀅

(黔東南州食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，貴州 凱里 556000)

茯神(Poria cum Radix Pini)為貴州省的民族用藥，藥用部位為茯苓干燥菌核中間抱有松枝或松根的白色部分[1]。國(guó)內(nèi)對(duì)茯神化學(xué)成分的研究歷史已有二十多年，目前從茯神中分離鑒定出的特征化合物有幾十種，主要成分是多糖及三萜類化合物，多糖成分主要是茯苓多糖，三萜類成分主要有茯苓酸等[1]?！顿F州省中藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》收載該品種，標(biāo)準(zhǔn)建立時(shí)間較早，方法簡(jiǎn)單，僅有性狀檢查，橫截面及粉末的顯微鑒別及理化反應(yīng)。本次試驗(yàn)根據(jù)藥典方法檢查顯微、水分等常規(guī)項(xiàng)目，重點(diǎn)嘗試建立含量測(cè)定的方法，因國(guó)內(nèi)尚無(wú)茯神中三萜類成分茯苓酸的法定標(biāo)準(zhǔn)品，本次試驗(yàn)新增以多糖為檢測(cè)指標(biāo)的含量測(cè)定方法。

1 儀器和材料

1.1 儀器

萊卡DM2500顯微鏡和LAS V3.8顯像系統(tǒng)，Shimadzu UV-2600、UVProbe2.52工作站，Shimadzu UV-2700、UVprobe2.43工作站，數(shù)顯式電熱恒溫六孔水浴鍋，XPE205電子天平，數(shù)控超聲機(jī)器[7]。

1.2 試劑試藥

D-無(wú)水葡萄糖(中檢院 110833-201707 含量99.9%)、硫酸(重慶川東化工(集團(tuán))有限公司20160401)、蒽酮(天津市科密歐化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心 20061021)均為分析純；氯仿、環(huán)己烷、乙醚等均為國(guó)藥集團(tuán)采購(gòu)，為分析純；硅膠G板采購(gòu)于青島海洋、勝海；濾紙為定性濾紙。本次所有實(shí)驗(yàn)樣品均通過(guò)貴州中醫(yī)大(原貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院)孫慶文教授準(zhǔn)確鑒定為茯神，憑證標(biāo)本存貴州省食品藥品檢驗(yàn)所。

2 方法與結(jié)果

2.1 顯微鑒別

松枝橫切面：松枝外側(cè)帶有灰白色菌絲。晚材由3～5列管胞或纖維管胞組成，類長(zhǎng)方形或長(zhǎng)橢圓形，切向延長(zhǎng)，長(zhǎng)25～60 μm，寬約35 μm，壁厚10～15 μm，木化。早材管胞呈多邊形或類圓形，直徑50～90 μm，壁厚8～12 μm，木化。射線寬1～2列細(xì)胞，樹(shù)脂道類圓形，直徑150～400 μm，上皮細(xì)胞已脫落(圖1)。

圖1 松枝橫切面顯微鑒別Fig.1 Microscopic identification of pine branch cross section

粉末顯微特征：粉末灰黃白色。管胞眾多，直徑50～90 μm，厚8～15 μm，具緣紋孔呈兩行相對(duì)排列或一行單列，紋孔直徑20～30 μm。纖維管胞直徑35～60 μm，具單斜紋孔，孔徑15～30 μm。射線薄壁細(xì)胞長(zhǎng)條形。菌絲分有節(jié)菌絲和無(wú)節(jié)菌絲，極少有棕色菌絲。色素塊黃棕色或紅棕色(圖2)。

圖2 粉末顯微鑒別Fig.2 Microscopic identification of powder

2.2 薄層色譜

稱取茯神粉末約1 g，加入乙醚50 mL，超聲處理約10 min，濾過(guò)，濾液在水浴上蒸干，殘?jiān)眉状? mL使溶解，即得供試品[8]。照藥典薄層色譜法[5]試驗(yàn)，取一張活化好的硅膠G板，點(diǎn)樣量4 μL，展開(kāi)劑為：三氯甲烷-環(huán)己烷-醋酸乙酯-甲酸，展開(kāi)劑比例為(V∶V)(7∶2∶2∶0.2)，顯色劑為含1%香草醛的硫酸溶液，噴灑均勻，105 ℃加熱至斑點(diǎn)清晰。供試品在與對(duì)照藥材相同的位置顯相同顏色的斑點(diǎn)，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 不同批樣品薄層色譜圖Fig.3 TLC of different samples

2.3 水分、灰分和浸出物

2.3.1 水分

依據(jù)藥典[5]水分測(cè)定法的第二法，分別對(duì)不同產(chǎn)地的三批次茯神藥材樣品測(cè)定水分。其值為12.5%～13.1%，均值為12.7%(結(jié)果見(jiàn)表1)。茯神不含揮發(fā)性物質(zhì)，所以本次試驗(yàn)水分的測(cè)定方法選用了烘干法。

2.3.2 總灰分

依據(jù)藥典[5]四部通則，分別對(duì)不同產(chǎn)地三批次茯神藥材樣品測(cè)定總灰分。其值為0.25%～0.55%，均值為0.366%(結(jié)果見(jiàn)表1)。

2.3.3 浸出物

依據(jù)藥典[5]四部通則，以其中一批茯神(FS001)為樣品，分別用不同含量乙醇作為溶劑，對(duì)冷浸、熱浸法進(jìn)行比較，根據(jù)測(cè)定結(jié)果，選稀乙醇作溶劑。測(cè)定了3批樣品，以干燥品計(jì)算浸出物的含量，其值為5.4%～5.6%，均值為5.5%(結(jié)果見(jiàn)表1)。

表1 不同批號(hào)的茯神水分、總灰分、浸出物Tab.1 The moisture，total ash，and extracts of different samples

2.4 含量測(cè)定

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

精密稱取對(duì)照品(D-無(wú)水葡萄糖)適量，加水溶解并稀釋成每1 mL中含無(wú)水葡萄糖約0.1 mg[7]。

2.4.2 樣品溶液的制備

樣品打粉過(guò)2號(hào)篩，精密稱取約0.9 g，置具塞錐形瓶中，以80%的乙醇溶液為溶劑，加入50 mL溶劑后，于水浴中回流2 h，用濾紙趁熱過(guò)濾，殘?jiān)脽岬娜軇┫礈?次，每次20 mL，將殘?jiān)盀V紙放入具塞錐形瓶中，加入50 mL的水，水浴中回流2 h，趁熱過(guò)濾至250 mL的容量瓶中，用熱水洗滌殘?jiān)湾F形瓶3次，每次20 mL，洗液并入容量瓶中，待溶液冷卻至室溫，用水稀釋至刻度，即得。同法制備空白溶液。

測(cè)定法：取干燥的具塞試管，精密量取樣品溶液1 mL加入試管中，加水至2.0 mL，搖勻，精密量取6 mL含0.15%蒽酮的硫酸溶液，快速加入，搖勻，在80 ℃水浴中保溫15 min后，再放置于0 ℃水浴中10 min，取出即得[7]。檢測(cè)波長(zhǎng)為624 nm，從線性方程上得出葡萄糖的含量[7]。

2.4.3 線性考察

取具塞試管6支，分別精密加入2.4.1項(xiàng)下溶液0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL、1.0 mL、1.2 mL，照2.4.2項(xiàng)下的方法，自“加水至2.0 mL”起，標(biāo)準(zhǔn)曲線用Origin 2018數(shù)據(jù)軟件繪得，橫坐標(biāo)為對(duì)照品葡萄糖的濃度(mg/L)，縱坐標(biāo)為吸光度A，回歸方程為A=0.0131x+0.03333(R2=0.999)，結(jié)果表明：該實(shí)驗(yàn)條件下葡萄糖在10.86～65.15 mg/L的范圍線性關(guān)系好[7]。

2.4.4 重復(fù)性

分別精密稱取6份供試品(編號(hào)FS003)約0.9 g，按2.4.2項(xiàng)下操作。經(jīng)計(jì)算得多糖含量分別為：3.15%、3.15%、3.15%、3.20%、3.20%、3.20%，平均值為3.17%，RSD為0.81%。

圖4 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.4 Glucose standard curve

2.4.5 穩(wěn)定性

取2.4.4項(xiàng)下溶液，同法檢測(cè)，每隔1 h讀數(shù)3次，取平均值，實(shí)驗(yàn)表明，顯色后供試品的溶液6 h內(nèi)吸光度差異不大，RSD為1.21%。

2.4.6 回收率

精密稱取本品(編號(hào)FS003)約0.44 g，各6份，各精密加入確定濃度的對(duì)照品溶液，按2.4.2項(xiàng)下操作，結(jié)果見(jiàn)表2，均值為101.4%，RSD為1.69%[7]。

表2 加樣回收率結(jié)果Tab.2 Results of spiked recovery tests

2.5 樣品測(cè)定

分別稱取3批次茯神樣品約0.88 g各2份，按照2.4.2項(xiàng)下制備供試品溶液，由2.4.3標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算葡萄糖含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 不同批號(hào)樣品含量測(cè)定Tab.3 Content determination results of different samples

3 討論

1)薄層鑒別參考了茯苓藥材的藥典方法，本方法選用極性低的有機(jī)溶劑乙醚提取茯神三萜類成分中極性較低的成分，避免了提取出的成分過(guò)多過(guò)雜。原方法的展開(kāi)劑中含有甲苯，因?yàn)榧妆降亩拘裕Ｍx擇毒性較低的有機(jī)溶劑替代，通過(guò)對(duì)茯神的展開(kāi)劑進(jìn)行了比較和研究，選擇用三氯甲烷和環(huán)己烷的組合替代甲苯，該組合的斑點(diǎn)分離度好，顯色清晰，最終選用了三氯甲烷-環(huán)己烷-乙酸乙酯-甲酸(v∶v，7∶2∶2∶0.2)作為茯神薄層定性鑒別的展開(kāi)劑。本試驗(yàn)同時(shí)考察了不同品牌廠家(青島勝海，青島海洋化工)、不同環(huán)境溫度(5 ℃，20 ℃，35 ℃)、不同環(huán)境濕度(28%，52%，88%)等對(duì)茯神薄層鑒別分離效果的影響，結(jié)果表明這些因素對(duì)分離效果影響不大，該方法分離度好、簡(jiǎn)單、耐用性好。

2)本文關(guān)于茯神多糖含量測(cè)定對(duì)多糖常用的檢測(cè)方法蒽酮比色法和苯酚比色法進(jìn)行比較研究，蒽酮比色法的線性、精密度等方面很理想，能很好地滿足茯神含量測(cè)定的要求。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)考察了提取溶劑、提取方法、提取時(shí)間等，以及蒽酮硫酸的濃度、顯色時(shí)間、溫度，最終確定最優(yōu)含量測(cè)定方法。不同產(chǎn)地的茯神含量相對(duì)穩(wěn)定，差異不大。

3)本文對(duì)3批次的茯神質(zhì)量進(jìn)行了顯微鑒別、薄層色譜鑒別、多糖含量測(cè)定、水分等項(xiàng)目的考察，結(jié)果顯示方法可行，可用作茯神的地方質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制。