牛亞楠， 高 宇， 何倚帆， 李克敏， 李瑞涵， 張文龍， 張軒萍， 師銳贊*

(1)山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理教研室，山西 榆次 030000；2)山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院， 太原 030001)

乳腺癌是嚴重危害女性健康的惡性腫瘤，多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)是導(dǎo)致其化療失敗、復(fù)發(fā)和預(yù)后差的重要原因。其耐藥機制復(fù)雜多樣，與之緊密相關(guān)的是ATP結(jié)合盒(ATP-binding cassette, ABC)轉(zhuǎn)運蛋白超家族[1,2]。其中，ABCG2(ATP-binding cassette G2)作為一種典型的ABC轉(zhuǎn)運蛋白質(zhì)，通過外排多種化療藥物介導(dǎo)多種腫瘤(包括乳腺癌)的多藥耐藥[3-5]。但目前國內(nèi)外對ABCG2的調(diào)控機制有待深入研究，且缺少能有效應(yīng)用于臨床的抑制劑。因此，探究ABCG2介導(dǎo)的多藥耐藥的分子機制對改善乳腺癌化療耐藥有重要意義。

上皮細胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule, EpCAM)與細胞黏附、遷移和增殖等功能均相關(guān)，在多種惡性上皮腫瘤中異常表達。EpCAM已被證實與乳腺癌的轉(zhuǎn)移、預(yù)后和耐藥相關(guān)[6]，但其在ABCG2介導(dǎo)的乳腺癌耐藥中的機制尚未闡明。細胞間緊密連接與腫瘤的多細胞耐藥表型有關(guān)[7]，密封蛋白(claudins)家族是組成細胞間緊密連接結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵蛋白質(zhì)，EpCAM與密封蛋白家族(特別是claudin-7和claudin-1)相互作用，調(diào)節(jié)人結(jié)腸癌細胞的緊密連接，促進腫瘤進展和耐藥[8,9]。MCF-7/MX細胞是米托蒽醌 (mitoxantrone, MX)誘導(dǎo)篩選的、僅高表達ABCG2的耐藥株[10]。本研究選用人乳腺癌敏感株MCF-7和耐藥株MCF-7/MX，探究EpCAM在ABCG2介導(dǎo)的乳腺癌中的耐藥作用，以及是否通過經(jīng)典的緊密連接蛋白密封蛋白1影響細胞間緊密連接進而影響耐藥。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 人乳腺癌米托蒽醌敏感株MCF-7和耐藥株MCF-7/MX均由美國國家癌癥研究所Cowan博士饋贈。

1.1.2 試劑 米托蒽醌 (mitoxantrone，MX，Sigma)；RPMI-1640培養(yǎng)基(HyClone)；胎牛血清(Cellmax)；ABCG2單抗、EpCAM多抗、β-肌動蛋白(β-actin)單抗、FITC-羊抗小鼠IgG、CY3-羊抗兔IgG 等均購自武漢Boster；密封蛋白1多抗(ABclonal)；EpCAM單抗(湖北Servicebio)；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒(美國Invitrogen)；CCK8檢測試劑盒(Cell Counting Kit-8)、DAPI染色液、BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒、抗熒光衰減封片劑等均購于Boster；ECL底物化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒(美國Bio-Rad)；辣根酶標記山羊抗小鼠/兔 IgG(北京中杉金橋)；siRNA序列設(shè)計及合成(Public Protein/Plasmid Library，PPL0038-3a/b/c)，靶向干擾引物序列見Table 1。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) MCF-7和米托蒽醌耐藥株MCF-7/MX培養(yǎng)于RMPI-1640完全培養(yǎng)基(10% FBS)，放置于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱。為維持多藥耐藥表型，MCF-7/MX細胞在添加400 ng/mL MX的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，于實驗前2周轉(zhuǎn)移到無藥物培養(yǎng)基中。

1.2.2 siRNA轉(zhuǎn)染 將生長狀態(tài)良好的MCF-7/MX細胞稀釋為1×105個/ mL，接種至6孔板，2.5 mL/孔，輕搖使細胞均勻分布，匯合度在75%左右，用LipofectamineTMDNA/ RNA 試劑盒轉(zhuǎn)染siRNAEpCAM 和陰性對照siNC，待72 h后用Western印跡法鑒定干擾效果。

1.2.3 細胞形態(tài)學(xué)變化 將長勢良好的各轉(zhuǎn)染細胞接種在6孔板中，并在37 ℃，5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。觀察細胞形態(tài)并記錄100倍鏡下圖像。

1.2.4 細胞毒性分析 取對數(shù)生長期細胞，分別以90 μL/孔細胞懸液(含1.5×103個細胞)接種于96 孔板孔內(nèi)(空白對照中只加培養(yǎng)基)，培養(yǎng)24 h，每孔加10 μL不同濃度米托蒽醌 (mitoxantrone，MX)(陰性和空白對照組加入等量生理鹽水)，每組設(shè)6個復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)70 h，每孔加 10 μL CCK8溶液。37 ℃避光孵育2 h，用酶標儀測波長450 nm的A值，將各測試孔A值減去空白A值，細胞存活率% = (A加藥組-A空白組) /(A對照組-A空白組) × 100%。根據(jù)不同濃度的MX存活率繪制生存曲線，用GraphPad Prism 8.0軟件計算IC50值。耐藥倍數(shù)(resistant fold)=IC50(耐藥株) /IC50(敏感株) 。

1.2.5 免疫熒光染色法 將2×105個細胞接種于6孔板中的圓玻片上培養(yǎng)過夜。4%多聚甲醛固定，Triton X-100通透15 min。用山羊血清37 ℃封閉1 h，細胞與按比例稀釋的一抗在4℃孵育過夜。PBS沖洗5次，在37 ℃，避光環(huán)境下用熒光二抗 (1∶100 稀釋)孵育1 h。用PBS代替一抗作為陰性對照。用DAPI (1 μg/mL)染色細胞核，抗熒光衰減封片劑封片，在熒光顯微鏡下觀察、拍照(FV1000；奧林匹斯，中心谷，賓夕法尼亞州)。熒光雙染時，將2種不同種屬一抗混合稀釋，使抗體終濃度為每種抗體的工作濃度，再用相應(yīng)種屬熒光二抗標記(FITC標記山羊抗小鼠IgG和CY3標記山羊抗兔IgG)。

1.2.6 Western 印跡法 收集各組細胞，按照RIPA∶蛋白酶抑制劑∶磷酸酶抑制劑=100∶1∶1比例配制裂解試劑，裂解離心細胞后提取上清液，BCA法測定總蛋白質(zhì)濃度，調(diào)整蛋白質(zhì)濃度后加上樣緩沖液混合煮沸5 min使蛋白質(zhì)變性，保存于-80 ℃。進行SDS-PAGE，蛋白質(zhì)上樣量為35 μg/孔，半干轉(zhuǎn)和濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，室溫緩慢封閉1.5 h，放入按比例稀釋的一抗中4 ℃孵育16 h，二抗室溫孵育1.5 h，用ECL化學(xué)發(fā)光顯影凝膠成像，Image J 軟件分析各條帶灰度值，以β-肌動蛋白為內(nèi)參進行量化分析。

1.2.7 統(tǒng)計學(xué)方法 用SPSS 30.0以及GraphPad Prism 8.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差(mean ±SD)表示。實驗重復(fù)3次以上。兩樣本間比較采用t檢驗、多組間比較釆用單因素方差分析(One-way ANOVA)或雙因素方差分析(Two-way ANOVA)進行顯著性檢驗。P< 0.05時認定差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 上皮細胞黏附分子在ABCG2高表達的乳腺癌耐藥株上調(diào)

CCK8結(jié)果顯示，經(jīng)梯度濃度的MX處理，乳腺癌米托蒽醌耐藥株MCF-7/MX細胞在各濃度米托蒽醌處理后細胞存活率顯著高于其敏感株MCF-7細胞(Fig. 1A)。同時，相對于敏感株MCF-7細胞，MCF-7/MX細胞的ABCG2表達增加，EpCAM的表達同步上調(diào)(P< 0.01)(Fig. 1B,C)。耐藥株MCF-7/MX細胞的IC50值顯著高于MCF-7細胞(P< 0.01)，耐藥倍數(shù)為11.2倍(Table 2)。

2.2 敲低上皮細胞黏附分子增加MCF-7/MX細胞對MX的敏感性

siRNA法靶向干擾MCF-7/MX細胞的EpCAM，并用Western 印跡法鑒定干擾效果。結(jié)果顯示，與(MCF-7/MX)空白對照相比，陰性對照(siNC)組EpCAM的表達無明顯變化，而敲低組siEpCAM-1和-2中分別降低 24.4%(P< 0.05)和 49.0%(P< 0.001)，ABCG2的表達同步下調(diào)(Fig. 2A, B)。CCK8結(jié)果顯示，siNC組細胞對MX藥物敏感性未發(fā)生明顯變化，敲低組siEpCAM-1和siEpCAM-2對MX的敏感性顯著增強(Fig. 2C)。

Fig.2 Effects of EpCAM interference and its effect on resistance to MCF-7/MX cells (A, B) The efficiencies of EpCAM inhibition were examined by Western blotting. (Mean ± SD, n = 6),***P < 0.001, vs MCF-7 cells.****P < 0.0001, vs MCF-7 cells. (C) NX cytotoxicity was evaluated by CCK8 assays and expressed as percentage of cell viability. (Mean ± SD, n = 6),****P < 0.0001, vs MCF-7/MX cells

2.3 敲低上皮細胞黏附分子抑制MCF-7/MX細胞間緊密連接

敏感株MCF-7多呈單細胞存在，細胞間連接不緊密，而耐藥株MCF-7/MX多聚集成團，細胞間隙明顯減小，細胞間連接緊密。相較于MC-7/MX細胞，siNC組細胞間連接變化不明顯，多數(shù)仍聚集成團，而EpCAM敲低組細胞間連接明顯減弱或缺失(Fig. 3)。

Fig.3 Morphological changes in MCF-7/MX cells by EpCAM knockdown Effects of EpCAM down-regulation on the morphology of MCF-7/MX cells via microscopical observation. Representative cell morphologic images of MCF-7, MCF-7/MX, EpCAM-silenced MCF-7/MX cells and control cells photographed by inverted microscope (200×)

2.4 上皮細胞黏附分子與密封蛋白1在MCF-7/MX細胞中共定位

雙重免疫熒光染色結(jié)果顯示，EpCAM免疫熒光陽性為綠色熒光，細胞緊密連接的密封蛋白 1免疫熒光陽性呈紅色熒光。將同細胞中二者熒光融合時呈黃色，在MCF-7/MX細胞胞漿有共定位現(xiàn)象(Fig. 4)。

Fig.4 Colocalization of EpCAM and claudin 1 in MCF-7/MX cells Colocalization of claudin 1 and EpCAM in MCF-7/MX cells was visualized by immunofluorescence. Scale bar = 50 μm

2.5 敲低上皮細胞黏附分子減少MCF-7/MX的密封蛋白1表達

免疫熒光結(jié)果顯示，密封蛋白1主要分布在2種細胞的胞漿，相對于MCF-7細胞，MCF-7/MX細胞的密封蛋白1的熒光強度明顯增強(Fig. 5A)。敲低EpCAM的MCF-7/MX細胞熒光強度減弱(Fig. 5B)。Western 印跡結(jié)果表明，相對于MCF-7/MX細胞，siNC組細胞的密封蛋白 1表達變化不明顯，而siEpCAM組密封蛋白1表達下調(diào)(P< 0.0001)(Fig. 5C，D)。

Fig.5 Effects on claudin 1 in MCF-7/MX cells by EpCAM knockdown (A) Immunofluorescence of claudin 1 localization in MCF-7 and MCF-7/MX cells (400×) (scale bar indicates 50 μm). (B) Immunofluorescence of claudin 1 localization in MCF-7/MX and EpCAM-silenced MCF-7/MX cells (200×) (scale bar indicates 100 μm). (C, D) The protein levels of claudin 1 were determined in MCF-7/MX and MCF-7/MX-siEpCAM cells using Western blotting assays. (Mean ± SD, n = 6),****P < 0.0001 vs MCF-7/MX

3 討論

ABCG2主要通過多個底物結(jié)合位點特異性地泵出腫瘤細胞內(nèi)多種化療藥物和新型靶向分子藥物，在腫瘤細胞的多藥耐藥中發(fā)揮重要介導(dǎo)作用，是典型的多藥耐藥轉(zhuǎn)運蛋白質(zhì)[11]。腫瘤干細胞是腫瘤轉(zhuǎn)移、耐藥和復(fù)發(fā)的根本原因，ABCG2已被證實為腫瘤干細胞標記物之一[12]。ABCG2嚴重影響乳腺癌患者的化療效果，并導(dǎo)致預(yù)后不良。因此，深入研究ABCG2介導(dǎo)的多藥耐藥的分子機制，并探尋其逆轉(zhuǎn)策略是防治耐藥乳腺癌和抑制腫瘤干細胞的焦點。

EpCAM被證實與多種腫瘤的轉(zhuǎn)移、黏附、耐藥和干性相關(guān)，是防治轉(zhuǎn)移和耐藥等惡性腫瘤的新型分子靶點。EpCAM在乳腺癌、結(jié)直腸癌等多種腫瘤中均有過表達，在肝癌中作為干細胞標志物[13,14]，食管癌細胞被誘導(dǎo)耐藥過程中EpCAM同步上調(diào)，敲低則增加其化療敏感性[15]。在乳腺癌中，EpCAM高表達被證實其與轉(zhuǎn)移、不良預(yù)后均相關(guān)[16,17]。本研究證實，EpCAM在ABCG2高表達的乳腺癌耐藥株MCF-7/MX細胞中上調(diào)，敲低EpCAM則逆轉(zhuǎn)細胞耐藥性，ABCG2的表達隨之下調(diào)，證明EpCAM可促進ABCG2介導(dǎo)的乳腺癌細胞耐藥。

細胞間緊密連接是上皮和內(nèi)皮細胞間的重要屏障結(jié)構(gòu)，緊密連接或緊密連接蛋白質(zhì)是影響癌癥進展的眾多關(guān)鍵因素之一，也是體內(nèi)實體瘤群集耐藥的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。Claudins家族是細胞間維持緊密連接結(jié)構(gòu)的主要跨膜蛋白質(zhì)。研究證實，EpCAM能與一些Claudins蛋白相互作用影響緊密連接[18,19]。本研究表明，相較于MCF-7敏感株，ABCG2高表達的MCF-7/MX耐藥株緊密連接明顯增強，敲低EpCAM明顯削弱MCF-7/MX細胞的緊密連接。

經(jīng)典的緊密連接蛋白質(zhì)密封蛋白 1在一些乳腺癌細胞系(例如MCF-7)中表現(xiàn)出抗凋亡和促腫瘤作用，可通過激活上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程促進乳腺癌細胞遷移和侵襲，還能增加三陰性乳腺癌細胞系的細胞間黏附[20,21]。有研究報道，EpCAM能增強密封蛋白 1的穩(wěn)定性，促進乳腺癌的進展[22]。本研究顯示，密封蛋白1在EpCAM上調(diào)的MCF-7/MX中的表達明顯高于MCF-7，且EpCAM與密封蛋白 1共定位于MCF-7/MX細胞漿，表明EpCAM與密封蛋白1可能有相互作用。后續(xù)實驗發(fā)現(xiàn)，敲低EpCAM能明顯減少密封蛋白1的表達，進一步證實EpCAM可以由密封蛋白1介導(dǎo)增強MCF-7/MX細胞間緊密連接，進而增強耐藥性。鑒于密封蛋白1的功能復(fù)雜性，EpCAM與密封蛋白1間具體的相互作用機制有待深入研究。

綜上所述，本研究證實，EpCAM可以通過與密封蛋白1相互作用增強細胞間緊密連接，從而促進ABCG2介導(dǎo)的乳腺癌細胞耐藥，是防治耐藥乳腺癌的關(guān)鍵分子靶點。本研究從分子水平探尋ABCG2介導(dǎo)乳腺癌耐藥的機制及相關(guān)蛋白質(zhì)分子，對臨床上有效防治乳腺癌具有重要的理論和臨床意義。