胡德勝，李 健**，張 巖，鐘丹苗，方雪飛，廖營忠，蘇干光

（1．桐廬縣林業(yè)技術(shù)推廣中心，浙江 桐廬 311500；2．桐廬縣森林病蟲害防治站，浙江 桐廬311500；3．桐廬康源菜竹專業(yè)合作社，浙江 桐廬 311512；4．開化縣山禾食用菌專業(yè)合作社，浙江 開化 324399）

大球蓋菇（Stropharia rugosoannulata） 又名皺環(huán)球蓋菇、皺球蓋菇、酒紅球蓋菇、赤松茸，屬于擔(dān)子菌門（Basidiomycota） 擔(dān)子菌綱（Basidiomycetes）傘菌目（Agaricales） 球蓋菇科 （Strophariaceae） 球蓋菇屬（Stropharia），是一種草腐食用菌。大球蓋菇營養(yǎng)豐富、口味絕佳，被稱為“素中之葷”，作為一種特色農(nóng)業(yè)產(chǎn)品，受到聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織（FAO） 的青睞[1]。大球蓋菇富含蛋白質(zhì)、多糖、礦質(zhì)元素、維生素等生物活性物質(zhì)，還含有17種氨基酸，其中人體必需氨基酸種類齊全[2]。

大球蓋菇的菌絲有很強(qiáng)的生理活性和抗逆性，可直接利用稻草、竹屑、茭白葉等農(nóng)作物秸稈進(jìn)行生料栽培，具有取材方便、價(jià)格低廉和操作簡便的優(yōu)點(diǎn)[3]。栽培過程中不需要菇棚，也無需裝袋、滅菌和接種設(shè)備。冬季閑置田地、林地、桑果園等都可作為栽培場地[4]。特別是林下套種大球蓋菇的栽培模式，可在不占用農(nóng)田的前提下實(shí)現(xiàn)對林間資源的充分利用。該模式可在短期獲得較高經(jīng)濟(jì)效益的同時(shí)，維持農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境的健康、持續(xù)發(fā)展。

多酚類物質(zhì)主要包括酚酸、類黃酮、花色苷類等，廣泛存在于植物、食用菌中[5]。多酚結(jié)構(gòu)多樣，具有抗氧化、抗病毒、抗菌等藥理活性[6]。乙醇作為一種常用的綠色溶劑，已廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物中多酚的提取[7-8]。超聲處理常用于食品加工領(lǐng)域，是一種綠色無污染的輔助提取技術(shù)，具有耗時(shí)短和效率高的優(yōu)點(diǎn)[9-11]。采用超聲處理輔助乙醇提取大球蓋菇多酚的方法具有良好的應(yīng)用潛力。

目前對林下栽培的大球蓋菇中多酚提取工藝的研究較少，因此以林下人工栽培的大球蓋菇為原料，采用超聲處理輔助乙醇提取多酚的方法，設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn)，利用響應(yīng)面優(yōu)化法考察不同的乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲溫度和超聲時(shí)間對大球蓋菇子實(shí)體多酚提取量的影響，對提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期為深入開發(fā)和利用林下栽培的大球蓋菇資源提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

大球蓋菇子實(shí)體樣品為杭州市桐廬縣林下栽培所得。

福林酚（BR），上海源葉生物科技有限公司；沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，北京索萊寶科技有限公司；乙醇、碳酸鈉等（國產(chǎn)分析純），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器

KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；HH-1數(shù)顯恒溫水浴鍋，上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；可見分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1．3．1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

用福林酚法[12]測定多酚含量。選擇沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，精確量取沒食子酸0．04 g，加入10 mL乙醇，攪拌溶解，加水定容至100 mL，從而配制出400 mg·L-1的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液 1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL定容至 10 mL，即得到 40 mg·L-1、80 mg·L-1、120 mg·L-1、160 mg·L-1、200 mg·L-1、240 mg·L-1的沒食子酸稀釋液。向各質(zhì)量濃度沒食子酸稀釋液中各加入福林酚試劑1 mL，振蕩均勻，靜置3 min～4 min；分別加入 7．5%碳酸鈉溶液 5 mL，加水定容至25 mL；40℃水浴加熱30 min；用分光光度計(jì)在765 nm處測定吸光度值，縱坐標(biāo)為吸光度值，橫坐標(biāo)為沒食子酸質(zhì)量濃度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1．3．2 林下栽培的大球蓋菇的多酚提取及測定

將林下栽培的大球蓋菇樣品進(jìn)行冷凍干燥、粉碎，稱取2．0 g試樣于具塞錐形瓶中。加入60 mL的一定濃度的乙醇溶液，按照設(shè)定的超聲溫度和超聲時(shí)間進(jìn)行萃取。然后在3 000 r·min-1下離心10 min，上清液定容至100 mL，從中吸取1 mL提取液，按照1．3．1沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液測定方法測定其多酚含量。

林下栽培的大球蓋菇中多酚提取量（Y，mg·g-1）的計(jì)算公式為：

式中：C為待測液質(zhì)量濃度（mg·mL-1）；N為稀釋倍數(shù)；V為提取液體積（mL）；M為樣品質(zhì)量（g）。

1．3．3 提取條件的單因素試驗(yàn)

參照1．3．2中的提取方法提取大球蓋菇多酚，設(shè)計(jì)3組單因素試驗(yàn)，每組進(jìn)行3個(gè)平行試驗(yàn)。

1） 固定乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%以及超聲溫度為40℃，在提取時(shí)間分別為20 min、30 min、40 min、50 min、60 min、70 min的條件下進(jìn)行超聲提取，分析超聲時(shí)間對大球蓋菇子實(shí)體多酚提取量的影響。

2） 固定超聲溫度為40℃以及液料比為30∶1，分別在乙醇體積分?jǐn)?shù)為30%、40%、50%、60%、70%的條件下，進(jìn)行30 min的超聲提取，分析不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對大球蓋菇子實(shí)體多酚提取量的影響。

3） 固定乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%以及液料比為30∶1，分別在超聲溫度為30℃、40℃、50℃、60℃、70℃的條件下，進(jìn)行30 min超聲提取，分析超聲溫度對大球蓋菇子實(shí)體多酚提取量的影響。

1．3．4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

利用Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，在單因素試驗(yàn)所確定的范圍內(nèi)，采用3因素3水平設(shè)計(jì)響應(yīng)面，試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Design Expert 8．05軟件進(jìn)行分析。以-1，0，1依次對自變量的試驗(yàn)水平進(jìn)行編號，試驗(yàn)因素及水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面分析因子及水平Tab．1 Factors and levels of response surface analysis

2 結(jié)果與分析

2.1 大球蓋菇多酚提取的單因素試驗(yàn)結(jié)果

不同超聲時(shí)間對林下栽培的大球蓋菇子實(shí)體多酚提取量的影響見圖1。

圖1 不同超聲時(shí)間對大球蓋菇多酚提取量的影響Fig．1 Effect of different ultrasonic times on polyphenol yeild of Stropharia rugosoannulata

由圖1可知，隨著超聲時(shí)間的增加，多酚提取量先迅速上升，后呈逐漸下降的趨勢。當(dāng)超聲時(shí)間為20 min～40 min時(shí)，多酚提取量隨超聲時(shí)間的增加而增加。當(dāng)超聲時(shí)間為40 min時(shí)大球蓋菇子實(shí)體多酚提取量達(dá)到最大值。當(dāng)超聲時(shí)間超過40 min后，多酚提取量開始降低。據(jù)此，選擇30 min、40 min和50 min作為超聲時(shí)間響應(yīng)面分析的3個(gè)水平。

不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對林下栽培的大球蓋菇子實(shí)體多酚提取量的影響見圖2。

圖2 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對大球蓋菇多酚提取量的影響Fig．2 Effects of different ethanol volume fractions on polyphenol yield of Stropharia rugosoannulata

由圖2可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為30%～60%時(shí)，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的上升，大球蓋菇多酚提取量也隨之增加，當(dāng)體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)，子實(shí)體多酚提取量達(dá)到最大值。在乙醇體積分?jǐn)?shù)超過60%時(shí)，子實(shí)體多酚提取量有所下降。原因可能是多酚的存在形式有結(jié)合態(tài)、游離態(tài)及酯化態(tài)等，部分多酚與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起形成結(jié)合態(tài)，乙醇體積分?jǐn)?shù)過高導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，從而影響結(jié)合態(tài)多酚的溶出。綜合以上因素，乙醇體積分?jǐn)?shù)響應(yīng)面分析的3個(gè)水平選擇50%、60%和70%。

不同超聲溫度對林下栽培的大球蓋菇多酚提取量的影響見圖3。

圖3 不同超聲溫度對大球蓋菇多酚提取量的影響Fig．3 Effect of different ultrasound temperatures on the polyphenol yeild of Stropharia rugoso annulata

由圖3可知，當(dāng)超聲溫度為30℃～50℃時(shí)，子實(shí)體多酚提取量隨超聲溫度的升高而升高；當(dāng)超聲溫度為50℃時(shí)，子實(shí)體多酚提取量達(dá)到最大值。原因可能是超聲溫度越高溶液中分子運(yùn)動越強(qiáng)，大球蓋菇樣品充分溶解，多酚溶出量增加。而后隨著超聲溫度繼續(xù)上升，多酚提取量逐漸下降。原因可能是高溫導(dǎo)致部分多酚類物質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，或溶液中的雜質(zhì)增多，使得多酚類物質(zhì)的提取量下降[13]。由此，超聲溫度響應(yīng)面分析的3個(gè)水平選擇40℃、50℃和60℃。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果及分析

2．2．1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以林下栽培的大球蓋菇子實(shí)體多酚提取量作為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果Tab．2 Response surface design and experimental results

用Design Expert 8．05軟件對表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得出多酚提取量對超聲溫度、超聲時(shí)間和乙醇體積分?jǐn)?shù)的多元二次回歸方程為：

該回歸方程的相關(guān)系數(shù)R2為0．9853。

對上述方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

表3 方差分析Tab．3 Analysis of variance model

由表3可知，目標(biāo)函數(shù)為多酚提取量的多元二次方程回歸效果均達(dá)到極顯著水平（P＜0．01）；決定系數(shù)R2達(dá)到0．985 3，證明模型與實(shí)際試驗(yàn)?zāi)軌蜉^好地?cái)M合；校正決定系數(shù)R2adj達(dá)到0．966 8，證明該模型能解釋96．68%響應(yīng)值的變化；模型預(yù)測值與實(shí)際值不擬合的概率表示為模型的失擬項(xiàng)，表3中模型失擬項(xiàng) P=0．677 2＞0．050 0，證明模型失擬項(xiàng)不顯著。此外，乙醇體積分?jǐn)?shù)（B）、超聲溫度（C）對響應(yīng)值影響顯著 （P＜0．05），AA、BB、CC 以及 AC 和BC的交互項(xiàng)對多酚提取量的影響極顯著（P＜0．01）。3個(gè)因素對林下栽培的大球蓋菇子實(shí)體多酚提取量影響大小的順序依次為：超聲溫度（C） ＞乙醇體積分?jǐn)?shù)（B） ＞超聲時(shí)間（A）。

2．2．2 響應(yīng)面圖形分析

依據(jù)以回歸方程制作的響應(yīng)曲面圖與擬合的響應(yīng)曲面形狀，研究不同超聲時(shí)間、超聲溫度及乙醇體積分?jǐn)?shù)對林下栽培的大球蓋菇子實(shí)體多酚提取量的影響。使模型中的超聲溫度、超聲時(shí)間及乙醇體積分?jǐn)?shù)皆固定在水平0，進(jìn)而獲得另外2個(gè)因素的交互影響結(jié)果，二次回歸方程的響應(yīng)面及其等高線圖見圖4～圖6。

圖4 超聲時(shí)間和乙醇體積分?jǐn)?shù)交互作用對多酚提取量影響的響應(yīng)面及等高線圖Fig．4 Response surface and contour of the interaction between ultrasonic time and ethanol volume fraction on polyphenol yeild

圖5 乙醇體積分?jǐn)?shù)和超聲溫度交互作用對多酚提取量影響的響應(yīng)面及等高線圖Fig．5 Response surface and contour of the interaction between ethanol vdrume fraction and ultrasonic temperature on pdyphenol yeild

圖6 超聲時(shí)間和超聲溫度交互作用對多酚提取量影響的響應(yīng)面及等高線圖Fig．6 Response surface and contour of the interaction between ultrasonic time and ultrasonic temperature on pdyphenol yeild

由圖4～圖6可知，超聲溫度（C） 是影響大球蓋菇子實(shí)體多酚提取量最顯著的因素，在等高線圓心處出現(xiàn)極值條件，響應(yīng)面弧度出現(xiàn)較大變化；其次是乙醇體積分?jǐn)?shù)（B）；超聲時(shí)間（C） 對響應(yīng)值影響較小，表現(xiàn)為響應(yīng)面變化弧度較為平緩。交互效應(yīng)的強(qiáng)弱可用等高線趨勢的變化來表示，兩因素交互作用顯著用橢圓形展現(xiàn)，相反則呈圓形。因此，超聲溫度（C） 與乙醇體積分?jǐn)?shù)（B） 的交互作用對多酚提取量有顯著影響。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

依據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)得出的結(jié)果以及回歸方程，使用Design-Expert 8．05對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到多酚提取優(yōu)化條件：超聲時(shí)間為39．3 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)為64．68%，超聲溫度為53．1℃。在此優(yōu)化條件下計(jì)算得到林下栽培的大球蓋菇子實(shí)體多酚提取量理論值為 16．97 mg·g-1。

為驗(yàn)證模型預(yù)測值與實(shí)際值的相關(guān)性（即對響應(yīng)面優(yōu)化模型可靠性進(jìn)行驗(yàn)證），以及實(shí)際生產(chǎn)中大球蓋菇子實(shí)體中多酚提取量情況，依據(jù)軟件計(jì)算出的最佳提取條件進(jìn)行3次平行重復(fù)試驗(yàn)。得到多酚提取量分別為 16．56 mg·g-1、16．58 mg·g-1、16．63 mg·g-1，多酚實(shí)際提取量的平均值為 16．59 mg·g-1，達(dá)到了理論預(yù)測值的97．76%。試驗(yàn)結(jié)果與模型較好擬合，說明該模型可對林下栽培的大球蓋菇子實(shí)體多酚提取量較好地進(jìn)行模擬和預(yù)測。

3 結(jié)論

林下栽培的食用菌具有原生態(tài)的特質(zhì)，與大棚栽培的子實(shí)體相比，其生長環(huán)境更加接近自然狀況，生產(chǎn)的大球蓋菇等食用菌營養(yǎng)豐富、品質(zhì)好。

通過響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，利用超聲處理輔助乙醇萃取，優(yōu)化得出林下栽培的大球蓋菇子實(shí)體多酚的工藝提取條件：超聲時(shí)間為39.3 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)為64.68%，超聲溫度為53.1℃。在該條件下，林下栽培的大球蓋菇子實(shí)體多酚提取量達(dá)16.59 mg·g-1。同時(shí)，依據(jù)最佳提取條件進(jìn)行的3次平行試驗(yàn)，結(jié)果證明了該模型可靠，可用于大球蓋菇子實(shí)體多酚提取量的預(yù)測。

此外，林業(yè)與食用菌產(chǎn)業(yè)的交叉優(yōu)勢，可較大幅度提高竹林地的生產(chǎn)力和經(jīng)濟(jì)效益，實(shí)現(xiàn)資源的合理循環(huán)利用，構(gòu)成一個(gè)良性的原生態(tài)食用菌栽培模式，值得推廣。