張 凱，姜雪瑩，錢英紅，曹金山*，劉 博，張 靜，毛 偉

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物疾病臨床診療技術(shù)重點實驗室，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018；3.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院,內(nèi)蒙古呼和浩特 010018)

金黃色葡萄球菌(S.aureus)簡稱金葡菌，是引發(fā)細(xì)菌感染性疾病的主要致病菌之一，奶牛乳腺炎、陰道炎、子宮內(nèi)膜炎均與金黃色葡萄球菌密切相關(guān)[2-4]。金葡菌是革蘭氏陽性菌，侵入機體能激活免疫細(xì)胞并誘導(dǎo)宿主炎癥反應(yīng)[5]。中性粒細(xì)胞是重要的免疫細(xì)胞,在炎癥反應(yīng)時可釋放細(xì)胞因子、趨化因子和其他促炎介質(zhì)，促進適應(yīng)性免疫細(xì)胞(包括B細(xì)胞和T細(xì)胞)的募集和激活來啟動和放大免疫反應(yīng)。中性粒細(xì)胞的激活可通過不同因素誘發(fā)，其中細(xì)菌所釋放的病原體相關(guān)分子模式(PAMPs)是激活中性粒細(xì)胞的主要因素[6]。中性粒細(xì)胞除了具有吞噬和殺菌特性外，還可能通過產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的能力，在革蘭氏陽性菌感染的先天性免疫反應(yīng)中發(fā)揮作用。人中性粒細(xì)胞在幽門螺旋桿菌的作用下分泌細(xì)胞因子IL-1β、IL-8、TNF-α以及IL-10[7]。大腸埃希氏菌感染中性粒細(xì)胞后，可以激活NF-κB信號通路，導(dǎo)致炎癥因子TNF-α和IL-1的釋放增加[8]?？寡准?xì)胞因子IL-10是免疫反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)劑，但其在牛免疫啟動初始階段的細(xì)胞來源和功能尚未完全確定[9]。TNF-α是一種重要的炎癥介質(zhì)，它是潛在的中性粒細(xì)胞激活劑。TNF-α對多種細(xì)胞都有誘導(dǎo)凋亡作用，對中性粒細(xì)胞也是如此，而且與作用時間和作用濃度相關(guān)[10]。IL-8是一種具有很強趨化活性的細(xì)胞因子,能夠促進中性粒細(xì)胞的活化和脫顆粒。由于對中性粒細(xì)胞很強的趨化活性,IL-8被認(rèn)為在敗血癥的致病過程中發(fā)揮了重要作用[11]。然而奶牛中性粒細(xì)胞在金葡菌的作用下是否也可通過激活NF-κB信號通路從而分泌這些細(xì)胞因子的尚不清楚。因此，闡明由金黃色葡萄球菌感染引起的奶牛炎癥發(fā)病機理對治療奶牛相關(guān)疾病具有重要意義。

本研究用S.aureus(SA113)感染奶牛中性粒細(xì)胞，探討NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活情況和促炎細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α，抗炎細(xì)胞因子IL-10和趨化因子IL-8在中性粒細(xì)胞上發(fā)生的炎癥反應(yīng)過程中是如何參與調(diào)節(jié)的。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及菌株 選取4歲～6歲健康、泌乳期90 d左右的荷斯坦奶牛；試驗用菌株金黃色葡萄球菌 SA113(ATCC 35556)由德國圖賓根大學(xué) Friedrich G?tz 教授饋贈。菌株在MH液體培養(yǎng)基中擴增后，保存于-80℃冰箱。

1.1.2 試劑 胎牛血清和牛血清白蛋白BSA，Biosciences公司產(chǎn)品；MH培養(yǎng)基，OXOID公司產(chǎn)品；PBS磷酸鹽緩沖液、RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基，Hyclone公司產(chǎn)品；牛IL-1β 、IL-10、IL-8 ELISA檢測試劑盒，Kingfisherie Biotech公司產(chǎn)品; 牛TNF-α ELISA檢測試劑盒，R&D Systems公司產(chǎn)品；牛外周血中性粒細(xì)胞分離試劑盒，天津灝洋公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 CO2培養(yǎng)箱和水平離心機，Thermo Fisher公司產(chǎn)品；恒溫振蕩培養(yǎng)箱，培英公司產(chǎn)品；顯微鏡，Olympus公司產(chǎn)品；高壓滅菌鍋，松下公司產(chǎn)品；-80℃低溫冰箱，海爾公司產(chǎn)品；超凈工作臺，Airtech公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 奶牛外周血中性粒細(xì)胞培養(yǎng) 選健康荷斯坦奶牛對其進行頸靜脈采血50 mL。向15 mL的離心管中先加4 mL牛外周血中性粒細(xì)胞分離試劑盒里的分離液1，再取3 mL的新鮮抗凝血緩慢加于牛外周血中性粒細(xì)胞分離試劑盒里的分離液1上。2 000 r/min水平離心25 min。收集位于分離液界面上的白色層帶的細(xì)胞放入15 mL離心管中。向新的15 mL的離心管中加入2 mL的分離液2，取白色層帶的細(xì)胞3 mL,緩慢加于分離液2上，2 000 r/min水平離心40 min。棄去上清，收集細(xì)胞，加2 mL的紅細(xì)胞裂解液，裂解2 min,用3倍體積的PBS溶液中和紅細(xì)胞裂解液，1 000 r/min離心5 min。若還有紅細(xì)胞可再裂解一次最后用含100 mL/L的胎牛血清的1640培養(yǎng)基重懸，計數(shù)約4.2×107個/mL細(xì)胞，培養(yǎng)置6孔板中。

1.2.2 奶牛中性粒細(xì)胞鑒定 用瑞氏姬姆薩染色方法對分離培養(yǎng)的奶牛中性粒細(xì)胞進行鑒定。取細(xì)胞懸液均勻的涂布于干凈的載玻片上，待到載玻片上的細(xì)胞自然風(fēng)干后，將染液滴到上面約2 min～3 min，后滴加PBS，染液和PBS比例約為1∶1.5?；靹蚝笕旧? min～5 min,時間一到用PBS小心沖洗2遍，后用水對其進行沖洗。待載玻片自然干燥后，油鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.2.3 奶牛中性粒細(xì)胞活性檢測 稱取臺盼藍(lán)粉末4 g,使用100 mL超純水溶解,濾紙過濾，將其配置成0.4 g/L臺盼藍(lán)母液置于4℃保存。每次使用時用PBS稀釋成0.04 g/L。將中性粒細(xì)胞按2×105接入96孔板中。時間點設(shè)置為0、6、12、24、36、48、60、72、84、96、108、120 h。在對應(yīng)的時間點分別用0.04 g/L的臺盼藍(lán)溶液與中性粒細(xì)胞懸液以1∶9的比例充分混合染色3 min～5 min。分別計數(shù)活細(xì)胞數(shù)和死細(xì)胞數(shù)，設(shè)置3次重復(fù)，在顯微鏡下觀察染色情況，死細(xì)胞被染成明顯的藍(lán)色而活細(xì)胞拒染呈無色透明狀。最后統(tǒng)計細(xì)胞活率：細(xì)胞活率(%)=(活細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù))×100%

1.2.4 金黃色葡萄球菌復(fù)蘇和制備 將金黃色葡萄球菌從-80℃拿出置于4℃直到完全融化，在超凈臺中將其放于100 mL MH肉湯中，將錐形瓶封口置37℃恒溫?fù)u床上200 r/min搖16 h后拿出。3 000 r/min離心6 min,棄上清，用無菌PBS對其進行重懸重復(fù)3次，最后一次用1640培養(yǎng)基對其進行重懸。

1.2.5 金黃色葡萄球菌濃度計算 吸取1 mL搖起來的菌液到1.5 mL無菌無酶離心管中，3 000 r/min離心6 min,棄上清，加入無菌PBS對其進行重懸。重懸后用PBS對菌液進行梯度倍比稀釋，稀釋度分別為101、102、103、104、105、106、107、108、109、1010。每個稀釋度做4個平行，各取菌液100 μL均勻涂布于營養(yǎng)瓊脂平板，倒置于37℃溫箱中培養(yǎng)過夜。選擇菌落數(shù)在30～300的稀釋度來計數(shù)，取其平均值計算CFU 值，菌液4℃保存。

1.2.6 奶牛中性粒細(xì)胞細(xì)胞因子的釋放和感染時間的關(guān)系確定 將分離培養(yǎng)的奶牛中性粒細(xì)胞接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中(2×106個/mL)，根據(jù)前述試驗中得到的金黃色葡萄球菌每毫升菌液中細(xì)菌的CFU值，以MOI 3∶1感染細(xì)胞。在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h，加入濃度為500 μg/mL 的硫酸慶大霉素溶液250 μL，使慶大霉素的終濃度達(dá)到100 μg/mL的水平。37℃繼續(xù)孵育2、5、8、11、23 h。使其總感染時間達(dá)到3、6、9、12、24 h。

1.2.7 金黃色葡萄球菌感染奶牛中性粒細(xì)胞NF-κB信號通路的激活情況 將奶牛中性粒細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔接5×106個/mL，根據(jù)前述試驗中得到的金黃色葡萄球菌每毫升菌液中細(xì)菌的CFU值，以MOI 10∶1感染細(xì)胞。感染后的細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃孵育15、30、60、120 min后提蛋白。80V 40 min、110 V 90 min SDS-PAGE凝膠電泳后、半干轉(zhuǎn)25V 30 min、0.3 g/L BSA封閉4 h、以1∶1000的比例稀釋一抗孵育14 h、使用TBST洗膜4次，每次5 min、二抗1∶3 000稀釋孵育1 h、洗膜4次，每次10 min。使用Supersignal west pico化學(xué)發(fā)光底物及化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)采集圖像。

1.2.8 ELISA檢測 根據(jù)ELISA試劑盒說明書分別對不同細(xì)胞因子進行檢測，繪制相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算樣品中細(xì)胞因子濃度。

1.2.9 數(shù)據(jù)處理 用GraphPad Prism 5數(shù)據(jù)處理軟件對試驗結(jié)果進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計及差異性分析，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

2 結(jié)果

2.1 奶牛外周血中性粒細(xì)胞的鑒定

油鏡下觀察到奶牛外周血中性粒細(xì)胞細(xì)胞核呈馬蹄鐵形、分葉狀或彎曲桿狀，細(xì)胞核顏色為紫色，可見極淺的淡紅色的細(xì)胞胞質(zhì)，符合中性粒細(xì)胞的形態(tài)特征(圖1)。

圖1 奶牛中性粒細(xì)胞形態(tài)特征(1 000×)

2.2 臺盼藍(lán)拒染法檢測中性粒細(xì)胞的活率

從分離培養(yǎng)細(xì)胞開始選擇0、6、12、24、36、48、60、72、84、96、108、120 h進行臺盼藍(lán)染色并進行細(xì)胞計數(shù)，計算細(xì)胞活力。培養(yǎng)時間在0 h～6 h活細(xì)胞比可達(dá)到100%，隨著培養(yǎng)時間的增加細(xì)胞活率逐漸降低，在培養(yǎng)24 h以內(nèi)細(xì)胞活率可達(dá)到98%以上，因此誘導(dǎo)細(xì)胞時間選擇在0 h～24 h。

圖2 奶牛中性粒細(xì)胞活性檢測

2.3 S.aureus感染奶牛中性粒細(xì)胞因子表達(dá)的檢測

金黃色葡萄球菌(SA113)以MOI 3∶1感染奶牛中性粒細(xì)胞，分別在感染3、6、9、12、24 h后收集奶牛中性粒細(xì)胞培養(yǎng)上清，用ELISA方法檢測奶牛中性粒細(xì)胞上清中細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α、IL-10以及IL-8的表達(dá)水平。與對照組相比，金黃色葡萄球菌(SA113)感染奶牛中性粒細(xì)胞3、6、9、12、24 h時上清中TNF-α、IL-10以及IL-8的分泌量極顯著升高(***P<0.001)。IL-1β除了在3 h時與對照組相比差異不顯著，其他時間點都差異極顯著(***P<0.001)。與金黃色葡萄球菌(SA113)感染奶牛中性粒細(xì)胞9 h作用組相比較，奶牛中性粒細(xì)胞上清中TNF-α的分泌量降低，差異不顯著(圖3)。

***P<0.001，**P<0.05，nsP>0.05)

2.4 S.aureus感染奶牛中性粒細(xì)胞NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活情況

用金黃色葡萄球菌SA113以MOI 10∶1感染奶牛中性粒細(xì)胞，感染15、30、60、120 min后收集細(xì)胞提蛋白。根據(jù)Western bIot的相關(guān)步驟對其進行磷酸化檢測。與對照組相比，SA113感染奶牛中性粒細(xì)胞15、30、60、120 min時IκBα的磷酸化水平都極顯著高于對照組(***P<0.001)，且在15、30、60 min時磷酸化水平逐漸升高，在120 min時呈下降趨勢(圖4)。

圖4 金黃色葡萄球菌感染奶牛中性粒細(xì)胞IκBα磷酸化激活情況

3 討論

當(dāng)細(xì)菌感染奶牛機體引發(fā)炎癥反應(yīng)時，中性粒細(xì)胞在趨化因子作用下可以第一時間募集到疾病發(fā)生位點。它們可以通過吞噬作用，在細(xì)胞內(nèi)攝取和殺死入侵的微生物。中性粒細(xì)胞也可通過釋放儲存在顆粒中的抗菌肽和酶來殺死細(xì)胞外的微生物。除了抗菌功能，中性粒細(xì)胞還能夠表達(dá)編碼炎癥介質(zhì)的基因，如生長因子、趨化因子和細(xì)胞因子等[12]。人中性粒細(xì)胞在幽門螺旋桿菌的作用下分泌促炎細(xì)胞因子IL-1β、趨化因子IL-8、和TNF-α以及抗炎細(xì)胞因子IL-10[7]。大腸埃希氏菌感染中性粒細(xì)胞后，可以激活NF-κB信號通路，導(dǎo)致炎癥因子TNF-α和IL-1的釋放增加[8]。因此，初步可以認(rèn)為革蘭氏陰性菌感染中性粒細(xì)胞時，可以激活炎癥信號通路從而導(dǎo)致炎癥因子的釋放。

本研究通過金黃色葡萄球菌感染奶牛中性粒細(xì)胞，檢測IκBα磷酸化水平，同時檢測促炎細(xì)胞因子IL-1β、趨化因子IL-8、和TNF-α以及抗炎細(xì)胞因子IL-10的分泌。研究結(jié)果顯示，在成功分離培養(yǎng)奶牛中性粒細(xì)胞的基礎(chǔ)上，金黃色葡萄球菌(SA113)感染后能夠激活NF-κB信號通路，進而提高促炎細(xì)胞因子IL-1β、趨化因子IL-8、和TNF-α以及抗炎細(xì)胞因子IL-10的分泌，且細(xì)胞因子的分泌與時間具有時效關(guān)系。說明革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌通過奶牛中性粒細(xì)胞的某些受體的識別下，通過激活NF-κB炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路從而導(dǎo)致炎癥細(xì)胞因子分泌上升，而不同的是隨著感染時間增加，TNF-α表達(dá)量不發(fā)生顯著變化，且略有下降的趨勢。而且據(jù)報道稱中性粒細(xì)胞的壽命很短，它被認(rèn)為只能在骨髓外存活幾個小時后就會被吞噬和清除[13]。血液中中性粒細(xì)胞的壽命為5.4 d，比以前發(fā)現(xiàn)的長20多倍[12]。本試驗發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞在前3 d細(xì)胞活率可以達(dá)到85%以上，到第5天時細(xì)胞活率只有52%。隨著中性粒細(xì)胞壽命的顯著延長，可以預(yù)見中性粒細(xì)胞還能夠發(fā)揮更多的生物學(xué)效應(yīng)。TNF-α可以促進中性粒細(xì)胞的死亡，可能是由于時間的延長中性粒細(xì)胞可能處于一個自我保護的階段，導(dǎo)致中性粒細(xì)胞分泌TNF-α的能力也在下降。

中性粒細(xì)胞內(nèi)含有大量溶酶體酶，可以快速的將吞入細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌和組織碎片分解[14]。綜上所述，牛中性粒細(xì)胞除了具有吞噬和殺菌特性外，還可能通過其產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)因子的能力，在革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌感染的先天性免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。