劉奕伶，唐麗輝，趙文星，王 輝，郭梓豫，吳可欣，張?jiān)脐?，莫重輝，趙寶玉，路 浩*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，青海西寧 810016)

烏頭(Aconitum)為毛茛科多年生草本植物，該屬植物大部分塊根內(nèi)含有劇毒烏頭堿，因此被列為有毒植物[1]。近年來我國(guó)牧區(qū)烏頭等毒草大量滋生，家畜誤食后中毒，對(duì)畜牧業(yè)發(fā)展造成極大危害[2-3]。烏頭屬有毒植物中含有多種毒性成分，主要為二萜類生物堿，常見的有烏頭堿(aconitine)、中烏頭堿(mesaconitine)、次烏頭堿(hypaconitine)、異烏頭堿(isoaconitine)等，其中烏頭堿毒性最強(qiáng)[4]。動(dòng)物中毒后臨床表現(xiàn)為流涎、嘔吐、腹痛、瞳孔散大、呼吸困難、運(yùn)動(dòng)中樞和感覺麻痹等[5]。

烏頭堿的研究主要集中在藥理作用方面，如強(qiáng)心[6]、抗炎[7]、抗腫瘤[8]、抗衰老及抗病毒[9]等，對(duì)其毒理研究較少。烏頭堿的毒性主要是影響心臟、中樞神經(jīng)系統(tǒng)和肌肉組織[10]。通過與生物膜上的脂質(zhì)或蛋白質(zhì)反應(yīng)，刺激細(xì)胞促凋亡基因的表達(dá)增加，誘導(dǎo)動(dòng)物組織細(xì)胞凋亡[11]。其在心肌細(xì)胞中促凋亡有劑量依賴性，通過p38/MAPK信號(hào)通路引起大鼠心律失常[12]，通過線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路等誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[13]。本研究以小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞(HT22)為研究對(duì)象，探討烏頭堿體外對(duì)HT22細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞來源 HT22細(xì)胞，北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院(BNCC)提供。

1.1.2 主要試劑 胎牛血清(FBS)和DMEM培養(yǎng)基，Gibco公司產(chǎn)品；胰蛋白酶和青鏈霉素，Hyclone公司產(chǎn)品；Annexin V-FITC/PI和Hoechst 33258，Solarbio公司產(chǎn)品；烏頭堿(純度98.36%)，成都曼思特生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 電子天平PTI-FA110，福州華志科學(xué)儀器有限公司；79-2雙向磁力加熱攪拌器、PHS-3E型酸度計(jì)和三用水箱，北京科偉公司；YI-CJ-IN型超凈工作臺(tái)，北京亞泰科隆公司；CKX31型倒置顯微鏡，日本Olympus公司；EPOCH酶標(biāo)儀，美國(guó)BioTek公司；CO2恒溫培養(yǎng)箱，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；Axio Observer倒置熒光顯微鏡，德國(guó)Zeiss公司；BD-FACSAria型流式細(xì)胞儀，美國(guó)BD公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞復(fù)蘇與培養(yǎng) 凍存的HT22細(xì)胞于37℃水浴解凍，用DMEM完全培養(yǎng)基于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)皿底部80%時(shí)傳代并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.2.2 小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞存活率測(cè)定 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按常規(guī)方法制成細(xì)胞懸液，以1.5×103個(gè)/孔均勻接種至96孔板中，設(shè)不加細(xì)胞的調(diào)零孔，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)，待細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用烏頭堿分別處理HT22細(xì)胞6 h和12 h。試驗(yàn)分陰性對(duì)照組為HT22細(xì)胞、培養(yǎng)液、無藥物；處理組為HT22細(xì)胞、培養(yǎng)液、烏頭堿(0、50、100、200 μg/mL)。按照MTT試劑盒說明檢測(cè)細(xì)胞存活率(將含有烏頭堿的培養(yǎng)液吸棄，每孔加入含5 g/L的MTT培養(yǎng)液，4 h后將培養(yǎng)液吸棄，每孔加入100 μL二甲基亞砜，低速振蕩10 min后用酶標(biāo)儀OD490 nm測(cè)吸光度值)，細(xì)胞存活率=(處理組OD值-調(diào)零孔OD值)/(陰性對(duì)照組OD值-調(diào)零孔OD值)×100%。

1.2.3 小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞核熒光染色 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，按常規(guī)方法制成細(xì)胞懸液，4.5×104個(gè)/孔均勻接種至6孔板中，設(shè)不加細(xì)胞的調(diào)零孔，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)，待細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用烏頭堿分別處理HT22細(xì)胞6 h、12 h。試驗(yàn)分組同1.2.2，按照Hoechst 33258試劑盒說明對(duì)細(xì)胞核染色(將含有烏頭堿的培養(yǎng)液吸棄，加入Hoechst固定液0.5 mL，37℃孵育20 min后吸棄，PBS緩慢振蕩漂洗3次，加入Hoechst 33258染色液0.5 mL，繼續(xù)孵育5 min后吸棄)，用熒光顯微鏡對(duì)HT22細(xì)胞進(jìn)行凋亡形態(tài)學(xué)檢測(cè)。

1.2.4 小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率測(cè)定 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按常規(guī)法制成細(xì)胞懸液，以1.0×105個(gè)/皿的細(xì)胞密度均勻接種至60 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿，在培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)，待細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用烏頭堿分別處理HT22細(xì)胞6 h、12 h。試驗(yàn)分組同1.2.2，按照Annexin V-FITC/PI試劑盒說明對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色(收集細(xì)胞，PBS洗滌后重懸，使細(xì)胞密度達(dá)1×106個(gè)/mL，每管加入100 μL細(xì)胞和5 μL Annexin V-FITC，室溫避光，輕輕振蕩10 min，加入5 μL PI，室溫避光孵育5min，加入PBS至500μL，輕輕混勻)，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)HT22細(xì)胞凋亡率。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 用SPSS20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，P<0.05差異顯著，P<0.01差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 烏頭堿對(duì)小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞存活率影響

不同濃度烏頭堿處理HT22細(xì)胞6 h、12 h，MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率，烏頭堿抑制細(xì)胞生長(zhǎng)有時(shí)間-劑量依賴性。與對(duì)照組相比，50 μg/mL烏頭堿作用6 h對(duì)細(xì)胞存活率無影響，其余劑量和作用時(shí)間細(xì)胞存活率均極顯著降低(P<0.01)(圖1)。

與各自空白對(duì)照組相比，*P<0.05，**P<0.01 *P<0.05,**P<0.01,compared to the control group

2.2 烏頭堿對(duì)小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞核的影響

不同濃度烏頭堿的細(xì)胞染色后，熒光顯微鏡可見對(duì)照組細(xì)胞核為藍(lán)色，圓形或卵圓形，呈彌散均勻熒光；試驗(yàn)組細(xì)胞核有不同程度的致密濃染，部分呈顆粒狀、碎塊狀、邊集呈新月形(圖2)。

A.6 h，0 μg/mL；B.6 h，50 μg/mL；C.6 h，100 μg/mL；D.6 h，200 μg/mL；E.12 h，0 μg/mL；F.12 h，50 μg/mL；G.12 h，100 μg/mL；H.12 h，200 μg/mL

2.3 烏頭堿對(duì)小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率的影響

圖3中左下象限Q4代表正?；罴?xì)胞，Annexin V-FITC-/PI-；右下象限Q3代表早期凋亡細(xì)胞，Annexin V-FITC+/PI-；右上象限Q2代表壞死細(xì)胞或晚期凋亡細(xì)胞，Annexin V-FITC+/PI+；左上象限Q1代表細(xì)胞收集過程中出現(xiàn)的損傷細(xì)胞，V-FITC-/PI+。從圖3可以看出，用不同濃度(0、50、100、200 μg/mL)烏頭堿處理HT22細(xì)胞6 h或12 h后，在相同時(shí)間下，不同濃度烏頭堿處理組的正常細(xì)胞比例明顯下降，凋亡細(xì)胞比例顯著上升(P<0.05)；隨烏頭堿濃度的增加，凋亡的HT22細(xì)胞顯著增加，呈現(xiàn)明顯劑量-效應(yīng)關(guān)系(圖4)。

A.6 h，0 μg/mL；B.6 h，50 μg/mL；C.6 h，100 μg/mL；D.6 h，200 μg/mL；E.12 h，0 μg/mL；F.12 h，50 μg/mL；G.12 h，100 μg/mL；H.12 h，200 μg/mL

與各自空白對(duì)照組相比，*P<0.05，**P<0.01 *P<0.05,**P<0.01,compared to the control group

3 討論

烏頭堿可使中樞神經(jīng)系統(tǒng)及周圍神經(jīng)先興奮后麻痹，影響細(xì)胞內(nèi)離子和神經(jīng)遞質(zhì)的濃度，阻止沖動(dòng)的發(fā)生和傳導(dǎo)，從而損害細(xì)胞形態(tài)和功能[14]，造成呼吸困難、全身麻木、意識(shí)模糊、反應(yīng)遲鈍、陣發(fā)性抽搐等癥狀[15]。烏頭堿作用于心肌細(xì)胞，使心室內(nèi)異位起博點(diǎn)的興奮性增高和產(chǎn)生折返激動(dòng)，形成單源或多源多形室性早搏、室性心動(dòng)過速、心室顫動(dòng)等[11,16]。 烏頭堿也可引起細(xì)胞凋亡[17]。用烏頭堿給大鼠灌胃后，大鼠心肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞等均發(fā)生凋亡；細(xì)胞凋亡的典型變化包括細(xì)胞皺縮，DNA片段化，染色質(zhì)高度濃縮，細(xì)胞核內(nèi)縮、碎裂、形成新月形，細(xì)胞膜內(nèi)陷和線粒體分解等[18]。Annexin V/PI雙染法可用于檢測(cè)凋亡的細(xì)胞，Annexin V是Ca2+依賴性的磷脂結(jié)合蛋白，能夠與細(xì)胞凋亡時(shí)外翻至細(xì)胞膜外的磷脂酰絲氨酸(PS)結(jié)合，Annexin V標(biāo)記上FITC，可用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察；PI是一種依賴膜通透性的染料分子，通過FITC和PI的聯(lián)合使用，可有效檢測(cè)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

本研究用DNA特異性染料Hoechst 33258對(duì)HT22細(xì)胞進(jìn)行染色，熒光顯微鏡觀察HT22細(xì)胞核的形態(tài)學(xué)變化，結(jié)果顯示各處理組細(xì)胞核均有不同程度的致密濃染，核固縮、核碎裂、部分呈顆粒狀、碎塊狀、邊集呈新月形等凋亡細(xì)胞特征，不同濃度烏頭堿可引起HT22細(xì)胞發(fā)生凋亡。用Annexin V/PI處理HT22細(xì)胞不同時(shí)間后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，烏頭堿致HT22細(xì)胞凋亡呈明顯劑量-效應(yīng)關(guān)系，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，HT22細(xì)胞的凋亡率呈下降趨勢(shì)。烏頭堿可通過清除線粒體活性氧達(dá)到保護(hù)細(xì)胞的目的[13]，可能是烏頭堿致HT22細(xì)胞損傷過程中觸發(fā)了某種機(jī)制，如自噬、氧化應(yīng)激等，對(duì)細(xì)胞凋亡起到拮抗作用，逆轉(zhuǎn)了部分凋亡[19]。

烏頭堿可以引起HT22細(xì)胞凋亡，在HT22細(xì)胞凋亡中是否有自噬、壞死等及烏頭堿引起HT22細(xì)胞凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路還有待進(jìn)一步研究。