王 恒，王海萍，周美春，陳慧敏，周春翠，吉楊丹，劉 曦，臧貴勇

(1.黔南民族醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校，貴州 都勻 558013；2.黔南州婦幼保健院，貴州 都勻 558000；3.黔南民族醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校附屬醫(yī)院，貴州 都勻 558000)

痛風(fēng)是一種嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的代謝性疾病。其主要病因是由于長(zhǎng)期嘌呤代謝障礙，血尿酸增高，尿酸沉積在關(guān)節(jié)囊、滑膜等關(guān)節(jié)組織導(dǎo)致的急性炎癥反應(yīng)，引起組織損傷的臨床綜合征[1]。在痛風(fēng)發(fā)病過(guò)程中，白介素1-β、白介素6、腫瘤壞死因子-α作為主要的炎癥因子能激活下游的很多信號(hào)通路，在痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎炎癥反應(yīng)中起重要作用[2]。目前用于治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的藥物主要為秋水仙堿、苯溴馬隆、別嘌醇、糖皮質(zhì)激素等，但不良反應(yīng)很多[3]。民族民間中有許多治療痛風(fēng)臨床效果良好的藥方，但作用機(jī)制及安全性沒(méi)得到實(shí)證[4]。本課題擬以挖掘民族良方為目的，建立大鼠痛風(fēng)關(guān)節(jié)炎模型，以不同濃度水族抗痹癥方灌胃干預(yù)，觀察其是否具有治療痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 尿酸鈉購(gòu)自于Sigma公司，批號(hào)：BCCF5862；白介素1-β，批號(hào)：20201228、白介素6，批號(hào)：20201227、腫瘤壞死因子-α ELISA，批號(hào)：20201229試劑盒均購(gòu)自于北京誠(chéng)林生物公司；尿酸測(cè)定試劑盒，批號(hào)：202001025購(gòu)自于南京建成生物工程研究所有限公司。秋水仙堿片(規(guī)格：0.5 mg)購(gòu)于云南植物藥業(yè)有限公司。顯微鏡E200型(日本尼康)，酶標(biāo)儀MR-96A型(深圳邁瑞)等。

1.2 抗痹癥方的制備 由于該配方為保密方，故只列舉其中兩種藥材刺五加、雷公藤。按照其配方組成用53度白酒浸泡3個(gè)月以上所制成的酒劑。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 清潔級(jí)SD雌性大白鼠60只，體質(zhì)重(200±20)g，分籠飼養(yǎng)。隨機(jī)分為6組，即空白對(duì)照組，模型對(duì)照組，陽(yáng)性對(duì)照組(秋水仙堿，9 mg/kg)，抗痹癥方(5 ml/kg)、中(2.5 ml/kg)、低(1.25 ml/kg)劑量治療組，每組10只。

1.4 建模及灌胃 痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎建模：除空白對(duì)照組外，其他各組均用10%水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉，仰臥固定，用6號(hào)注射針右側(cè)踝關(guān)節(jié)后側(cè)從30～40°方向插入至跟腱內(nèi)側(cè)，將0.2 ml尿酸鈉溶液(50 mg/ml)注入關(guān)節(jié)腔內(nèi)?？瞻讓?duì)照組同樣采用6號(hào)注射針右側(cè)踝關(guān)節(jié)后側(cè)從30～40°方向插入至跟腱內(nèi)側(cè)，將0.2 ml生理鹽水注入關(guān)節(jié)腔內(nèi)。秋水仙堿治療組給予9 mg/kg秋水仙堿灌胃，水族抗痹癥方高、中、低劑量組分別給5、2.5、1.25 ml/kg劑量灌胃，空白對(duì)照組和模型給予蒸餾水20 ml/kg灌胃，1次/d，連續(xù)7 d。

1.5 指標(biāo)檢測(cè)

1.5.1 大鼠足踝關(guān)節(jié)腫脹率的測(cè)算 造模前1 h及造模后24 h、7 d后測(cè)量關(guān)節(jié)周徑，并計(jì)算腫脹率。腫脹率(%)=(造模后關(guān)節(jié)周徑-造模前關(guān)節(jié)周徑)/造模前關(guān)節(jié)周徑×100%。

1.5.2 大鼠血清中尿酸、白介素1-β、白介素6、腫瘤壞死因子-α的含量測(cè)定 末次給藥1 h后，股動(dòng)脈取血，靜置，離心，取上清液，在-20℃下保存待測(cè)。血清尿酸采用比色法，白介素1-β、白介素6、腫瘤壞死因子-α的含量采用ELISA法測(cè)定，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)分析采用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠足踝關(guān)節(jié)腫脹率及血清尿酸的結(jié)果 造模24 h，各組大鼠腫脹率未見(jiàn)明顯差異。與模型組比較，造模后7 d陽(yáng)性組、水族抗痹癥方中、高劑量組大鼠腫脹率明顯減輕(P<0.05)。與空白組比較，模型組大鼠血清尿酸含量明顯上升(P<0.05)；與模型組比較，陽(yáng)性組、水族抗痹癥方低、中、高劑量組大鼠血清尿酸含量明顯下降(P<0.05)。詳見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠足踝關(guān)節(jié)腫脹率及血清尿酸的比較

2.2 各組大鼠血清中白介素1-β、白介素6、腫瘤壞死因子-α含量測(cè)定的結(jié)果 與空白組比較，模型組大鼠血清中白介素1-β、白介素6、腫瘤壞死因子-α含量均明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，陽(yáng)性組、抗痹癥方高劑量組大鼠血清白介素1-β含量明顯下降(P<0.05)；陽(yáng)性組、抗痹癥方中、高劑量組大鼠血清白介素6含量明顯下降(P<0.05)；陽(yáng)性組、抗痹癥方低、中、高劑量組大鼠血清腫瘤壞死因子-α含量明顯下降(P<0.05)。詳見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠血清白介素1-β、白介素6、腫瘤壞死因子-α的比較

2.3 各組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜病理切片觀察的結(jié)果 見(jiàn)圖1，正常組(圖1A)關(guān)節(jié)滑膜結(jié)構(gòu)層次分明，細(xì)胞排列整齊，未見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組(圖1B)踝關(guān)節(jié)滑膜見(jiàn)明顯充血、水腫，滑膜可見(jiàn)大量淋巴細(xì)胞等炎細(xì)胞浸潤(rùn)，可見(jiàn)少許纖維細(xì)胞增生；與模型組相比，陽(yáng)性組、水藥抗痹癥方不同劑量組(圖1C、圖1D、圖1E、圖1F)大鼠關(guān)節(jié)滑膜充血、水腫情況有不同程度減輕，淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)情況相對(duì)減輕，未見(jiàn)纖維細(xì)胞增生；其中，陽(yáng)性組與高劑量組滑膜充血、水腫情況以及炎細(xì)胞浸潤(rùn)最輕。

圖1A正常組 圖1B模型組 圖1C陽(yáng)性組

圖1D低劑量組 圖1E中劑量組 圖1F高劑量組

3 討論

近年來(lái)，由于中國(guó)經(jīng)濟(jì)水平快速提升，群眾生活及飲食習(xí)慣發(fā)生了極大的改變，痛風(fēng)發(fā)病率亦相應(yīng)地上升[5]?；颊唧w內(nèi)尿酸升高，并且達(dá)到過(guò)飽和狀態(tài)時(shí)，會(huì)以結(jié)晶形式析出并沉積在關(guān)節(jié)腔內(nèi)，導(dǎo)致痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)作。炎癥因子在痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病、發(fā)展過(guò)程中起到重要作用[6]。痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)液中存在大量的單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞，吞噬尿酸結(jié)晶時(shí)會(huì)釋放大量白介素1-β與腫瘤壞死因子-α等細(xì)胞因子，可增加前列腺素類(lèi)物質(zhì)的合成而產(chǎn)生疼痛性感覺(jué)，并進(jìn)一步激活環(huán)氧化酶使炎癥擴(kuò)大[7-8]。其中，IL-1β可以與受體結(jié)合，使滑膜細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子如IL-6等，加速了炎細(xì)胞在尿酸鹽沉積關(guān)節(jié)周?chē)?rùn)[9]。IL-6是具有多種功能的炎性細(xì)胞因子，在痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎炎癥反應(yīng)中關(guān)鍵成分。在痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎急性期IL-6呈明顯高表達(dá)，并且與病情活動(dòng)性呈正相關(guān)，它不僅能增加滑膜炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，還在反復(fù)發(fā)病中起到促進(jìn)軟骨細(xì)胞凋亡的作用[10]。

通過(guò)大鼠踝關(guān)節(jié)局部注射尿酸鹽晶體混懸液復(fù)制急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型，已經(jīng)被證實(shí)具有操作簡(jiǎn)便，可控性高，重復(fù)性好的優(yōu)勢(shì)，目前應(yīng)用最多[11]。梁莎等[12]報(bào)道該方法造模后大鼠病理切片顯示關(guān)節(jié)腔內(nèi)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，以及出現(xiàn)關(guān)節(jié)滑膜水腫等變化，與本實(shí)驗(yàn)造模后模型組大鼠病理表現(xiàn)一致。而且本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M大鼠血清中白介素1-β、白介素6、腫瘤壞死因子-α含量均不同程度升高，造模后24 h內(nèi)大鼠踝關(guān)節(jié)出現(xiàn)明顯腫脹、皮膚發(fā)紅，功能障礙等急性炎癥表現(xiàn)，表明大鼠痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型復(fù)制成功。本實(shí)驗(yàn)造模24 h，各注射組大鼠腫脹度未見(jiàn)明顯差異。造模后7 d后，陽(yáng)性組、水族抗痹癥方中、高劑量組大鼠與模型組比較腫脹度明顯減輕(P<0.05)。與空白組比較，模型組大鼠血清中尿酸、白介素1-β、白介素6、腫瘤壞死因子-α含量均明顯升高(P<0.05)。與模型組比較，陽(yáng)性組、抗痹癥方高劑量組大鼠血清白介素1-β含量明顯下降(P<0.05)；陽(yáng)性組、抗痹癥方中、高劑量組大鼠血清白介素6含量明顯下降(P<0.05)；陽(yáng)性組、水族抗痹癥方低、中、高劑量組大鼠血清尿酸、腫瘤壞死因子-α含量明顯下降(P<0.05)。踝關(guān)節(jié)鏡下病理觀察可見(jiàn)，與模型組相比，陽(yáng)性組、水藥抗痹癥方不同劑量組(圖1C、圖1D、圖1E、圖1F)大鼠關(guān)節(jié)滑膜充血、水腫情況有不同程度減輕，淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)情況相對(duì)減輕，未見(jiàn)纖維細(xì)胞增生；其中，陽(yáng)性組與高劑量組滑膜充血、水腫情況以及炎細(xì)胞浸潤(rùn)最輕。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)抗痹癥方不同劑量組均可降低痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)腫脹情況，還可通過(guò)降低血清中尿酸、白介素1-β、白介素6、腫瘤壞死因子-α含量的作用，減輕關(guān)節(jié)滑膜炎癥反應(yīng)。水藥抗痹癥方在大鼠痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎癥狀和炎癥因子方面效果顯著，值得繼續(xù)深入研究。

由于本方提供者不愿意公開(kāi)藥方組成，因此沒(méi)有對(duì)組方特點(diǎn)進(jìn)行分析，本組方中的中藥材需要制成酒劑或者酊劑才能發(fā)揮療效，本實(shí)驗(yàn)所用劑量換算成人用量每天40、20、10 ml，課題組前期已做了其急性毒性實(shí)驗(yàn)[13]，此劑量在安全范圍內(nèi)。本實(shí)驗(yàn)亦證實(shí)該方具有降低血清尿酸的效果，為今后民族方藥開(kāi)發(fā)與利用奠定了理論基礎(chǔ)。